（发酵工程专业论文）l组氨酸产生菌的选育及其发酵条件优化.pdf

摘要 中文摘要 本文以谷氨酸棒杆菌a j 8 8 为出发菌株，对l 组氨酸的发酵法生产进行了研究。主要 内容及结果如下： 1 ) 以组氨酸的茚三酮显色和p a u l y 特征显色为根据，结合纸层析法，确定利用p a u l y 显色和茚三酮显色相结合对发酵液中的l 组氨酸进行定性分析，采用点样纸层析茚三酮显 色后洗脱再比色来定量测定发酵液中的l 组氨酸，茚三酮显色洗脱液最佳吸收波长为5 l o m n ，最佳洗脱时问为3 0 m i n ，当点样组氨酸含量在2 “g 1 2 陷范围内时呈现较好的线性。 2 ) 对出发菌用d e s 和n t g 逐级诱变处理，采用8 一氮乌嘌呤( 8 a g ) ，2 ，6 二氯瞟呤 ( d c p ) ，硫唑嘌呤( s p ) ，2 一硫尿嘧啶( 2 一t u ) ，氨基三氮唑( a m t ) 以及1 ，2 ，4 一= _ _ 三唑丙氨酸( t r a ) 作为抗性药物进行选育，并使菌株带上组氨酸酶缺陷型标记，最终获得一株能够较多积累 l 一组氨酸的菌株h z 5 0 1 3 ( 耵淤”：a m t 8 ，s t i d a s e ，d c p r ，2 t u 8 ) 。在以葡萄糖为碳源、硫酸 铵为氮源的培养基中发酵3 d ，产酸可达4 6 3 鲫。，比出发菌株产酸提高了近2 倍。 3 ) 对菌株h z 5 0 1 3 进行了培养基和发酵条件的优化。得到最佳的种子培养基为( l ) ： 葡萄糖2 5 ，( n h 4 ) 2 s 0 41 0 ，玉米浆2 5 ，k h 2 p 0 41 5 ，m g s 0 4 - 7 h 2 01 ，c a c 0 3 2 0 ，v h1 0 蚓l ； 最佳发酵培养基为( l ) ：葡萄糖8 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 43 1 ，玉米浆5 ，k h 2 p 0 4 1 3 ，m g s 0 4 7 h 2 0 o 5 ，c a c 0 32 0 。v h5 “妒。；摇瓶发酵最佳培养条件为：培养基初始p h 7 o ，接种量8 ，装 液量为1 5 m l 2 5 0 m l 摇瓶或2 0 m l 5 0 0 m l 摇瓶，往复式摇床3 0 l 培养，摇床转速1 0 0 次m i n ，发酵周期7 2 h 。优化后最终产酸可达5 5 l 。 4 ) 考察了添加氨基酸、有机酸、维生素、各种营养源等以及改变培养手段对l 一组氨 酸代谢的影响。实验发现添加0 1 9 ，ll 亮氨酸、l 异亮氨酸和l 一脯氨酸时，产酸有所提高。 添加其它氨基酸均使产酸有所下降。添加丙酮酸、草酸、乙酸能使产酸明显有所提高，添 加琥珀酸、苹果酸、富马酸使产酸有所下降。添加各种维生素对l 组氨酸产量的影响很小， 少量添加产酸略高。添加蛋白胨、牛肉膏和酵母膏会导致产酸降低，而添加豆饼水解液对 产酸有一定的促进作用。在培养基中添加表面活性剂吐温8 0 和稳定剂植酸钠均会抑制菌 体生长并导致产酸下降。流加葡萄糖和氨水产酸均优于不流加时的产酸。 关键词：l 组氨酸，诱变育种，发酵，谷氨酸棒杆菌，条件优化 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t 1 1 ep r o d u c t i o no fl l l i s t i d i n eb yf e m l e n t a t i o nu s i n gc b 秽行p 6 d c 地r f “m “，“m f c “ma j 8 8a s ap a r e n ts t r a i nh a sb e e ns t u d i e di nt 1 1 i sd i s s e r t a t i o n i t sc o n t e n t sa 1 1 dr e s u i t sa r ea sf 0 1 1 0 w s ： 1 ) b a s e do n p a u l ya n dn i i l l l y d r i n r e a c t i o no fl h i s t i d i n e ， c o m b i n e dw i t hp a p e r c h j o m a t o g f a p h y ，am e t h o df o rd e t e r i l l i l l i n gl h i s t i d i n ei n 凫r n l e n t a t i o nb r o 吐1w a se s t a b l i s h e d p a u l ya 1 1 dn i l l l l y d r i nr e a c t i o nw e r eu s e df o rq u a l i t a t i v ed e t e r n l i n a t i o no 儿h i s t i d i n e ，c o l o r i m e 仃y o fe l u t i o na r e rp a p e rc h r o m a t o g r a p h ya i l dn j n h y 如nr