（发酵工程专业论文）纳他霉素生产菌株的选育.pdf

天津科技大学硕士论文 摘要 本论文分别对离效液相色谱法和二剂量管碟法测定纳他霉素的各项参数进 行了研究，最终选择高效液相色谱法( h p l c ) 作为论文检测发酵液中纳他霉素产 量的方法。使用硫酸二乙酯( d e s ) 和紫外线对褐黄孢链霉菌a t c c l 3 3 2 6 进行 诱变处理，利用链霉素抗性筛选法进行初筛，摇瓶复筛，最终获得纳他霉素高 产菌株s g 5 6 。对发酵培养基和发酵工艺进行了优化，提高了纳他霉素的产量。 确定了h p l c 法检测发酵液中纳他霉素的各项参数：在p h e n o m e n e xp r o d i g y 5u0 d s 31 0 0 a ( 2 5 0 n m a 4 6 0 m mi d ，5um ) 色谱柱上，以甲醇一水一磷酸( 体 积比8 5 ：1 5 ：0 1 5 ) 为流动相，流速为1 m l m i n ，紫外检测波长为3 0 3 n m 。实 验结果表明，该方法的相对标准偏差为0 2 4 ( n = 5 ) ，回收率9 9 以上。并与 二剂量法进行了比较，证明结果准确可靠。 利用琼脂块法对a t c c l 3 3 2 6 进行纯化，选择了纳他霉素发酵性能较好的 5 9 号菌株作为诱变出发菌株，摇瓶产量为1 2 5 9 l 。 首先利用硫酸二乙酯进行化学诱变，结合链霉素抗性筛选，获得纳他霉素 产量达到1 6 4 9 l 时诱变菌株s 7 l 。然后对s 7 1 进行紫外线诱变，经过链霉素 抗性筛选，最终获得纳他霉素高产菌株s g 一5 6 ，产量达到2 4 1 9 i n 。 通过对发酵培养基和各项发酵参数进行优化实验，确定最佳培养基配方和 发酵条件：葡萄糖3 6 l ，大豆蛋白胨1 8 9 l ，酵母粉4 5 9 l ，初始p h 值7 0 ； 以2 的接种量接种于装液量为5 0 m l 的5 0 0 m l 三角瓶中，2 9 ，摇床转速 2 0 0 r m i n ，发酵9 6 h ，纳他霉素的产量达到2 7 5 9 l 。 关键词：纳他霉素褐黄孢链霉菌 诱变育种链霉素抗性筛选法 高效液相色谱法 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep a r a m e t e r so fh p l cm e t h o da n da g a rd i f f u s i o nm e t j l o dt od e t e r m i n a t e n a t a m y c i nb i o a s s a y w e r es t u d i e d h p l cm e t h o dw a s d e c i d e dt ob et h e d e t e r m i n a t i o nm e t h o do f n a t a m y c i n s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u sn o 5 9w a st r e a t e d w i t hd e sa n du v l i g h t am u t a n ts g 一5 6w i t hh i g hn a t a m y c i ny i e l dw a ss e l e c t e d w i t hs t r e p t o m y c i nr e s i s t a n c es c r e e n i n g t h em e d i u ma n df e r m e n t a t i o np r o c e s so f s g 一5 6w e r e o p t i m i z e d t h ep a r a m e t e r so fh p l cw e r ed e t e r m i n e d t h e o p e r a t i n gc o n d i t i o n sw e r e p h e n o m e n e xp r o d i g y5uo d s 31 0 0 a ( 2 5 0 m m 4 6 0 r a mi d ，5 ”m 1a tr o o m t e m p e r a t u r e ，m e t h a n o l - w a t e r - p h o s p h o r i ca c i d ( 8 5 ：1 5 ：0 1 5 ，v r v ) a sm o b i l ep h a s e w j t haf l o wr a t eo f1 0 m l m i na n du v d e t e c t i o na t3 0 3 r i m 1 1 1 er e s u l t sw i l in o tb e a f f e c t e db yo t h e rc o m p o n e n t si nt h eb r o t h t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s 0 2 4 ( n 2 5 ) ，a n dt h er e c o v e r yw a so v e r9 9 t h er e s u l tw a sv e r i f i e db y c o m p a r i n g w i t h a g a rd i f f u s i o nm e t h o d n o ，5 9s t r a i nw a ss c r e e n e d