（材料学专业论文）石英晶体微天平研究蛋白质在壳聚糖及衍生物表面的吸附行为.pdf

摘要 摘要 生物医用材料与组织接触会发生一系列复杂的生物反应。蛋白质的吸附是第 一步，影响植入材料的性能并可能直接导致血栓的形成。在生物材料的不同应用 领域，对材料表面蛋白质吸附量及种类有不同的要求；细胞和材料表面存在着以 蛋白质为介导的粘附机理。因此研究生物材料表面蛋白质的吸附行为在研究材料 的生物相容性中具有重要的意义。壳聚糖是一种碱性多糖，含有活泼的羟基和氨 基，可以进行多种化学修饰，壳聚糖及其衍生物在生物医学工程领域具有重要的 应用价值。本研究将生物相容性良好的水溶性聚乙烯基毗咯烷酮接枝到壳聚糖上 改善其亲水性、降低表面蛋白质吸附量；以石英晶体微天平为手段研究了壳聚糖 及其衍生物表面的蛋白质吸附行为。 以过硫酸铵为引发剂，合成了壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮，由红外光谱和 元素分析证实了产物的生成。研究了引发体系、引发剂用量、壳聚糖浓度、单体 浓度、反应时间、反应温度等对反应体系的影响。适宜的反应条件为：反应时间 2 h ，反应温度7 0 ，壳聚糖浓度为5 9 l ，单体浓度为0 4g l ，引发剂浓度为 6 m m o l l 。 利用石英晶体微天平研究了壳聚糖膜表面的蛋白质吸附行为。p h 值不同吸 附蛋白的量也不同，在蛋白质等电点处，出现最大的吸附量；离子强度不同吸附 蛋白的量也不同，在同一p h 值下，蛋白质的吸附量随离子强度的增大而增大； 分子量愈小的蛋白质在膜表面的吸附量愈小。 研究了烷基化壳聚糖膜对牛血清白蛋白和y 球蛋白两种不同尺寸的蛋白质 吸附行为，不同长度烷基链的n 一烷基化壳聚糖表现出对蛋白吸附量的差异，n 一 辛基壳聚糖对蛋白的吸附量较大。n 一烷基化壳聚糖的亲疏水性以及随外界环境改 变的静电相互作用也是影响蛋白质在膜材表面吸附的主要因素。 比较了壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮膜及壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮共混膜 对牛血清白蛋白的吸附行为。实验证实壳聚糖比壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮膜 以及壳聚糖聚乙烯基毗咯烷酮共混膜表面容易吸附蛋白质；在相同的条件下，壳 聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮膜表面吸附的蛋白的量最小。b s a 分子在壳聚糖及 其衍生物膜上的吸附基本上是单分子层吸附，符合l a n g m u i r 模型，b s a 吸附量 与浓度不成线性关系。对b s a 在壳聚糖及其衍生物表面吸附初期的动力学进行讨 论，假设在吸附初期主要形成一种中间状态的亚稳态复合物，并由此推导计算出 了吸附速率常数k 。、解吸附速率常数k 。和结合常数k 。的值。 关键词：壳聚糖；接枝共聚；蛋白质吸附；吸附动力学 摘要 a b s t r a c t w h e nb i o m a t e r i a l sa r ec o n t a c t e dw i t h t h e t i s s u e ，av a r i e t y o f c o m p l i c a t e d b i o r e a c t i o n sc o u l db ea c t i v a t e d ，i nt h e s em u l t i p l e - e v e n t s ，t h ep r o t e i na d s o r p t i o ni st h e f i r s to c c u r r e n c ew h i c hi so fg r e a ti m p o r t a n c ef o rt h ea n t i - t h r o m b o s i so fi m p l a n t e dm a t e r i a l s a n dt h ei n d u c t i o no f b i o l o g i c a lf u n c t i o n s f o rd i f f e r e n ta p p l i c a t i o n s ，i ti sr e q u i r e dt h a tt h e s u r f a c ea b s o r bd i f f e r e n ta m o u n t so fp r o t e i no rd i f f e r e n tk i n d so fp r o t e i n s n e i n t e r a c t i o nb e t w e e nc e l la n ds u r f a c eo fb i o m a t e r i a li si n d u c e db yt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e np r o t e i no fc e l ls u r f a c ea n ds u r f a c eo fb i o m a t e r i a l t h er e s e a r c ho fp r o t e i n a d s o r p t i o nb e h a v i o r i ss i g n i f i c a n ti nt h er e s e a r c ho f b i o c o m p a t i b l em a t e r i a l s c h i t o s a ni sl i n e a rc a t i o n i c p o l y s a c c h a r i d e w i t l las e r i e so f u n i q u e c h e m i c a l p r o p e r t i e sa n db i o f u n c t i o n s c h i t o s a nc a nb em o d i f i e dw i t hi t sa c t i v eh y d r o x y la n d a m i n og r o