e a c t i o nw a su s c df o rq u a n m a t i v e d e t e 丌n i n a t i o no fl h i s t i d i n c t h eo p t i m u l t lc o n d i t i 9 n so fq u 姐t i t a t i v ed e t e 珊i n a t i o nw e r ea s f o l l a w s ：c 0 1 0 r i m 曲了w a v e l e n g m5 1 0 m ，e l u t i o n t i m e3 0 m i n ，l i n e a rr a n g e 2 肛g 1 2 p g 2 ) t h ep a r e n ts t r a i nw a st r e a t e db yd i e t h y ls u i f a t e ( d e s ) a n dn - m e 血y 1 一n - n i t r o n n i t r o s o g u a l l i d i n e ( n t g ) 8 一a z a g u a l l i n e ( 8 一a g ) ，l ，6 一d i c l o r o p u r i n e ( d c p ) ，s u l f ，i z o l e p u r i n e ( s p ) ， 2 - t h i o u r a c 鲥( 2 一t u ) ，3 一a m i n o l ，2 ，4 一t r i a z o l e ( a m t ) ，1 ，2 ，4 一t f i a z o l e a 】a n i n e ( t r a ) w e r eu s e da s a n a l o g s ，t h ep r o d u c i n gs t r a i nw a sa l s om a r k e db yh i s t i d a s e as 缸缸nh z 5 0 1 3 ( t r a “，a m t “， l l i s t i d a s e，d c p k ，2 t u k ) t h a tc o u l da c c u l n u l a t e4 6 3 ll _ h i s t i d i n ew a sa c q u i r e d i tp r o d u c e d l _ h i s t i d i n et h i et i m e sa sm ep a r e ms t m i ni nm e d i u mu s i n gg l u c o s ea sc a r b o ns o u r c ea 工l d ，猢o n i as u j p h a t ea sn i t r o 曲ns o l l r c e 3 ) t h eo p t i m i z a t i o no fm e d i l l lc o n t e n t sa 1 1 df e 订n e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rh z 5 0 1 3w a s c o n d u c t e d t h eo p t i m u ms e e dm e d i u mc o n t a i n s9 1 u c o s e2 5g l ，( n h 4 ) 2 s 0 41 0 l ，c o ms t e 印 l i q u o r2 5 l ，k h 2 p 0 41 5 9 l ，c a c 0 32 0 l ，m g s 0 4 7 h 2 01 9 ，l ，v hl o 心lt h eo 州m m f e m l e n t a t i o nm e d i 呦c o n t a i l l s9 1 u c o s e8 0 9 尼，( n h 4 ) 2 s 0 431 l ，c o ms t e 印1 i q u o r5 9 l ， k h 2 p 0 41 3 9 l ，c a c 0 32 0 9 ，l ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 l ，v h5 “g l t h eo p t i m 啪f e h n e m a t i o n c o n d i t j o n sw e r e2 5 0 m lc o m a i n s1 5 m lb m mo r5 0 0 m lc o n t a i n s2 0 m lb m t l l ，o r i 百n a lp h 7 o ， c l l l t u r i n g a t3 0 1 o nr e c i p m c a 痂瞎s h a k e r ，s h a k i n gs p e e d1 0 0 r p m ，s e e dv o l u i l l e 8 ， f e 衄e n t a t i o nt i m e7 2 h a f t e ro p t i m i 2 a t i o n ，t l l ep r o d u c t i o no f l 城s t i d i n