b ya g a rb l o c km e t h o db e c a u s eo fi t se x c e l l e n t f e r m e n t a t i o nc a p a b i l i t ya n dw a st r e a t e da so r i g i n a ls t r a i n t h en a t a m y c i ny i e l do f n o 5 9w a s1 2 5 9 mi ns h a k i n gf l a s k a tf i r s t ，n o 5 9w a st r e a t e dw i t hd e s a s t r e p t o m y c i n i e s i s t a n tm u t a n ts 一7 1 w a so b t a i n e d b ys t r e p t o m y c i nr e s i s t a n c es c r e e n i n g t h en a t a r n y c i ny i e l do fs - 7 1w a s u p t o 1 6 4 e e l s e c o n d l y , s - 7 1w a st r e a t e dw i t hu vl i g h t as t r e p t o m y c i n r e s i s t a n t m u t a n ts g 一5 6w a so b t a i n e db yt h es a m em e t h o d t h ey i e l do fs g 5 6w a su pt o 2 4 1 9 l t h eo p t i m u mm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rn a t a m y c i np r o d u c t i o n w e r ed e m o n s t r a t e d t h eo p t i m u mm e d i u mc o n s i s t e d o f ( e l ) ：g l u c o s e3 6 , s o y a p e p t o n e1 8a n dy e a s te x t r a c tp o w d e r4 5a n dp h 7 0 i n o c u l u mv o l u m ew a s2 。a 5 0 0 m lf l a s kc o n t a i n i n g5 0 m lm e d i u mw a sc u l t i v a t e da t2 9 f o r9 6 ha n dt h es p e e d w a s2 0 0 r m i n t h ey i e l d o f n a t a m y c i n u n d e rt h e s ec o n d i t i o n sw a s 2 7 5 9 l 。 k e yw o r d s ：n a t a m y c i n m u t a t i o n b r e e d i n g h p l cm e t h o d i l s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s s t r e p t o m y c i n r e s i s t a n c es c r e e n i n g 天律科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 纳他霉素的发现 1 9 5 5 年，s t r u y k 等人从南非纳他州的土壤中分离到纳塔尔链霉菌 s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ，并从中分离出了一种新的抗真菌物质，称为p i m a r i c i n ( 匹马菌素) 【1 1 ；1 9 5 9 年，b u m s 等人在美国田纳西州的土壤中分离到了一株 恰塔努加链霉菌s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o o g e n s i s ，并从其培养物中分离到了 t e n n e c e t i n ( 田纳西菌素) 。此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物 质，并被世界卫生组织w h o 统一命名为n a t a m y c i n ( 纳他霉素) f 2 1 。 1 2 纳他霉素的理化性质 1 2 1 纳他霉素的结构特性 纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种自色或乳白色， 几乎无臭无味的结晶粉末。分子式为c 3 3 h 4 7 n o l 3 ，分子量为6 6 5 7 5 ，化学结 构如图1 1 所示。 h 如n 图1 - 1 纳他霉素的分子结构 纳他霉素是一种四烯大环内酯，四烯系统是全顺式，内酯环上c 9 一c 1 3 部位是半缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱 氧甘露糖( m y c o s a m i n e ) 。纳他霉素是两性物质，分子当中含有一个碱性基团 和一个酸性基团，其电离常数p k a 值为8 3 5 和4 6 ，相应的等电点为6 5 ，熔 点为2 8 0 。