u p s i t sd e r i v a t e sh a v eag r e a tp o t e n t i a li nt h ea p p l i c a t i o no fb i o m e d i c a l e n g i n e e r i n g i n t h i s w o r k ，p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e w h i c he x h i b i t se x c e l l e n t w a t e r - s o l u b i l i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t yw a sg r a f t e do n t oc h i t o s a ni no r d e rt oi m p r o v e t h e h y d r o p h i l e i t y a n dr e d u c et h ea m o u n to fa d s o r b e d p r o t e i n s q u a r t zc r y s t a l m i c r o b l a n e e ( q c m ) w a sa p p l i e di nt h es t u d yo fi n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h es u r f a c eo f c h i t o s a na n di t sd e r i v a t e sa n d p r o t e i n s n l er e s e a r c hw o r k s a r ea sf o l l o w s ： t h e g r a f tc o p o l y m e r i z a t i o no f v i n y l p y r r o l i d o n e ( n v p ) o n t oc h i t o s a nu n d e r n i t r o g e n a t m o s p h e r ew i t l la m m o n i u mp e r s u l f a t es e r v e da st h ei n i t i a t o r , a n df t - i r e l e m e n t a n a l y s i sc h a r a c t e r i z e d t h eg r a f tc o p o l y m e r a l ls t u d yr e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tp v ph a s b e e ng r a f t e do n t oc h i t o s a n 1 1 1 cw o r ki n v e s t i g a t e df a c t o r st h a ta f f e c tt h e g r a f t i n g r e a c t i o nt bg r a f t i n gp e r c e n t a g e ，g r a f t i n ge f f i c i e n c ya sw e l la st h ei n i t i a t i n g s y s t e m i n i t i a t o rc o n c e n t r a t i o n ，m o n o m e rc o n c e n t r a t i o n ，c h i t o s a nc o n c e n t r a t i o n ，r e a c t i o n t e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m e t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n sf o rh i g hg r a f t i n g p e r c e n t a g e a n d g r a f t i n ge f f i c i e n c y w e r e r e a c t i o nt i m e 2 h ，i n i t a t o rc o n c e n t r a t i o n m o n o m e rc o n c e n t r a t i o n0 4g l a sf o l l o w s ：r e a c t i o n t e m p e r a t u r e 7 0 6 c ， 6 m m o l l ，c h i t o s a nc o n c e n t r a t i o n 5 9 l ， w e i n v e s t i g a t e dt h ea d s o r p t i o nb e h a v i o ro fp r o t e i n so nc h i t o s a nm e m b r a n es u r f a c e t h er e s u l t ss h o wt h ea m o u n to fa d s o r b e dp r o t e i n si sr e l a t e dt op h ，i o n i cs t r e n g t ho f s o l u t i o n ，p r o t e i nc o n c e n t r a t i o na n dp r o t e i nc o m p o s i t i o n t h em a x i m u ma m o u n to f a d s o r b e dp r o t e i n si n c r e a s e sw i t l lt h ei n c r e a s i n gi o n i cs t r e n g t ho fs o l u t i o n m o r e o v e r , t h ea m o u n to fa d s o r b e d p r o t e i n s i n c r e a s e sf u r t h e rw i t ht h e