ew a su pt o5 5 9 l 4 ) t h ee 丘t so fv 盯i o u ss u b s t 锄c e so nl - 埘s t i d i n ep r o d u c t i o nh a db e e ni n v e s t j g a t e d i m p r o v e m e n t sw e r eo b s e n r e dw h e no 1 ll l e u ，l i l ea n dl p r ow e r ea d d e di nm e d i 啪 a d d i t i o no f o t h c ra i l l i n oa c i d sm a d ed e c r e a s e si nt h ep r o d u c t i o no f l - h i s t i d i n e p y n i v a t e ，o x a l a t e ， 觚e t a t ec o u l de 1 1 1 1 a n c em el i h i s t i d i n ep r o d l l c t i o nw 1 1 i l es u c c i n a t e ，m a l a t e ，如m a m t el l a dr e v e r s e e 位c t s t a m i n sd i d i l ta 毹c tm ep r o d u c t i o no fl k s t i d i n ea p p a r e n t i y l o w e rp r o d u c t i o no f l 城s t i d i n ew 船f o l l n df 0 1 l o 咖gt h ea d d i t i o no f p e p t o n e ，b e e f e x t r a c t ，y e a s te x n a c t b yc o n t r 吼 嘴帅“、m o 碍l 一 i s 主d i n ew a sp r o d u c e da n e ra d d i t i o no fs o y b e a np r o t e i nh y d r o l a z a t e t 、v e e n8 0 ，s o d i 岫 p l l y t a t ei n h j b i t e dt h l e 铲o w t ho fc e l l sa n di 1 1 d u c e dd e c r e a s e si f lt h ep m d u c t i o no fl - h i s t i d 硫t h e p m d u c t i o no fl l l i s t i d i n ew a s b e t t e rw h e n g l u c o s ea i l da m m o n i aw e r ef l o w e d k e yw o r d s ：l - h i s t i d 血e ，m u t a g e n e s i sb r e e d i n 舀f e n n e n 枷o n ，c o ，y 门e 6 口c 耙r i “衄加耙“珊， o d t i 嘶z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：j 豆4 髦肇日期：加巧年r 月；胡 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南 大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档 的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 鲐伍鳖翩躲瑟塑虱 日期：妒莎年，月；口日 第一章绪论 第一章绪论 1 1l 一组氨酸的理化性质 l 一组氨酸( l 1 - i i s t j d i n e ) 是含咪哗核的碱性氨基酸，其化学名为l o 一氨基b 咪唑丙 酸 2 一a m i n o 一3 一( 4 - i m j d a z 0 1 y 1 ) p r o p i o n j ca c i d l ，于1 8 9 6 年首次发现。l 。一组氨酸分子式为 c 6 h 9 n 3 0 2 ，相划分子质量为1 5 5l5 ，其结构式如下： h o h l 一组氨酸通常为单斜品系、叶j 状t 诮体( 臼水中) 、密度为i 4 4 6 9 怒m 3 ，呈苦味( 阂值 2 0 m 1 0 0 n 1 l ) ；溶于水( 4 3 9 1 0 0 m l ，2 5 ) ，极难溶于乙醇，不溶于乙醚。l 氨酸的比 旋光度为m i ) o = + 。 + 1 3 。( 溶于6 m o l lh c l 中) ，不同基团在2 5 时的解离常数为 p k c 0 0 h = 1 8 2 ；p kn 3 + = 9 1 7 ；p k h = 6 o o ；p i = 7 5 9 。l 一组氨酸在弱碱性条件下可与重氮苯磺 酸反应生成橘红色偶氮化合物。 1 2l 一组氨酸的功能及应用 l 一组氨酸是蛋白质结构的组成部分，参与人体内蛋白质的合成。