其结构上存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式结构，这就决定 了它在许多溶剂中的低溶解性。纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性是随着 p h 的降低或升高而增加的，在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高 于9 时溶解度增大。纳他霉素在各种典型溶剂中的溶解度如表1 - 1 所示。 表1 1 纳他霉素的溶解度 溶剂溶解度 水 乙醇 乙醇8 0 + 水2 0 甲醇 丙二醇 甘油 二甲基亚砜 冰醋酸 o 0 0 5 0 ，o l o 0 1 0 0 7 3 3 1 4 2 o 1 5 5 o 1 8 5 纳他霉素的紫外光谱如图1 2 所显示，在2 9 0 、3 0 3 、3 1 8 n m 处有尖锐的 最大吸收峰，在2 8 0 n m 处有肩，2 2 0 h m 处有宽峰。由于纳他霉素含有四烯环， 因此在2 8 0 3 2 0 r t r n 之间出现吸收峰，而在2 2 0 n m 的最大吸收是由于纳他霉 素含有发色团。 o r a 芒 三 苦 盥 图1 - 2 纳他霉素的紫外光谱 纳他霉素的四烯发色团给分子一种高不饱和特性，可与溴和含活性氧的 化合物如高锰酸钾、高硫酸盐及过氧化物相互作用；另一方面，它以环氧族 的形式保持弱氧化性，当纳他霉素在冰醋酸中用热的碘化物处理后会析出碘。 纳他霉素通过酸水解作用可以释放出海藻糖氨，内酯可以通过碱水解作用皂 化i , 2 l 。 天津科技人学硕士学位论文 1 2 2 纳他霉素的稳定性研究 纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物，室温下保存几年只有很小 一部分失去活性。三水合物同样稳定，但其无水形态不稳定，在室温封闭的 瓶子中保存4 8 小时失去1 5 的活性。中性的纳他霉素水溶液几乎和干粉一样 稳定。纳他霉素的稳定性受p h 值、温度、光照、氧化剂和重金属等条件的影 响而变化【j j j j 。 1 p h 值：纳他霉素在p h 4 5 9 之间非常稳定，在极端p h 值下纳他霉素 迅速失活，形成各种各样的分解产物。在低p h 值时其主要的裂解产物是海藻 糖胺：在高p h 值时，如p i l l 2 ，由于内酯皂化可形成纳他霉酸，用强碱处理 导致迸一步的分子破裂，产生一系列的后醛醇反应。p h 值对于纳他霉素的稳 定性有一定的影响，但对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响。 g i s t - b r o c a d e s 报道，纳他霉素于3 0 储存三星期，在p h 5 7 的范围内，纳他 霉素的活性仍保持1 0 0 ，p h 3 6 时保持大约8 5 ，p h 9 0 时仅剩大约7 5 ， 但在大部分食品的p h 范围内，纳他霉素十分稳定。 2 温度：温度对纳他霉素的活性几乎没有影响( 在中性水溶液中) 。纳他 霉素在室温条件下是稳定的，5 0 放置几天或1 0 0 短时处理，其活性几乎无 损失。1 2 0 条件下加热不超过1 h 仍能保持纳他霉素的部分活性。 3 光照：纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。y 辐射也能使纳他 霉素分解。 4 氧化剂：纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑 菌活性会明显下降。防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、 丁基羟基茴香醚、丁基甲苯等。 5 重金属：一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、 铅、汞等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中， 也可以添加e d t a 或聚磷酸盐来防止失活。 6 鉴别用颜色反应：把纳他霉素晶体加入滴有一滴浓盐酸的点滴板上， 颜色马上变蓝；如果滴加一滴浓磷酸，颜色马上变绿，几分钟后，都会变成 浅红色。 1 3 纳他霉素的应用 1 3 1 世界各地法规 w h o 和f a 0 规定消费者每天纳他霉素最大摄入量( a d i ) 为0 3 m g k g 体 重，奶酪和香肠的一般消费者每天摄入量为0 0 0 2 m g k g 体重u j 。1 9 9 8 年g r a s 专家组认定纳他霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油和农家干酪非常安 全。目前，荷兰、比利时、法国、西班牙、意大利、瑞典等国家都允许纳他 霉素用于干酪和硬香肠的防腐，荷兰还批准纳他霉素用于苹果和梨的防腐。 在中国，纳他霉素被批准用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易 1 前言 发霉食品加工器皿的表面，一般采用2 0 0 3 0 0 m g k g 悬浮液浸泡或喷洒，残 留量不超过l o m g k g 。纳他霉素也被批准添加到发酵酒、酸奶和色拉酱中， 限量为1 0 m g k g ( 食品添加剂使用卫生标准：g b 2 7 6 0 9 6 ，1 7 0 ，防腐剂) 【5 】o 1 3 2 纳他霉素在食品中的应用 1 9 8 2 年6 月，美国f d a 正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂6 1 。