（生物医学工程专业论文）乳化内部凝胶工艺制备载酪蛋白海藻酸钙微球的研究.pdf

学位论文的主要创新点 1 、采用乳化内部凝胶工艺制备了载酪蛋白海藻酸钙微球，并系 统的研究了微球的粒径分布、表面形态、产率、包封率、蛋白含量、 模拟胃肠液的体外释放及溶胀情况。 2 、考察了操作温度、搅拌速度对载酪蛋白海藻酸钙微球性能的 影响，同时研究了自然干燥、加入分散剂干燥、真空冷冻干燥三种不 同干燥方式对微球分散性及表面形态的影响。 3 、采用两种方法制备了壳聚糖海藻酸钙微球，并研究了微球在 不同p h 条件下溶胀情况。通过壳聚糖覆膜后的海藻酸钙微球可有效 的减少其在磷酸缓冲液中的解聚。 摘要 目前，蛋白质药物仍主要采j j 注射给药方式。为了减少频繁注射对健康的危 害，迫切需要发展一种缓控释放的非注射给药途径。微球作为蛋白质口服给药系 统的应用不仅口j 以减少药物在澍肠道环境中的破坏，同时具有缓释功能。海藻酸 和壳聚糖是天然的生物材料，具有无毒、生物相容性和川降解性，积：组织工程医 疗产品的支架、网定活细胞的载体以及控制药物释放方瓶具有良好的应j _ f 】前景。 本文采用乳化内部凝胶t 艺，制备了载酪蛋白海藻酸钙微球。通过光学显 微镜观察了凝胶微球的球形度、分散性和粒径分布。微球经冷冻干燥后，采川扫 描电镜观察了微球的分散性、表面形态以及内部结构。并通过对酪蛋白、空白海 藻酸钙微球和载酪蛋白海藻酸钙微球表嘶进行能潜分析，以确定表嘶元素分布及 含量。采用0 1 5 mp h5 7 的柠檬酸缓冲液对微球进行解聚，以测定酪蛋白的包 封率及在微球中的含量。研究了载酪蛋白海藻酸钙微球在模拟胃肠液的体外释放 及溶胀情况。考察了不同操作条件对微球粒径人小及分布、分散性及表狐形态的 影响。为减少海藻酸钙微球征模拟肠液中的解聚，采j f 】两种方法制备了壳聚糖 海藻酸钙微球，并研究丫其在蔓种不同p h 条件下的溶胀情况。主要研究结论如 下： 1 ) 使用乳化内部凝胶t 艺町以制备出粒径在4 0l a m 左右的单分散性的载酪 蛋白海藻酸钙凝胶微球。冷冻： 二燥后的微球仍具有较好的分散性，但微球表面出 现凹陷。 2 ) 在模拟胃液条件下，酪蛋白从海藻酸钙微球中缓慢释放；在模拟肠液条 件下，酪蛋白快速释放。海藻酸钙微球在p h1 2 的盐酸缓冲液中，仍能保持其 结构的完整性；而在p h6 8 的磷酸缓冲液的条件下，微球溶解形成海藻酸钠溶 液。 3 ) 随着湍度的升高，微球的粒径逐渐增人，分布变宽，同时乳液的稳定性 变差，微球产率降低。搅拌速度的增加有利于减少微球的粒径，但粒径分布变宽。 不同的1 二燥条件町影响微球的分散性及表i l f 形态。 4 ) 采用两种方法制备的壳聚糖海藻酸钙微球都具有较好的球形度以及良好 的分散性。经壳聚糖覆膜后的海藻酸钙微球可有效防止微球的解聚，并且采用一 步法制备的微球较两步法效果更好。 关键词：海藻酸钙，壳聚糖，乳化内部凝胶，微球，体外释放，溶胀 a 嚣s t r a c - i p r o t e i n d r u g sa r em o s t l y d e l i v e r e db yp a r e n t e r a la d m i n i s t r a t i o nn o w t o m i n i m i z et h eh e a l t hh a z a r db yr e p e a t e di n j e c t i o no ft h e s es h o r t a c t i n gd r u g s ，t h e r ei s a nu r g e n tn e e dt od e v e l o pan o n - p a r e n t e r a lr o u t eo fa d m i n i s t r a t i o na sw e l la st o d e v e l o p f o r m u l a t i o n sw i t h c o n t r o l l e d - d e l i v e r y f e a t u r e s t h e a p p l i c a b i l i t y o f m i c r o s p h e r e sa so r a lp r o t e i nd e l i v e r ys y s t e m si sb a s e dn o to n l yo np r o t e c t i o nf r o m g a s t r o i n t e s t i n a lc o n d i t i o n s ，b u ta l s oo nt h ef a c tt h a tt h ed r u gr e l e a s ec a nh ec o n t r o l l e d a l g i n a t ea n dc h i t o s a na l en o n - t o x i c ，b i o c o m p a t i b i l i t y , b i o d e g r a d a b l e ，n a t u r a l l y o c c u r r i n gb i o p o l y m e r s ，h a v es h o w np o t e n t i a lf o ru s ea ss c a f f o l d si nt i s s u e - e n g i n e e r e d m e d i c a lp r o d u c t s ，a sa ne n c a p s u l a t