同时，它还以多种形 式广泛参与机体的各种生理生化过程，其中包括组成多种生理生化成分，清除细胞内氧化 物和参与免疫调节等。因此，l 组氨酸在人体营养中有重要的作用1 2 】，常用来作为营养补 充剂或要素膳的成分。 由于成人体内可以将普通的中问代谢物合成组氨酸，因此组氨酸直被认为是一种非 必需氨基酸。然而，随着深入的研究，人们发现婴儿体内组氨酸的合成量是不能满足机体 正常生长，即使是成人，如果不从食物- t p 补充组氨酸，体内合成的组氨酸是不能满足需要 的。当组氨酸缺乏时，会表现出：负氮平衡；血清白蛋白下降；血浆和肌肉中游离 组氨酸下降：血红蛋白下降：血细胞比溶下降；肌肉中肽肌含量下降：全血中铜 和锌含量降低：血清铁升高等症状。补充组氨酸后，上述症状得到缓解或消除。因此， 为了保证机体的正常功能，必需每日从食物中摄入一定量的组氨酸。对于猪和鸡，组氨酸 已经被列为必需氨基酸1 3j 。在使用上，除传统的营养强化剂和饲料添加剂外，组氨酸越来 越多地应用于医药行业，主要用于氨基酸输液及综合氨基酸制剂。 组氨酸是2 0 种氨基酸中唯一在生理p h 下具有缓冲能力的氨基酸，其咪唑基的p k i 。 为6 o ，在p h 7 o 处有显著的缓冲能力，其在血红蛋白的组成中具有非常重要的意义 4 】。慢 性尿毒症患者的饮食中加入少量组氨酸后，氨基酸结合进入血红蛋白的速度增加，肾原性 贫血减轻，所以组氨酸是尿毒症患者的必需氨基酸。 江南火学硕士学位论文 组氨酸能降低胃液酸度，而且组氨酸是自由基的有效清除剂，具有预防和减轻肠粘膜 损伤的作用，因而能缓和肠胃手术时的疼痛，减轻妊娠期呕吐及胃部灼烧感，抑制由植物 神经紧张而引起的消化道溃疡，在临床上，组氨酸对胃溃疡及十二指肠溃疡也具有相当 好的疗效。 组氨酸对过敏性疾病如哮喘等也有疗效。此外，组氨酸脱羧形成组胺，组胺是一种强 烈的血管舒张物质，可扩张血管，降低血压，因而常用于心绞痛、心功能不全等疾病的治 疗。组胺还有刺激胃黏膜分泌胃蛋白酶和胃酸的作用，在神经组织中它还是种感觉神经 传递物质，与外周神经的感觉与传递有密切关系1 5 j 。 组氨酸还可促进烧伤组织的痊愈；此外，组氨酸还具有减轻放射性损伤、阻止血红蛋 白和白蛋白下降等功效。组氨酸还是心脏循环器官药品的生产原料1 6 j 。其脱氨产物尿刊酸 具有防晒功效，可用于化妆品。 1 9 8 3 年s l o d e k 等用实验表明，组氨酸缺乏会使动物胸腺、脾脏萎缩，在同等剂量下， 组氨酸有与具有吞噬作用的激素同等强度的吞噬作用；g e r b e r 报道，因为组氨酸是自由基 的有效清除剂，所以组氨酸对风湿性关节炎有很好的疗效，根据有关研究报道显示，许多 患有风湿性关节炎的患者，其组氨酸含量比一般人低，补充适量组氨酸后，可以改善风湿 性关节炎症状。 组氨酸的咪唑基能与f e ”或其它金属离子形成配位化合物，促进钙和铁的吸收，因而 可用于防治骨质疏松，维生素d 缺乏症和治疗贫血，日常适当服用能促进人体生长发育。 组氨酸还与生物钟有关。据日经产业新闻报道，生物钟控制生理活动以2 4 h 为周 期，无论人类还是特殊的细胞这一点都是相同的。日本理化研究所和名古屋大学研究人员 以带有生物钟的最原始单细胞光合蓝色细菌为对象，利用兵库县大型放射线设施“s p r i n 2 8 ” 分析它的生物钟中起钟摆作用的三类蛋白质中的一种。结果发现，这种蛋白质呈凹镜状， 凹陷部分连接其它的生物钟蛋白质发挥作用，在凹陷中心附近发现有l 组氨酸存在并起到 了关键作用，换成其它氨基酸，生物钟就会停止工作。 组氨酸混合葡萄糖、果糖、麦芽糖等物质后，再加入体积是混合物1 0 0 5 0 0 倍的水和 乙醇混合液，于6 0 2 5 0 下进行加热反应可生成咖啡香味的物质。该物质添加在果子露、 酸乳酪等饮料或糖果中可增添咖啡香味【l 】。 总之，l 组氨酸能够广泛地应用于医疗、食品和饲料行业。目前，组氨酸越来越多地 运用于医药行业，主要是氨基酸输液及综合氨基酸制剂，还用于消化道溃疡药及心脏循环 器官医药品的生产原料等。 1 3l 一组氨酸的制备方法 目前，l 一组氨酸的制备方法有化学合成法、蛋白质水解提取法和微生物发酵法等。 1 3 1 化学合成法 关于组氨酸的化学合成，有不少人进行了研究。其中r w e i d e l l h a g e n 和r h 猢锄 利用二羟基丙酮、甲醛和氨首先合成羟甲基咪唑，再由它进一步合成组氨酸成为主流思路。 例如：n fa l b e r t s o n 和s a r c h e r 由羟甲基咪唑氯化生成氯甲基咪唑，它再与二乙基乙酰 第一章绪沦 丙二酸( d a m ) 缩合h 】可生成组氨酸，此法当时得到普遍应用。然而此法因产率低，很难 用于实际生产。于是，k a z u om a t s u n l o t o 等人进行了改进，其首先将羟甲基咪唑酰基化生 成酰甲熬咪唑，再用它与d a m 缩合，之后再与盐酸反应即可生成组氨酸。改进后产率大 大提高，提高了合成法的实用性哺j 。 然而，化学合成法所得到的为i ) l 组氨酸，要制备l 组氨酸还需用结晶法或酶法进行 拆分，因而化学合成法制铬l 组氨酸的成本较高，实际应用不多。 