1 9 9 0 年 1 月9 日，我国卫生部食品监督厅签发了国内第个生物食品防腐剂n i s i n ( 乳 酸链球菌素或称乳链球菌肽) 的使用合格证明，到1 9 9 6 年，中国食品添加剂 标准化技术委员会正式批准纳他霉紊可作为食品防腐剂f 引。乳链球菌欣对革 兰氏阳性腐败细菌有抑制作用，对酵母菌及霉菌等丝袄真菌无效；而纳他霉 素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制或杀灭作用，这一点正好与乳链 球菌肽的揶菌谱互补【6 i 。纳他霉素与乳链球菌默是目前国际上批准使用的仅 有的两季中生物食品防腐剂。 纳他霉素由于溶解度很低，被用作食品表面防腐刘以增加货架期，主要 在奶酪、肉制品、葡萄酒、茶饮料及果汁中添加，它不会干扰其它食品组分， 也不会带来异味。它在食品中的抗真菌作用是双效的：既可防止真菌引起的 食品腐败，减少经济损失；又可防止真菌毒素给人类造成的毒素型食物中毒。 与传统的抗真菌剂比较，纳他霉素有其独特的性质，它在很低的浓度下仍具 有活性，例如：在奶酪中纳他霉素比山梨酸钾活性高4 0 0 倍。在葡萄酒中， 纳他霉素能取代山梨醇和其它抗真菌剂，它允许减少所使用的s o ：量f 4 7 。目 前，全世界已有三十多个国家采用纳他霉素作为食品防腐剂。 1 ) 干酪 纳他霉素应用于奶酪生产的工艺已很成熟，有关的报道从7 0 年代至今多 不胜举。纳他霉素用于干酪皮防止其表面发霉，它不会渗透到于酪内部，仅 仅停留在酪皮外层l m m 处，而这一部分般不会被取食，于酪放置5 一1 0 周 后，纳他霉素基本消失，此时酪皮变硬不易受到霉菌侵染，纳他霉素对细菌 无效，因而不会影响干酪和于酪制品的熟化。使用方法一般有浸泡、喷洒或 乳剂覆膜。2 0 0 1 年6 月，b a s i l i c oj c 等人报道，0 5 ( w v ) 的纳他霉素用于 奶酪就可有效防止丝状真菌的污染【8 l 。 2 ) 肉制品 在肉制品中使用2 0 0 0 m g k g 的纳他霉素混悬液对其进行浸泡或喷洒，可 达到纳他霉素含量为8ug e r a 2 安全而有效的防霉水平。对于香肠来说，纳他 霉素可在以下数个步骤中添加：发酵前：肠衣浸泡；已灌料香肠的浸泡；已 灌料香肠的表面喷洒。对于硬香肠来说，纳饱霉素的推荐用量为肠衣浸渍液 质量的d 0 5 0 2 l “。 3 ) 果汁 纳他霉素在果汁中的应用也很广泛。对于葡萄汁，添加2 0 m g k g 纳他霉 4 天津科技大学硕士学位论文 素就能防止酵母发酵；对于2 5 - - 4 7 3 下保存的橙汁，自然条件下保存一周就会 受到真菌的污染，而仅使用1 2 5 m g k g 低剂量的纳他霉素就能保质8 周；对 于苹果汁，3 0 m g k g 的纳他霉素能在6 周内防止发酵变质，并且使果汁的原有 风味基本保持不变【4 1 。 4 ) 茶饮料 1 9 9 9 年，c i r i g l i a n o m c 等人报道，纳他霉素用于茶饮料，可以有效防止 真菌腐败，并给予茶饮料更加可接受的感官特性【7 1 。 5 ) 水果 1 9 8 1 年，j g o o s t e n d o r p 报道，纳他霉素用于水果储存中，可有效防止 真菌引起的有氧降解1 3 j 。我国也有关于纳他霉素应用于水果的报道。将整个 苹果浸泡在含有5 0 0 p p m 纳他霉素的悬液中1 2 分钟后，经过8 个月的存放， 能有效降低苹果变质的数目。另据报道，用卵磷脂一纳他霉素混合液浸洗苹 果可有效防止水果出现的霉腐斑点。 6 ) 焙烤食品 已经研究过纳他霉素在各种焙烤产品中的应用。当黑面包和白面包表面 洒有1 0 0 - 5 0 0 m g k g 的纳他霉素混悬液时，防霉效果不错。用纳他霉素对生面 团进行表面处理，也收到了理想效果。 此外，j g o o s t c n d o r p 还报道纳他霉素用于卷心菜叶的防腐，以及在草、 马铃薯种子和水仙花球茎中的应用，都取得了满意的效果【8 1 。目前，纳他霉 素在我国的应用也越来越广泛。纳他霉素用于沙拉酱、人造奶油、果冻、酱 菜和广式月饼，防霉效果均很好。t g , l o l 1 3 3 纳他霉素在医疗中的应用 纳他霉素除了用作食品防腐剂。还可药用。近几年，报道纳他霉素用于 医疗的文献越来越多，它的临床应用范围也越来越广泛，主要由于它具有以 下一些优良性质：( 1 ) 非常低的口服毒性；( 2 ) 没有证实通过肠道吸收；( 3 ) 没有发现过敏性；( 4 ) 从来没有碰到交叉抗性。纳他霉素以几种制剂形式( 悬 浮剂、乳剂、软膏和鞘状药片等) 被典型地用于抗皮肤和粘液膜的真菌感染， 既可以单独使用又可以与新霉素、氢化可的松及其它类固醇共同使用。纳他 霉素还可用于阴道和肺部真菌感染的治疗 3 , 8 , 1 2 l 。 1 9 9 7 年9 月，k a l i u z h n a i al d ，m u r z i n ae a 报道，将不同剂量的纳他霉素 用于治疗儿童由真菌引起的皮肤和粘液膜感染非常有效【】。 最新的文献显示，纳他霉素已成功的用于真菌性角膜炎的治疗中，纳他 霉素口服不吸收，限于局部用药。因其难溶于水，临床上使用5 混悬液滴眼， 眼部能耐受且无毒性| 1 3 , 1 4 j 。 目前，纳他霉素已被广泛用于食品、医疗、饲料、粮储等领域中，特别是在 食品原料保鲜、成品防腐方面的应用显示了良好的前景。 