i n gm a t r i xf o ri m m o b i l i z a t i o no fl i v i n gc e l l s ，a n da s d r u gd e l i v e r ys y s t e m s c a s e i n - l o a d e d c a - - a l g i n a t em i c r o s p h e r e s w e r ep r e p a r e d b ye m u l s i f i c a t i o n i n t e r n a lg e l a t i o nt e c h n i q u e o p t i c a lm i c r o s c o p ew a su s e dt oo b s e r v et h es p h e r i c i t y , d i s p e r s i t ya n ds i z ed i s t r i b u t i o no fh y d r a t e dm i c r o s p h e r e s t 1 1 ed i s p e r s i t y , s u r f a c e m o r p h o l o g yp l d i n t e r n a ls t r u c t u r eo ff r e e z e - d r i e dm i c r o s p h e r e sw e r ee r ：a m i n e db y s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) e n e r g y - d i s p e r s i v ex - r a ys p e c t r o s c o p y ( e d s ) t e c h n i q u ew a su s e dt oa n a l y z et h es u r f a c ee l e m e n t a lc o m p o s i t i o no fc a s e i n , p u r e c a - a l g i n a t em i c r o s p h e r e sa n dc a s e i n - l o a d e dc a - a l g i n a t em i c r o s p h e r e s m i c r o s p h e r e s w e r ed i s a g g r e g a t e db yt h ec i t r i ca c i db u f f e rs o l u t i o nc o m p o s e do fp h5 7a n dm 0 15 m o l lt od e t e r m i n ec a s e i ne n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c ya n dl o a d i n ge f f i c i e n c y n v f 疗移r e l e a s ea n ds w e l l i n gw e r es t u d i e di ns i m u l a t e dg a s t r i ca n di n t e s t i n a lf l u i d s t h e i n f l u e n c e so fd i f f e r e n to p e r a t i n gc o n d i t i o n so np a r t i c l es i z ea n dd i s t r i b u t i o n , d i s p e r s i t y , s u r f a c em o r p h o l o g yw e r ea l s os t u d i e d t or e d u c et h ed i s a g g r e g a t i o no fc a - a l g i n a t e m i c r o s p h e r e si np h o s p h a t eb u f i e rs o l u t i o n , c h i t o s a n c a a l g i n a t em i c r o s p h e r e sw e r e p r o d u c e db yt w om e t h o d sa n ds t u d i e di t ss w e l l i n gi nt h r e ed i f f e r e n tp hc o n d i t i o n s t h er e s u l t sa l ef o l l o w s ： 1 ) c a s e i n - l o a d e dc a - a l g i n a t em i c r o s p h e r e sc a nb ep r e p a r e db ye m u l s i f i c a t i o n i n t e r n a lg e l a t i o nt e c h n i q u ew i t hau n i m o d a ls i z ed i s t r i b u t i o na n dt h ef n e a nd i a m e t e ri s a b o u t4 0 斗i i lf r e e z e d r i e dm i c r o s p h e r e sc a ns t i l lk e e pg o o dd i s p e r s i t y , w h i l e i n d e n t a t i o n se x i s ti ni t ss u r f a c e 2 ) r e l e a s ei s s l o wi ns i m u l a t e dg a s t r i cf l u i da n df a s ti ni n t e s t i n a lf l u i d c a 。