i n c r e a s i n gp r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s f o rd i f f e r e n tp r o t e i n s ，t h ea m o u n to fa d s o r b e dp r o t e i n sw i t hh i g h m o l e c u l a rw e i g h ti sh i g h e rt h a nt h a to fl o wm o l e c u l a r w e i g h t 摘要 t h e a d s o r p t i o n o fb o v i us e r ma l b u m i n ( b s a ) a n d y - g l o b u m i n ( y - g ) o n m e m b r a n e so fa l k y ld e r i v a t i v eo fc h i t o s a nw e r ei n v e s t i g a t e d t h ea l k y lc h a i nl e n 垂h e x e c sa ne f f e c to nt h ea d s o r p t i o na m o u n t s t h eh y d r o p h i l i c i t yo f n a l k y lc h i t o s a na n d t h ep hv a l u ei n d u c e de l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nv a r i a t i o n sa r ei m p o r t a n ti n f l u e n c i n g f a c t o r s 1 1 1 ea d s o r p t i o no fb o v i ns e r i f ! a l b u m i nf b s a ) o nm e m b r a n e so fc h i t o s a n g r a f t v i n y l p y r r o l i d o n ea n dc h i t o s a n b l e n d p o l yv i n y l p y r r o l i d o n ew e r ei n v e s t i g a t e d i t i s d e m o n s t r a t e dt h a tt h ea m o u n to ft h ea d s o r b e d p r o t e i n s o n c h i t o s a n - - g r a f t p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e m e m b r a n es u r f a c ei sl e s st h a nt h a to fc h i t o s a no r c h i t o s a n - b l e n d p o l yv i n y l p y r r o l i d o n em e m b r a n es u r f a c e s 砒e q u a lc o n d i t i o n s b s a w a so b s e r v e dt oa b s o r bo na l lm e m b r a n es u r f a c e sa c c o r d i n gt ol a n g m u i r sa d s o r p t i o n i s o t h e r m t h ea m o u n to fa d s o r b e db s aw a so b s e r v e dn o tp o s i t i v e l yi np r o p o r t i o nt o c o n c e n t r a t i o no fb s a t h ew o r kd i s c u s s e dt h ek i n e t i co ft h ea d s o r p t i o nb e h a v i o ro f b s ao nc h i t o s a na n di t sd e r i v a t e s i nt h e e a r l ys t a g eo fp r o t e i na d s o r p t i o n ，i t i s a s s u m e dt h a tt h er e a c t i o no fp r o t e i na d s o r p t i o no nt h es u r f a c ef o r m sm e t a - s t a b l e c o m p l e xc o m p o u n d t h ea m o u n to fa d s o r b e dp r o t e i nd e p e n d so nt h ea m o u n to ft h e c o m p l e x t h ea t t a c h m e n tc o n s t a n tr a t ek l ，d e t a c h m e n tc o n s t a n tr a t ek l ，a s s o c i a t i o n c o n s t a n tk 。c o u l db ec a l c u l a t e d t h ea t t a c h m e n td e t a c h m e n tc o n s t a n t si n c r e a s e di nt h e f o l l o w i n go r d e r ：c s c s b l e n d p v p c s - g - ，p v rt h ed e t a c h m e n tc o n s t a n t si n c r e a s e d i nt h e f o l l o w i n go r d e r ：c 7 - - 球蛋白( y g ) ；这可能由于材料的亲疏水 性微相分离结构导致了对亲水性的牛血清白蛋白( b s a ) 和疏水性的y 一球蛋白 ( y g ) 的选择吸附特性。 