1 前言 1 4 纳他霉素的研究概况 1 4 1 纳他霉素的作用机制 纳他霉素是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类剂的 多烯大环内酯类抗生素。但是它没有抗细菌活性。这是由于真菌的细胞膜含 有麦角固醇，而细菌细胞膜中不含这种物质，多烯大环内酯类抗生素能有选 择的和固醇结合，结合的程度与膜的固醇含量成正比，结合后形成膜一多烯 化合物，引起细胞膜结构的改变，导致细胞膜渗透性的改变，造成细胞内物 质的泄漏1 4 。纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于破坏休 眠的细胞则需要较高的浓度。纳他霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。1 9 5 6 年，t r e s n e r 曾测试过纳他霉素对5 0 0 种霉菌的抗性，所有菌种都被1 1 0 p p m 的纳他霉素抑制。1 9 5 9 年，i s 比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、制霉 菌素、龟裂霉素等的抑菌效果，发现纳他霉素对1 6 种在肉汤和琼脂中培养的 霉菌是最有效的抑制剂，绝大多数霉菌在0 5 6 p p m 的纳他霉素浓度下被抑 制，极个别的种在1 0 2 5 p p m 的纳他霉素浓度下被抑制，多数酵母在1 0 5 0 p p m 的纲他霉素浓度下被抑制 2 1 。 1 4 2 纳他霉素的安全性研究 纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。纳他霉素 很难被消化道吸收，由于其难溶于水和油脂，大部分摄入的纳他霉素会随 粪便排出。给奶牛喂饲高剂量的纳他霉素，结果表明，9 0 的纳他霉素及其 分解产物经粪便排出【5 l 。1 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等研究纳他霉素的急性毒性和 慢性毒性，证明纳他霉素对人体器官没有明显影响，也不产生伤害。1 9 7 3 年h a m i l t o nm i l l e r 报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。1 9 7 7 年，d eb o e r 和s t o l kh o r s t h u i s 研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性， 他们在连续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发现真菌形成抗性的证 据，使用大于m i c ( 最低有效抑制浓度) 的纳他霉素量，人为诱导也没有发 现真菌形成抗性的证据。1 9 8 2 年，r a y 和b u l l e r m a n 报道纳他霉素能减少 黄曲霉产生的黄曲毒素、赭曲霉产生的赭曲毒素、圆弧青霉产生的青霉酸、 展开青霉产生的展开青霉素【5 】。因此，纳他霉素能减少真菌毒素给人类造成 的危害。 1 4 3 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径可以分解为活化前体的生成( 乙酰 辅酶a 和丙二酰辅酶a ) 、内酯大环的生物合成( 多聚乙酰途径) 和氨基糖的 形成。如图1 3 所示。 6 天津科技大学硕士学位论文 蕾蕾糖 1 l b - 啊触目* 1 i 唧u 勰j l 勰 枷 一 ”旺 注：代表能量代谢 代表应阻断的代谢途径 图1 3 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径 1 4 4 纳他霉素发酵生产的研究 纳他霉素产生菌为链霉菌，链霉菌的基内菌丝体通常发育良好，多分枝， 无隔膜而连贯；它的气生菌丝丰茂，气生菌丝通常较基内菌丝粗，颜色较深， 当菌丝逐步成熟时，大部分气生菌丝分化成孢子丝，产生呈长链的孢子，孢 子为外鞘所包，鞘表面平滑或带各种装饰物，在电子显微镜下表现为双短杆 镶嵌图，有鳞片或形状和大小不同的突起、刺或毛发等；孢子的分裂方式也 有差异，有的沿横膈中央平切，有的两端浑圆，由残余的鞘相连。 目前，报道的纳他霉素产生菌有三种： 1 ) 恰塔努加链霉菌s t r e p l o m y c e sc h a t t a n o v g e n s i s ，a t c c1 3 3 5 8 孢子丝圈至螺旋形，有时柔曲；孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺。 2 ) 纳塔尔链霉菌s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ，i s p5 3 5 7 孢子丝2 5 圈松敞螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，表面带小刺。 3 1 褐黄孢链霉菌s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o m u s ，a t c c13 3 2 6 孢子丝螺旋形；孢子呈球形或卵圆形，孢子表面带刺。 磊上 1 前言 早在1 9 6 0 年，c y a n a m i d 就报道了发酵生产纳他霉素的传统方法。但接 下来的相关报道比较少，直到九十年代，有关纳他霉素的生产研究才重新受 到关注。 