1 3 2 蛋白质水解提取法 由于天然蛋白质i = _ 】所含氨基酸均为l 型氨基酸，那么将蛋白质彻底水解即可从中提取 得到l 组氨酸。最初，囡内外均采用蛋白质水解提取法来生产l 一组氨酸。 常用于水解法“：氨瑟酸的天然蛋白质有m i 粉、角蹄、丝胶、玉米数质粉、棉籽饼和 鸡毛等。其中m 粉一h 氨酸含量最高，所以m 粉是水解提取法生产l 组氨酸的主要原料。 目前，国内l 一纽氨酸的生，。二i j 要是从猪m 粉水解液中提取。其方法是将猪血粉加热、酸水 解，i _ i 和后过滤除酪氨酸，用盐酸渊p i t i 肝上； ；联的阳离予树脂，再用蒸馏水洗涤至p i 5 6 ，之后用o0 5 m o i l 氨水洗脱，收集p h 6 ，8 9 - 5 的沈脱液绑分。 虽然蛋白质水解提取法生产l 。一组氨酸的：l ：艺比较成熟、成本比较低，但是也存在着许 多问题。具体表现在：水解损失率蕊。咖粉水解时，l 一组氨酸损失3 0 左右：水解设 备腐蚀j m 重，影响生产；造成环境污染；单一提取l 一组氨酸，浪费其它氨基酸资源。 因而，发酵工业迅速发展的时期，许多研究者将目光投向了生物合成即发酵法生产l 一组氨 酸。 1 3 3 生物合成( 发酵) 法 发酵法又可分为问接发酵法和直接发酵法。 1 3 3 1 间接发酵法 i 扫于l 一组氨酸合成途径复杂且受到终产物的严格反馈谢节，直接生产菌株的筛选非常 困难，因此l 组氨酸发酵法早期主要是研究两步法的策略，即利用组氨酸缺陷型菌株生产 l 一组氨酸的前体物l 一组氨醇，再由酶法转化为l 一组氨簸1 9 】。k k u b o t a 等人曾进行了两步 法发酵生产l 一组氨酸的研究。他们利用黄色短杆菌( b 憎v f 6 口c f p r 胁m 肪v “川) 的组氨酸营养 缺陷型菌株来发酵生成l 一组氨醇，然后再通过微生物将其转化为l 一组氨酸l l 。此法随着 直接发酵法生产l 一组氨酸的出现而被淘汰。 1 3 3 2 直接发酵法 目前报道的可用于直接发酵法生产l 组氨酸的菌种有鼠伤寒沙门氏菌( 黝砌o ”e ，肠 c v p h i m “r 沌m ) ，大歌轩菌t e s 曲e r i c h 泌c o i ) ，猹章劳弛轩菌( b z i ss h 8 s ) ，谷氢酸铎 杆菌( c o r e 6 臼c ，p ，胁m 譬f “泐”f c “) ，天蓝色链霉菌( & m p ，d ，w p s e 阮o f o r ) j ，粘质沙 雷氏菌( & ，m 踟黜口靶g 珊) 和黄色短杆菌( 肌订6 口f 据，f 姗加v 姗) 等。 由于l 组氨酸是其所在代谢支路的终产物，所以用一般选育营养缺陷型的方法来积累 像l 组氨酸这样的非分支途径氨基酸是不行的。因此，大多数研究者均采用结构类似物 抗性来解除l 组氨酸合成途径上的反馈作用，增大l 组氨酸方向的代谢流。表1 1 是所报 道的一些选育l 组氨酸产生菌时所使用的结构类似物。3 1 。 江南大学坝士学位论文 表1 一l 选育卜组氨酸产生菌时所使用的一些结构类似物 t a b l el - 1a n a i o g su s e di nt h es c r e e n j 皿go rl - h i s t i d i n ep r o d u c i n gs t 髓i n s k a z u m ia r a k i 等人对直接发酵法生产l 组氨酸进行了系统深入的研究，并使其实现了 工业化。该研究小组以谷氨酸棒杆菌为出发菌，依次赋予其t r a 、6 一m p 、8 a g 、4 一t u 和 6 一m e p 抗性，最终产酸为1 5 l 。经过进1 步菌种改造和条件优化，工业化产酸达 2 0 3 0 l “。 发酵法所得的含有l 一组氨酸的发酵液经过加热、调p h 、絮凝，再进行离心、过滤和 压滤，使产物与菌体分离，得到含有l 组氨酸的上清液。上清液再经过脱色、离子交换、 超滤、结晶、干燥即可得到成品l 组氨酸。 发酵法克服了蛋白质水解提取法所存在的缺点，工艺简单、污染小、只要后期提取精 制方法得当，收率相当高，因而很具发展前景。然而，现阶段直接发酵法生产l 一组氨酸仍 存在着产酸率偏低、成本较高的问题，所以选育能大量积累l 一组氨酸的产生菌就显得尤为 重要。 1 4 生物技术制备l 一组氨酸的研究概况 国内主要是从猪血粉水解液中提取来生产l 组氨酸，对于生物技术制各l 组氨酸的研 究起步比较晚。 曾莹等以黄色短杆菌为出发菌株采用紫外线诱变，选育到一株产l 一组氨酸的突变菌 株，在含有1 5 0 9 l 葡萄糖、3 5 叽硫酸铵、1 0 9 ，l 蛋白胨的发酵培养基中培养7 2 h ，产l 一 组氨酸1 2 8 2 8 m g l 【1 4 】。 顾正华，张伟国以谷氨酸棒杆菌为出发菌株采用硫酸二乙酯( d e s ) 和亚硝基胍( n t g ) 诱变，筛选d h 、6 a u 抗性，并以l 一组氨酸为惟一氮源定向筛选，得到一株l 组氨酸产 生菌h - 2 4 。在含有1 5 0 9 l 葡萄糖、3 5 l 硫酸铵、1 0 m l l 玉米浆的发酵培养基中培养7 2 h ， 产l 一组氨酸1 6 9 时”。 