4 3 2 缓冲溶液p h 值对n 一烷基化壳聚糖蛋白质吸附量的影晌 表4 3 牛血清白蛋白( b s a ) 和y 一球蛋白( y - - g ) 的分子量和等电点 t a b 4 - 3t h em o l e c u l a r w e i g h ta n di s o e l e c t r i cp o i n t ( 1 p ) o fb s a a n d 7 - g 第州帚壳聚祧甜牛= | _ f 崾生 j 质吸j ；f = | j j 为圳充 蛋白质的多肽键上既带有酸性，又带有碱性的可解离的基团，它是两性电解 质，随着溶液的p h 值不同而分别解离为刚离子和阴离子。当p h 值 等电点( 1 p ) 时，蛋白质带负电，p h 值 i p 时烷基化壳聚糖去质子化，膜材表面静电荷为零，与 蛋白质的相互作用仅为范德华力作用，且蛋白质分子构象此时也发生扩展，故吸 附量也比等电点要小。 比较b s a 分子和y g 分子在等电点的吸附量可以发现b s a 分子的吸附量要 高于v g 分子的吸附量，这与文献所报道的分子量愈小者在等电点的吸附量愈 大相一致，而比较不同烷基链长度的n 一烷基化壳聚糖对两种蛋白的吸附，无论 缓冲溶液的p h 值高于或低于等电点，任何一种材料对b s a 分子的吸附量均高 于y g 。 j 念 圈 一 f i g 4 - 3a m o u n t o f t h eb s aa b s o r b e do nm e m b r a n e so f d e r i v a t i v e so f c h i t o s a n a saf u n c t i o no f t h el e v e lo f p h 图4 - 3b s a 在n 一烷基化壳聚糖膜表面上的吸附量与缓冲溶液p h 值关系曲线 4 8 1 1 1 1 0 0 o o 一。要霉一矗口兰l8暑e芒noe 第叫章壳聚祜甜生物膜蚩白赝吸附行为研究 b o h f i g 4 - 4 a m o u n to f t h ev - ga b s o r b e do nm e m b r a n e so f d e r i v a t i v e so f c h i t o s a n a saf u n c t i o no f t h el e v e lo f p h 图4 3y - 球蛋白在n 一烷基化壳聚糖膜表面上的吸附量与缓冲溶液p h 值关系曲线 4 3 3 壳聚糖接枝聚乙烯基吡略烷酮，壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮共混 物的蛋白质吸附行为 a b c f i g4 - 5a m o u n t o f t h eb s aa b s o r b e do nc h i t o s a n - gp v pa n dc h i t o s a nb l e n dp v p m e m b r a n e s ( p h = 7 4 ，c a s a ：1 0 1 0 m ，a ：c h i t o s a n ，b ：c h i t o s a nb l e n dp c ：c h i t o s a n gp v p ) 图4 - 5n 一壳聚糖改性膜的b s a 的吸附量( p h = 7 4 。蛋白质浓度为10 1 0 m ， a 为壳聚糖，b 为壳聚糖聚乙烯基毗咯烷酮共混膜c 为壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮) 4 9 0 0 0 0 0 o o 0 d 0 o oh阳：暑驺轴柏骆站拈邓 一e霉一or；5ndm售lujoe 呲 (，。，西3jo l u 3 0 旃u 乒壳聚糖衔生物膜篮 j 质u 艟附行为| f l | 究 表4 - 4 壳聚糖接枝聚乙烯基毗咯炕酮壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮共混物与水的接触角 t a b4 4w a t e rc o n t a c ta n g l e so l lc h i t o s a n g r a f t - p v pa n dc h i t o s a n b l e n d p v p 由图可知，不同亲水表面对b s a 的吸附效果不同。单纯壳聚糖膜，表面自 由能低，接触角大，血液相容性较差，容易吸附蛋白，而经接枝n v p 以后，壳 聚糖膜的表面亲水性大大提高。因而蛋白的吸附能力下降，经过与n v p 共混改 性后，共混膜的蛋白的吸附量通常也有一定的下降，但不如接枝改性的壳聚糖膜 明显。在一定范围内，亲水性越强，血液相容性越好，蛋白质的吸附量越小，因 此接枝改性的壳聚糖膜表面的蛋白质吸附量较小。在相同的条件下，壳聚糖膜表 面吸附较多的b s a 分子，而经过亲水性改性的壳聚糖膜表面b s a 吸附量较低， 其血液相容性得到了改善。 f i g 一4 6a m o u n t o f t h eb s aa b s o r b e do n c s - g - p v pm e m b r a n e s a n dc s b l e n d p v pm e m b r a n e sa sa f u n c t i o no f t h el e v e lo f p h 图4 - 6 牛血清白蛋白在壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮和壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮 共混膜上的吸附量随p h 值的变化 从图中我们可以看出，在b s a 等电点附近壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮和壳 聚糖聚乙烯基吡咯烷酮共混膜吸附量均出现晟大值，在等电点处，蛋白质总净电 荷为零，分子内的静电斥力以及分子问的相互作用处于最小的状态，所以，蛋白 质分子呈现有最密集的结构，从而在表面积一定的材料表面上可以达到最大的吸 附量“1 。在等电点偏酸性的一侧，b s a 分子带正电荷，随着p h 值的减小，b s a (ts、25fel 辨p q 带壳聚槠衙生物膜生i 二】质吸附行为研究 分子带j f 电荷量增加，此外，p h 值的减小使蛋白质分子构象发生扩展。