1 9 9 3 年，m a 艾森申克的专利c n1 0 7 1 4 6 0 a 报道了发酵法生产纳他霉 素的种菌培养和繁殖方法。要求用一种适宜的生孢子琼脂培养基，种菌繁殖 所用的孢子悬浮液应包含的孢子浓度约为1 0 5 1 0 1 0 c f u m l 。适宜的种菌细 胞密度含有约1 5 9 l 的于细胞重，并且是纳他霉素生产培养基体积的 0 1 1 0 1 5 1 。 专利c n1 0 7 2 9 5 9 a 报道了通过控制发酵培养基的p h 值可以提高纳他霉 素的生产速率。在纳他霉素发酵主阶段即抗生素生产阶段，向发酵液中加入 适宜的p h 控制剂( 如n a o h 、k o h 、c a ( o i q ) 2 等) 以控制发酵液p h 值，使 其维持在5 9 6 1 ，可提高纳他霉素生产速率和产率，一般生产时间可减少 2 0 6 0 ，产量可达5 9 l 【”j 。 同年，奥尔森的专利c n1 0 7 0 6 8 8 a 报道了连续发酵法生产纳他霉素。第 一阶段，进行有效的种菌繁殖，伴随部分纳他霉素的产生。在发酵的第二阶 段进行连续生产，维持发酵液的体积基本不变，使加入培养基的速度和取出 发酵液的速度基本一致，维持至纳他霉素不再以成本有效的方式产生，产量 可达6 1 2 9 l 1 们。 1 9 9 4 年，e i s e n s c h i n k ，m i c h a e la l l e n 等人的专利报道了流加碳、氮源进 行纳他霉素发酵的过程。指出发酵培养基中至少应有1 5 l 的蛋白氮源和 8 0 2 5 0 9 l 的碳源，其中碳源要不断流加，使碳源浓度保持在5 3 0 9 l ，纳 他霉素产量可达至少5 e , l i i 。 2 0 0 0 年，e n s h a s y h a ，f a r i dm a 等人报道了接种物类型和培养条件对纳 塔尔链霉菌产生纳他霉素发酵的影响。指出用孢子悬液而不用营养细胞进行 种菌繁殖，用于接种的孢子悬液浓度应为1 0 8 个m l 。培养条件主要研究了溶 氧水平对发酵的影响，并指出向培养基中添加水溶性生物聚合物如褐藻酸钠 可以降低溶解氧，使纳他霉素的产量下降【1 9 1 。同年，他们报道了通过最佳碳、 氮源的选择及其比例的优化，只使纳他霉素产量提高到1 5 9 l 1 2 。 1 4 5 关于纳他霉素生产菌基因工程的研究 目前，世界上对纳他霉素生产菌基因工程方面的研究仅刚刚起步，有关 的文献很少。 19 9 9 年，a p a r i c i oj f , c o l i n aa j 等人研究了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌 的生物合成基因簇，染色体组包含1 1 0 k b 碱基对。他们还报道了由功能基因 分隔的两个亚簇编码的聚酮合酶基因组，包含两个主要的基因p i m s o 和 p i m s l ，p i m s o 编码一个相对较小的乙酸激活聚酮合酶( p k s ) 基因( 大约 1 9 3 k d a ) ，p i m s l 编码一个巨大的多酶基因( 大约7 1 0 k d a ) 1 2 “。 天津科技大学硕士学位论文 2 0 0 0 年，a p a r i c i oj f , f o u c e sr 等人报道了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌 的一个含1 6 个开放读码框，8 4 9 8 5 b p 基因簇的序列，它是继制霉菌素后报道 的第二个多烯大环生物合成基因簇，它编码聚酮合酶( p k s ) 的1 3 个同源酶 基因，p k s 被分配在五个巨大的多酶系统中( p i m s 0 p i m s 4 ) 1 2 2 j 。同年，m a l t a v m e n d e s ，j e s u sfa p a r i c i o 等人又研究报道了纳塔尔链霉菌中的一个隐蔽质 粒p s n a l 的基因图谱和全部核苷酸序列，d n a 分子大小9 3 6 7 b p ，g + c 的含 量占7 1 3 ，拷贝数3 0 。p s n a l 包含七个开放阅读框，分别编码不同的蛋白 质【2 3 1 。 2 0 0 1 年，m a r t avm e n d e s ，e l i s e or e c i o 等人报道了从纳他霉素产生菌纳 塔尔链霉菌中获得的目的基因片段p i m d ，它编码细胞色素p 4 5 0 环氧酶，负 责将4 , 5 去环氧匹马霉素( 4 ，5 d e e p o x y p i m a r i c i n ) 转变成匹马霉素。4 ，5 去环 氧匹马霉素是一种生物活性物质，是从纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的一个 重组突变体中分离得到的【2 4 j 。 目前，基因工程在抗生素生产中的应用还是初步的，关键问题是对抗生 素生物合成途径和代谢调节机理的认识非常有限，但随着人们对抗生素合成 基因研究的不断深入，基因工程在提高抗生素产量方面是大有可为的，它是 目前生物技术研究中最接近产业化的领域之一。 1 4 6 纳他霉素分离提取的研究 纳他霉素的分离提取方法有很多。英国专利g b 8 4 6 9 3 3 报道了从发酵液 中用混合性极性溶剂如甲醇、丁醇和丙酮，采用吸附、洗脱法提取纳他霉素。 美国专利n o 3 3 7 8 4 4 1 报道了用限制性水溶性有机溶剂萃取纳他霉素。专利报 道了盐析法提取纳他霉素，包括溶剂溶解，蒸发和纳他霉素析出。