许益清，张伟国以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，利用硫酸二乙酯和亚硝酸选育a m t 和 h e 抗性突变株，并选育出能在d 一葡糖糖酸基本培养基上生长的突变株，发酵三天产l 组 氨酸达1 1 6 9 l 。 史楠等以谷氨酸棒杆菌t q 2 2 2 3 ( p h e 一+ t y r 一+ 5 m t 2 + s g 8 + 5 一f t r + c i n 8 ) 为出发菌株，经 硫酸二乙酯诱变处理，定向选育出5 m t 、s g 、5 一f t 、8 一a g 、6 m p 、2 t a 抗性菌株t l l l 0 5 。 在含有1 5 0 l 葡萄糖、3 5 l 硫酸铵的发酵培养基中，可产l 一组氨酸1 2 0 2 l 。在5 l 发 第一章绪论 酵罐发酵6 0 h ，l 组氨酸产量达1 48 l 。 国外很早就通过选育特定的微生物，利用发酵法来生产l 组氨酸。i - i 本在这方而的研 究非常出色。从1 9 7 0 年丌始，| _ i 本边制药、协和发酵等儿家大公司下属研究所人员开 始以黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、粘质赛氏杆菌等菌株出发，诱导药物抗性株，开发l 组氨酸的直接发酵法，其产酸水平分别为15 4 9 l 、1 2 5 l 和17o g l ，糖酸转化率为15 4 、 1 25 、1 0 o 【”。 1 9 7 3 年，村田荒木和清志中山用皿硝基胍对谷氨酸棒斗1 菌a t c c l3 7 6 1 进行诱变处理， 得到1 ，2 ，4 三唑丙氨酸和2 一噻雌丙氨酸抗性突变株ky - 1 0 2 6 0 ，在含有1 5 0 9 l 糖蜜和4 5 9 ，l 硫酸铵的培养基中发酵，得到l 一组氨酸的产率为6 8 2 l 。 1 9 7 4 年，村f ：i _ | 荒木_ _ f 【| 清志c ：| _ r j l j 对ky - 1 0 2 6 0 再次诱变，得到了i 嗓呤、嘧啶结构类似物 抗性突变株，使得l 组氩酸的产率提高到15 卫l = i ! 右旧。 1 9 7 7 年，m a s a l l i k ok is u f l l i 等，利用粘质沙雷菌筛选组氨酸酶缺陷型菌株再通过选 育结构类似物的抗性突变株1 1 r 2 6 4 0 ，使得i 。组氨酸的产率达到17 i 。 随着基因技术的飞速发展人们开始利月掳凶：j 程进行菌株改造，大幅度提高目的产： 物的产量。从1 9 8 0 年起，很多研究人员开始用基因技术来研究各种菌株负责合成i 。一组氨 酸的基因，；段并应用基心：i - = 程来选育l 。一纽氨酸产生菌。 c d e l o m e 等人深入研究了乳酸乳杆菌亚种的组氨酸合成基因。他们克隆了乳酸乳杆 菌亚神的组氨酸合成基因，并通过对大肠杆菌( ef o f j ) 和枯草芽胞杆菌( 口5 “6 f j 凰) 突 变株的基因互补和d n a 测序确定了这些基因的特征。通过与ec o ，f 的h i s a ，h i s b ，h i s c ， h i s d ，h j s f ，h i s g ，h j s l e 基因和口口c 肼埘s “6 ，加的h i s h 基因( 与ec o ，fh i s c 基因等价) 的互 补对乳杆菌的等效基因进行了准确定位。经过对乳杆菌的1 1 5 k b 的等效基因进行核苷酸序 列分析揭示了1 4 个o r f s ，其中有1 2 个可能同属一个操纵子。这个假定的操纵子包含8 个负责编码组氨酸合成途径的酶的0 r f s 。它还含有一个编码h i s t i d y l 一t r n a 合酶的o r f 和编码3 1 一氨基糖苷磷酸转移酶的0 r f i l 。 川岛以枯草杆菌k 的l 组氨酸生产菌a 儿2 1 1l ( t r a “，f t 8 ) d n a 供体菌进行克隆， 获得了枯草杆菌m ( h 刚) 互补质粒p a h 3 。从p a h 3 切下包含h i s j 的基因片段插入枯草 杆菌k 的载体p u t 3 2 ( c m 8 ，k m 8 ) 后导入a j l 2 1 1 1 ，组氨酸产率从6 3 l 提高到8 8 9 ，l 。 a j l 2 1 1 1 的磷酸核糖a t p 焦磷酸化酶已对l 组氨酸脱敏，质粒的导入则是强化了h i s j 即 l 一组氨酸脱氢酶，从而使l 组氨酸产率提高1 2 “。 水上等利用大肠杆菌k 1 2 和谷氨酸棒杆菌的穿梭质粒，构建了包括大肠杆菌k 】2h i s g d ，c ，b 的重组质粒，并用该质粒以互补实验从谷氨酸棒杆菌的组氨酸缺陷株中获得了h i s g 一株。以此h i s g 一株为宿主，以野生型谷氨酸棒杆菌为d n a 供体菌克隆h i s g ，构建了p c h i s g 。 为解除组氨酸对a t p 磷酸核糖基转移酶的反馈抑制，又从p c h i s g 筛选得到了l ，2 ，4 一三唑 丙氨酸抗性质粒p c h i s g l ”，将其导入l 一组氨酸生产菌株后，l 组氨酸产量从7 6 l 提高 到1 5 3 2 几 2 1 。 仓桥修等用亚硝基胍诱变，从枯草芽孢杆菌中筛选到l 一组氨酸产生菌a 儿1 7 3 3 ( f e r m p 6 2 4 6 ) 。