导致蛋 白质的吸附量减少。在p h i p 时，b s a 分予带负电荷，随着p h 值的增大，b s a 分了带负电荷量增加，b s a 分子之间的斥力作用导致吸附量下降。 4 3 4 蛋白质溶液浓度对壳聚糖衍生物表面吸附蛋白质的影响 图4 _ 7 、4 8 显示了在b s a 不同浓度下，壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮共混膜( c s ： p v p = 4 ：1 质量比) 和壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮膜( 接枝率2 5 6 ) 吸附量 与浓度的关系曲线。由图可见，蛋白质吸附量随其浓度的增加而增大，在2 0 x 1 0 m o l l 和2 5 xl o - 3 m 0 1 l 两种浓度下对蛋白质吸附量十分接近，这可能是由 于b s a 分子在膜上的吸附已达饱和状态。图4 - 9 、4 - 1 0 、4 1 1 分别为壳聚糖膜( 由 第三章图3 - 3b s a 膜上的吸附量随溶液浓度变化曲线导出) 、壳聚糖接枝聚乙烯 基吡咯烷酮、壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮共混物蛋白质吸附等温线。 o510 1520 b s a c o n c e n t r a t i o n ( x1 dm 、 f i 9 4 7a m o u n t o f t h eb s aa b s o r b e do n c h i t o s a n g r a f t - p v pm e m b r a n e a saf u n c t i o no f t h e s o l u t i o nc o n t e n t i o no fb s a 图4 7b s a 在壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮膜上的吸附量随溶液浓度变化曲线 们 柏 蛇 柏 拍 驼 一6u 一；h q vs哥qjo苎m售芒30c专 讹i q 卷党聚糖衍生物膜盐白质吸附行为研究 20 寸m f i g ，4 - 8a m o u n t o f t h eb s aa b s o r b e do nc h i t o s a n b l e n d p v pm e m b r a n e a saf u n e t i o no f t h es o l u t i o nc o n c e n t r a t i o no f b s a 图4 8b s a 在壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮共混膜上的吸附量随溶液浓度变化曲线 m , s a y l 0 1 f i g 4 1 0p r o t e i na d s o r p t i o ni s o t h e r mo f c s g - p v p 图4 1 0 壳聚糖接枝聚乙烯基吡咯烷酮蛋自质吸附等温线 “ 啦 鲒 “ 。； 蛆 一oc一5口口odl80mhocno山 、| ， 一 劬降 ，彳 | o 耋姗 。 一 ：、|、|，=一 一 ， i 池船 一 ， 一一糕 一 ， 一 一黼 一 ，篡 一 do叫1叫叫叫j，叫 1，。，、，1_、_ii1叫引到鞠一嚣蠢嗣弭 第叫审壳聚糖衔生物膜蛋白质吸附行为研究 4 0 35 r ；3 0 毛 。25 e 詈2 o j 呈，s l b “】( 1 m f i g 4 - 11 p r o t e i na d s o r p t i o ni s o t h e r mo f c s - b - p v p 图4 - 1 1 壳聚糖聚乙烯基吡咯烷酮共混物蛋白质吸附等温线 l a n g m u i r 模型是一种最简单、最常用的吸附模型，其主要假设为：( 1 ) 单 分子层吸附且无分子间吸附( 2 ) 吸附表面的构成是等同的、均匀的、无相互作 用位点、一个吸附位吸附一个分子( 3 ) 分子对表面上位点对蛋白质分子的吸附 能力与附近位点的占据无关、所有的吸附对蛋白质有相同的亲和性( 4 ) 吸附平 衡是动态平衡6 1 l 。 l a n g m u i r 吸附等温线方程如下【9 3 】： c a m = c a m 。+ 1 ( a m k ) 式中，c 为蛋白质浓度，m 。为最大吸附量，k 。为蛋白质的表观结合常数。 由吸附等温线方程可见，本论文得出的b s a 吸附等温线基本符合l a n g m u i r 型等 温线。 表4 - 5b s a 在壳聚糖及其改性物表面最大吸附量及结合常数 t a b 4 - 5m a x i m u m a d s o r p t i o na m o u n t ( m ) a n d a s s o c i a t i o nc o n s t a n t s ( k a ) 在蛋白质吸附的研究中，吸附的粒子曾被认为能一直保持它们初始的吸附状 态。这一特点与许多非球形或柔性蛋白质和其他生物分子所观察到的实验结果相 反。它们的吸附状态随时间而发生多次改变。例如：纤维蛋白原在吸附初期呈直 立( e n d o n ) 取向，经过一段时间后，变为更稳定的平躺( s i d e o n ) 取向1 6 ”。因 此，蛋白质的取向状态也影响蛋白质的吸附量。 第u u 章壳聚糖衍生物膜蛋白质吸附行为研究 一般来说，固体表面的蛋白质吸附可以分为三个阶段：( 1 ) 蛋白质向固体表 面的扩散：( 2 ) 通过扩散而靠近固体表面的蛋白质与固体表面发生相互作用而被 吸附于固体表面：( 3 ) 由于与固体表面的相互作用使被吸附的蛋白质的构象发生 变化而达到稳定的吸附状态。b s a 分子是由5 8 2 个氨基酸组成，分子量6 7 0 0 0 ， 长轴为1 4 0 9 a ，短轴为4 1 6 a 的长椭球分子【9 4 。因此，b s a 分子也可能有直立 和平躺两种取向状态。当b s a 全部处于直立和平躺取向时，b s a 的饱和单层吸 附密度的理论值分别为1 7 i _ t g c m 2 和o 2 5 1 a g c m