后来，专 利g b 2 1 0 6 4 9 8 报道了体积浓缩法和从过滤后的发酵液中用丁醇回收纳他霉 素，从而获得了一种抗真菌混合物原液，从中可分离纳他霉素。世界专利 w 0 9 2 1 0 5 8 0 报道了在低p h 条件下用甲醇溶解纳他霉素，然后除去固形物， 提高p h 以沉淀析出纳他霉素。这些提取过程一般要求多级纯化，操作费用比 较昂贵，而且纳他霉素对酸降解非常敏感，存在提取量低的缺点。 1 9 9 9 年8 月，美国专利5 9 4 2 6 1 1 报道了一种有效的提取高质量纳他霉素 的方法，该方法的提取过程主要包括四步： ( 1 ) 用错流过滤发酵液，浓缩至发酵液浓度达到1 0 5 0 ( w v ) ，浓 缩过程中，可以在5 0 7 0 条件下加热发酵液以提高蒸发量和过滤速率。 ( 2 ) 调节发酵液的p h 在1 0 1 1 ，添加足够量的水溶性有机溶剂如乙醇、 丙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等溶解发酵液中的纳他霉素。可通过加抗氧 化剂如抗坏血酸、b h a 、b h t 等来进一步提高纳他霉素的稳定性。 ( 3 ) 通过错流过滤除去没有活性的发酵不溶物。 ( 4 ) 调节过滤液的p h 在5 5 - - 7 5 范围内，使纳他霉索沉淀。过滤得到 9 析出的晶体，可用于进一步纯化，干燥。 通过这种方法，干燥产品纯度可达9 4 9 9 ( 无结晶水计算) ，纳他霉素 回收率可达4 0 7 0 f ”】。 1 4 7 纳他霉素的检测 1 4 7 。1 生物检测法 纳他霉素效价的生物检测法主要采用管碟法。管碟法利用抗生素在琼脂 培养基中的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有 敏感性实验菌的琼脂表面进行扩散渗透，由于对被试菌的抑制作用而产生抑 菌圈，抑菌圈的大小和抗生素的浓度之间有一定的比例。这个方法利用抗生 素抑制敏感菌的特点，符合临床使用的实际情况，而且灵敏度高，不需特殊 设备，因此被国际公认 2 6 ，2 饥。 1 4 7 2 高效液相色谱( h p l c ) 法 高效液相色谱( h p l c ) 法由于其操作简便、精密度高，因此广泛地用于 检测食品中残留纳他霉素的含量。高效液相色谱( h p l c ) 法检测纳他霉素广 泛采用c 1 8 反相柱，纳他霉素在3 0 3 r i m 处有最大吸收峰，所以检测器采用u v 检测器，常见流动相如表1 - 2 所示。 表1 2h p l c 法检测纳他霉素常用流动相 f r e d e 利用 玎p l c 鉴定乳酪浸出物中的纳他霉素，测量峰值为3 0 3 n m ， 2 0 n g l 2 8 1 。r o e z l 9 9 7 年报道，可以通过h p l c 检测成熟乳酪中纳他霉素残量。 首先用体积比为2 ：1 的甲醇：水溶液提取样品中的纳他霉素。然后用反相 c 8 的色谱柱进行测定。1 9 9 8 年，r y b i n s k a k 也用反相c 8 的色谱柱和紫外检 测器进行食品中纳他霉素的检测j 。 1 9 9 8 年，我国对检测干酪中纳他霉素的含量进行了研究。王克利等人利 用冰乙酸：水( 5 ：4 0 ) 直接提取沙拉酱中的纳他霉素，离心分离后，在高效液 相色谱仪上于波长3 0 5 n m 处测定其含量。高效液相色谱条件：色谱柱为大连 依利特科学仪器有限公司h y p e r s t l b d sc 】84 6 i d x l 5 0 m m 。柱温：4 0 ；流 动相：甲醇；水：冰乙酸( 6 0 ：4 0 ：5 1 ；流速：1 o o m l m i n ；检测波长：u v 3 0 5 n m ； 1 0 天津科技大学硕士学位论文 进样量：1 0 ul ；蜂面积定量。该方法操作简易，精密度c v = - 2 4 ；线性范 围o 1 0 ug m l 【3 0 】。还有报道，由乙酸铵和氯化铵的水溶液、四氢呋喃和乙 腈构成流动相，使用硅化十八烷( o d s ) 反相色谱进行纳他霉素的检测【5 1 。 1 4 7 3 紫外分光光度法 h a r r yb r i k 研究了在含有o 1 醋酸的甲醇中纳他霉素的紫外光谱，乙酸 作为波长稳定剂。纳他霉素的紫外光谱显示，在n = 2 9 0 、3 0 3 、3 1 8 n m 处有尖 锐的最大吸收峰，因此紫外分光光度法可检测纳他霉素。在2 2 0 n r n 处有宽峰， 可以把它同制霉菌素与两性霉素区分开。2 8 0 3 2 0 r t m 之间出现的吸收峰是由 于具有四烯环的性质。 f l e t o u r i s d j 等人研究了紫外分光光度法分析奶酪和奶酪皮中的纳他霉 素的方法。检测样品与酸性水合乙氰混匀，过滤，滤液在3 2 2 6 n m 下直接测 定，测定范围o 5 2 0 m g k g ，可得到较好的线性关系( 瑚9 9 8 8 ) 1 3 h 。 1 5 链霉菌育种进展 链霉菌是生物技术界瞩目的重要菌种资源。它们产生绝大多数已知的抗 生素、动物生长促进剂等生物活性物质。因此，链霉菌育种以及寻找新的链 霉菌资源的工作成为十分活跃的研究领域。具体分为基因突变与诱变育种、 遗传重组育种、基因表达调控和代谢调节育种、基因工程与定向育种四个部 分。 1 5 1 基因突变与诱变育种 利用理化因子对链霉菌进行诱变，从各种基因突变中筛选有利突变的诱 变育种是传统的育种方法，也是最常用、最有效的。诱变育种结合培养条件 的优化已使四环素发酵从最初的每毫升几百单位跃升到现在的3 万单位以上。 