在b a c t p e n a s s a y 培养液中培养至对数生长期，提取d n a 。再用亚硝基 江南大学硕：l ：学位论文 呱将a j 7 3 3 诱变得到l 组氨酸缺陷型菌株a j l l 7 3 2 ( f e r m p 6 2 4 5 ) 。将a j l l 7 3 2 菌株接 种于p e n a s s a y 培养液中3 7 培养过夜，转接后，3 7 再培养4 h 。再次转接后，3 7 培养 1 ，5 h ，调制成具有吸收d n a 能力的细胞。在细胞悬浊液中加入获得的d n a 溶液，培养得 到l 一组氨酸产生菌a j i l 7 3 4 。再从a j l l 7 3 4 中提取带有l 一组氨酸合成及l 一组氨酸拮抗体 耐性的遗传基因，按行质转换法插入原菌株a j l l 7 3 3 中，得到新型l 组氨酸产生菌 a j l l 7 3 5 ，产酸从l lg l 提高到2 3 l i “j 。 s u g i u mm a s a k i 等人在一个质粒载体m i n i f 上构建了两个杂交质粒。这两个质粒携带 着& r 阳，曲m 口陀p s c p ”s 菌株发生了等位基因突变的h i s 操纵子。一个质粒p s s 5 0 3 携带有 4 7 k be c o ri 片段，具有h i s 操纵予的起始部分，另一个质粒p s h 3 6 8 携带有1 2 k be c o ri b a m h1 片段，具有整个h i s 操纵子。与不带质粒的宿主菌l 1 2 0 相比，两个质粒都能使 a t p 一磷酸核糖转移酶( h i s g 编码) ，组氨醇脱氢酶( h i s d 编码) 和组氨醇磷酸磷酸化酶( h i s b 编 码) 的活性增加2 倍。这株& m ，胁m 口憎邸f p 瑚的组氨酸产生菌l l2 0 菌株无论携带p s s 5 0 3 或p s h 3 6 8 质粒都能产4 2 l 的l 一组氨酸，该产量比不带质粒的菌株l 1 2 0 提高了约5 0 【2 3 】。 1 5 研究意义及内容 l 一组氨酸所具备的各种功能使其可以广泛应用在食品、保健品、饲料、化工及医药等 领域。目前，l 组氨酸主要应用于氨基酸输液。氨基酸输液已成为中国医疗最常用的药物 之一，用量逐年递增，1 9 9 8 年氨基酸输液年产量已达到8 0 0 0 多万瓶，品种已发展到2 0 个， 生产厂家也由1 9 8 9 年的8 家发展到目前的8 0 多家，应用范围从营养支持剂发展到治疗肝 病、肾病、抗感染及儿童用输液等：中国药用氨基酸输液原料生产厂家已经发展到4 0 多 家，年产量已由1 9 9 4 年的6 0 0 多吨增长到4 0 0 0 多吨；氨基酸口服制剂也有很大发展。这 些发展促进了氨基酸市场的不断发展。而l 一组氨酸正是我国急需投产的几种瓶颈氨基酸之 一。目前，国内的输液用l 组氨酸主要依靠进口，因而筛选能够大量积累l 一组氨酸的菌株， 在国内实现l 一组氨酸的发酵法生产，有着重大的意义。 随着d n a 双螺旋模型的发现，生命科学飞速发展。人类对生命的理解上升到了新的 水平，同时也对该学科所能产生的经济效益产生了极大关注，这在一定程度刺激了生物工 程的发展。而作为生物工程分支之一的发酵工程也得到了极大的发展，氨基酸发酵工业的 发展就是个典型例子。 氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，也就是把代谢工程手段引入微生物工业，使其能 够在d n a 水平上改变、控制微生物的代谢，使产物大量积累。对于工业微生物育种来说， 代谢工程是一种非常有效的工具，可以用来制定育种策略1 2 。代谢工程常应用于菌株改良， 其基本思想就是将微生物的整个代谢网络视为有机的整体，在代谢分析( 包括代谢网络结 构分析、代谢控制分析、代谢流分析) 的基础上，从整体的观点出发( 而不是仅仅对个别 基因的简单扩增) 来对整个网络的代谢流进行定向疏导1 1 7 j 。 对于l 一组氨酸产生菌的选育来说，透彻理解l 组氨酸生物合成的途径、遗传特性和调 节机制，对代谢网络进行结构分析和代谢控制分析、并检出速率控制步骤，根据代谢工程 理论来制定合理的育种策略，进一步筛选能够大量积累l 组氨酸的菌株，在育种过程中实 6 践和探索代谢： 程理论，可以为丰富和发展代谢：l 程理论提供一个鲜活的实例。 本课题于2 0 0 4 年9 月申清成为湖北省科技攻关计划项目。 本课题主要通过分析l 一组氨酸在微生物体内的代蹦调控机制，运用代谢控制育种原理 制订育种策略。用化学诱变处理、筛选，赋予菌株多个遗传标志，获得能够大量积累l 组氨酸的菌株，然后对所得的菌株进行摇瓶发酵条件的优化和代谢控制分析。 本课题研究内容包括： ( 1 ) 发酵液中l 组氨酸定性定量测定方法的研究。 ( 2 ) l 组氨酸产生谪的诱变育种。 ( 3 ) 通过优化实验确定摇瓶发酵的最佳培养基成分和发酵条件。 ( 4 ) 通过添加物质、流加实验和上罐发酵实验来分析组氨酸的代谢渊节控制。 江南火学顾二i 二学位论文 第二章发酵液中l 一组氨酸的定性定量测定 2 1 引言 l 一组氨酸与茚三酮溶液共热可生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化 合物。