d e t a i n 将金霉素生产菌株绿链霉菌先诱变成不产抗生素的菌株，然后再进行 回复突变，结果获得了一株金霉素高产菌株，其金霉素产量提高了6 倍【3 2 】。 1 5 2 遗传重组育种 杂交、转化、转导和原生质体融合等遗传重组手段己广泛运用于工业菌 种的选育。在链霉菌选育中，原生质体融合技术显得更为突出。原生质体融 合技术具有杂交频率高，重组体种类多等优点。应用这一方法获得的第一个 新抗生素是吲噌佐霉素【3 3 。原生质体融合与再生对引起和激活沉默基因的表 达是强有力的手段，现在链霉菌菌株之间的原生质体融合都已可能进行，原 生质体再生会引起链霉菌菌种发生表型和基因型变化，成为寻找新的抗生素 和生物活性分子资源的有效手段。 1 5 3 基因表达调控和代谢调节育种 链霉菌的次级代谢产物包括多种多样的活性物质，这促使人们对其基因 表达调控和代谢调节进行了大量的研究。这些研究主要集中于抗生素生物合 成代谢调控的各个方面。目前己阐明：抗生素生物合成基因成簇排列，并不 1 前言 形成一个操纵子，而是组成几个不周的转录单位，绝大多数基因表达的调节 出现在转录中：抗生素产生菌通常含有多个抗性基因。它们连接在生物合成 基因簇上，或构成其中的一部分；抗生素生物合成基因与抗性基因互相调节： 特异性调节基因在生物合成基因簇内或相邻位置上；抗生素生物合成基因与 抗性基因的表达除了受特异性调节基因调控外，还受控于中央控制路线。 这些机制的阐明为进一步设计育种方案提供了依据。研究生物合成的遗传调 控，探索激活合成基因的设想是可行的。 1 5 4 基因工程与定向育种 自从1 9 8 0 年首次报道链霉菌基因克隆以来，对于链霉菌的基因操作和应 用研究正逐渐增强。目前，已有许多抗生素的生物合成基因、抗性基因、酶 基因和外源基因在链霉菌克隆系统中成功地表达。 链霉菌抗生素合成基因成簇排列，可以使我们通过d n a 分子水平操作， 大幅度提高重要抗生素的产量以及发现新抗生素。h o p w o o d 把抗生素生物合 成基因克隆分为五种方法： 第一种方法是使用变青链霉菌作为转化宿主，以基因性状表达为指标， 进行以纯株培养为目标的克隆化。 第二种方法是以抗生素生物合成的阻断突变株的互补，将有关抗生素生 物合成基因克隆化。 第三种方法采用c h a t e r 等人开发的噬菌体载体的突变株培养法。 第四种方法是抗生素抗性基因克隆化，然后将联结在抗性基因上的抗生 素合成基因克隆化。 第五种方法是用合成d n a 探针的纯株培养法。邓子新等利用此方法克隆 了吸水链霉菌( s h y g r o c o p i c u s ) 和井冈链霉菌的两套肽类抗生素生物合成基 因【3 5 1 。 链霉菌为宿主，进行酶基因及外源蛋白表达也是目前的研究重点。同大 肠杆菌相比，链霉菌基因组分子量大，能容纳较多的外源基因，作为克隆表 达菌株安全性较高。外源蛋白表达的宿主通常为变青链霉菌和天蓝链霉菌。 载体包括质粒载体与噬菌体载体。目前在链霉菌克隆系统中成功表达的基因 有：琼脂水解酶、葡萄糖激酶、木聚糖酶等p 6 】。 1 6 链霉素抗性基因筛选方法的研究 虽然现代基因工程技术近些年来发展迅速，但由于链霉菌的抗生素生物 合成基因趋于成簇排列，共同控制链霉菌的抗生素生物合成【翊。而利用基因技 术很难迅速将全部抗生素生物合成基因克隆表达出来。而传统的诱变育种方 法，具有菌种遗传稳定性高、方法简单易行等优点，仍然是链霉菌育种不可 缺少的手段。但是由于各种理化诱变方法所产生的突变是随机的，其突变频 率低，只有l 旷l o “，并且突变株中，多数为负向变异，生产需用的正变株 2 天律科技大学硕士学位论文 的突变频率更低。由于基因突变是不定向的，如果盲目上摇瓶进行经验式筛 选，必然导致目标菌株筛选工作量大，直接影响了诱变育种的工作效率。因 此，在诱变完成后，如何定向筛选出正向突变株则是一项更重要的工作。 1 6 1 链霉素的抗菌作用机制 链霉素是由w a k s m a n 等于1 9 4 3 年首先发现的由灰色链霉菌产生的氨基 环醇类抗生素。这类抗生素是一类分子中含有一个环己醇型的配基、以糖苷 键与氨基糖相结合的化合物。链霉素早期在临床上的应用，拯救了无数结核 病患者。但由于它对神经的毒性和对肾脏的损害等毒副作用较大，最终停止 了临床应用。链霉素抗菌作用主要是抑制蛋白质合成起始，抑制7 0 s 合成起 始复合体的形成和使f m e t - t r n a 从7 0 s 合成起始复合体上脱离，并且能够引 起密码错读。 1 6 2 链霉素抗性和抗生素合成之间的关系 链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系是目前抗生素科 研领域的一个研究热点。k o c h i 报道他们在多种链霉菌中获得r e l 突变株，陀， 突变株的共同特点是其产抗生素能力消失，并且菌体内积累鸟苷四磷酸 ( p p g p p ) 的能力明显下降。而在同种链霉菌的正常菌株中菌体形态分化和产 抗生素的开始往往伴随p p g p p 的激增。这充分表明p p g p p 是次级代谢起始的 优势信号因子，对抗生素生产的启动具有重要作用 3 8 , 3 9 , 4 0 j 。 1 9 9 6 年，j s i f t n m 等人报道链霉素抗性突变使原本不产放线菌紫素的 s 1 i v i d a n s 产生放线菌紫素。d n a 测序显示该链霉素抗性突变使编码核糖体蛋 白s 1 2 的r p s l 基因中l y s 8 8 突变为g l u 。进一步实验表明这种链霉素抗性基 因突变可以使增，突变株恢复抗生素的生产，而没有伴随p p g p p 的积累。这 些研究证明链