该化合物颜色的深浅与l 一组氨酸的含量成正比，可通过测定特定波长下的光密度来 确定l 一组氨酸的含量。茚三酮显色法步骤简单、灵敏度高，是氨基酸类物质的特征显色， 常被用作检测氨基酸的标准方法。因而在无干扰或干扰较小的情况下，l 一组氨酸的定性定 量测定均可以采用茚三酮显色法。 但是，最初l 组氨酸是用蛋白质水解提取法生产的，水解液中含有多种氨基酸，因而 有人设计出了组氨酸的p a u 】y 试剂显色法测定1 2 ”。其测定原理如下： 当有过量的酸存在时，对氨基苯磺酸和亚硝酸钠可发生重氮化反应生成重氮苯磺酸， 在弱碱性条件下，后者可与组氨酸、含咪唑类物质或含组氨酸的多肽发生偶联反应( p a u l v 反应) ，形成橘红色的偶氮化合物2 ”。 ： n 箱红色严锢 图2 1 组氨酸的p a u l y 反应 f i g 2 - 1t h ep 删i yr e a c t i o no f h i s t i d i n e 在蛋白质水解液经过电渗析以后，组氨酸与同属于碱性氨基酸的赖氨酸、精氨酸混合 在一起。而只有组氨酸才会发生p a u l y 反应，用这种方法就可以快速准确地测定l 组氨酸的 含量。潘军华等曾详细研究了测定蛋白水解液中的l 组氨酸含量的方法和条件【2 8 1 。 也有其它研究者采用不同的方法测定蛋白质水解液中的l 一组氨酸的含量。例如：以电 位法确定终点的库仑滴定法1 2 9 l ，用碳糊修饰电极的伏安法【删，采用离子交换色谱分析仪和 柱后衍生一荧光检测的高效液相色谱法【3 l 】，微分脉冲极谱法 3 2 】，微生物法【3 3 】，荧光法【3 4 】等。 在本研究中，要实现发酵法生产l 组氨酸，需要筛选出l 一组氨酸产生菌并对其发酵条 件进行优化。这个过程中尤其是在菌种选育过程中，需要大量的定性、定量测定操作。因 而确立一个简便且易于实现的定性定量测定发酵液中l 组氨酸的方法是很重要的。 鉴于茚三酮和氨基酸的特征显色，v _ d e r k o s 利用茚三酮反应对发酵液中的l 组氨酸进 行定性测定【3 5 】，但并未见像其它氨基酸那样茚三酮显色后洗脱来进行定量测定3 6 ，3 7 】的报 道。a r a k i 等人采用纸层析后荧光法鉴别，然后洗脱，p a u l y 显色后比色【3 8 】。k i s 呦i 等人曾 提及利用茚三酮和p a u l y 显色来定性测定发酵液中的l 一组氨酸，仪器直接定量测定【l ，但 堡三翌j ! 翌丝! ! 型堑竺竺查堡壅i ! 型窒 未见洋尽报道。 采用氨基酸自动分折仪测定l 氆l 氨酸主要缺点是费用较高、费时，而且样5 * 处理烦琐， 不适合菌种筛选时进行大批量测定发酵液中l 一纽氨酸含量。而纸层析显色法作为种简 便、快速而且经济的检测手段，广泛应用于氮基酸检测领域，因而非常适用于大批量测定 发酵液中的l 、组氨酸含量。 对于成分复杂的发酵液，能否利用纸层析结合茚三酮特征显色或p a u l y 特征显色直接 完成l - 组氨酸的定性定量测定、而不再借助其它仪器或检测方法非常值得探究。因而作者 从展，f ：剂的选择、显色条件等方面，对其进行了研究。 22 材料与方法 22 1 实验仪器与试剂 微量进样器 层析纸 t g l - 16 g 高速台式离心机 7 2 1 分光光度计 h 1 微型混合器 f 包子天平 g s p - 7 7 0 3 磁力搅拌器 h p l l o o 型氨基酸自动分析仪 l ，组氨酸 ：p 醇 i l j 丙醇 正丁醉 吡啶 硫酸铵 乙醇 醋酸 盐酸 对氨基苯磺酸 业硝酸钠 碳酸钠 茚三酮 丙酮 222 实验方法 上海医用激光仪器厂 新华3 号 上海医用分析仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海沪西仪器厂 m e t t l e 公司 江苏泰县姜埝无线电厂 美国a g i l e n 【公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海振兴化：l ：一厂 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海化学试剂采购供应站试剂厂 上海试剂厂 上海虹光化工厂 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集闭上海化学试剂公司 222 1 纸层析分析 纸层析法通过展开剂对发酵液进行展开，显色后，根据各种物质不同的r f 值进行区分。 其优点在于能够快速处理大批量的样品。 江南大学硕= l 学位论文 ( 1 ) 点样 将发酵液离心取上清液，用微量进样器吸取一定量的上清液，注射在宽1 5 c m 的滤纸 上，同时吸取一定量的l 组氨酸标样注射在滤纸上作为参照。所点样离纸下端1 5 c m ，每 个样品间距1 5 c m 。 ( 2 1 层析 p a u l v 试剂显色采用层析剂为：正丙醇：o 2 m o l l 氨水( v v ) = 3 ：1 茚三酮显色采用层析剂为：甲醇：水：1 0 m 0 1 l 乙酸：吡l 赃( v ，v ) = 8 0 ：1 7 5 ：2 5 ：l 将点完