a l g i n a t em i c r o s p h e r e sc a ns t i l lm a k l t a i nas t a b l et r i d i m e n s i o n a ln e t w o r ks t r u c ：u r e i n p h1 2h y d r o c h l o r i ca c i db u f f e rs o l u t i n ，w h i l ei np h6 8p h o s p h a t eb , j f i e r c a a l g i n a t ei sc o n v e r t e dt oas o l u b l es a l to fs o d i u ma l g i n a t e 3 ) w i t ht h ei n c r e a s ei no p e r a t i n gt e m p e r a t u r e ，t h es i z eo fm i c r o s p h e r e si s d e c r e a s ea n dt h ed i s t r i b u t i o ni sw i d e r ；t h es t a b i l i t yo fe m u l s i o ni sb e c o m i n gb a da n d t h ey i e l di sd e c r e a s e d h i g hs t i r r i n gr a t ei sc o n d u c i v et od e c r e a s et h ep a r t i c l es i z eb u t t h ed i s t r i b u t i o ni sa l s ow i d e r d i f f e r e n td r y i n gm e t h o d sc a ni n f l u e n c et h ed i s p e r s i t y a n ds u r f a c em o r p h o l o g yo f m i c r o s p h e r e s 4 ) c h i t o s a n c a - a l g i n a t em i c r o s p h e r e sp r o d u c e db yt w om e t h o d sh a v eg o o d s p h e r i c i t ya n dd i s p e r s i t y c a a l g i n a t em i c r o s p h e r e sc o a t e db yc h i t o s a nc a nr e d u c ei t s d i s a g g r e g a t i o ni np h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o na n dt h eo n e s t a g ei sb e t t e rt h a nt w o s t a g e k e ) “, v o r d s ：c a a l g i n a t e ，c h i t o s a n ，e m u l s i f i c a t i o n i n t e r n a lg e l a t i o n ，m i c r o s p h e r e s ，n v i t r or e l e a s e ，s w e l l i n g 目录 第章绪论1 1 1 研究彳亍景1 1 2 微球给药系统研究进展一2 1 2 1 微球给药系统简介2 1 2 2 微球载体材料3 1 2 3 高分子材料的生物降解过程4 1 5 常川微球的制备方法一5 1 4 药物往微球中的释放过程一6 1 5 存在的问题7 1 6 海藻酸钙及壳聚糖海藻酸钙微球的研究7 1 6 1 海藻酸钠的性质7 1 6 2 海藻酸钙凝胶化反应机理8 1 6 3 壳聚糖的性质9 1 6 4 壳聚糖成膜机理1 0 1 6 5 海藻酸钙微球常j 玎制备方法1 0 1 6 6 壳聚糖海藻酸钙微球常| j 制备方法1 3 1 7 酪蛋白的理化性质1 4 1 8 本论文的研究内容及意义1 4 第二章载酪蛋白海藻酸钙微球的制备及体外释放性能的研究一1 7 2 1 前言1 7 2 2 材料和方法1 7 2 2 1 实验材料l7 2 2 2 实验仪器1 8 2 2 3 实验方法1 9 2 3 结梁与讨论2 2 2 3 1 外部凝胶t 艺制备海藻酸钙微球一2 2 2 3 2 乳化内部凝胶工艺= 制蘩海藻酸钙微球2 3 2 3 3 微球的扫描电镜分析2 5 2 3 4 能谱分析2 6 2 3 5 微球的产率分析2 7 2 3 6 柠檬酸缓冲液对海藻酸钙微球的解聚原理一2 8 2 3 7 微球中酪蛋白含量的测定2 9 2 3 8 酪蛋白海藻酸钙微球体赡释放的研究3 2 2 4 本章小结3 6 第三章不同操作条件对域酪蛋白海藻酸钙微球的影响3 7 3 1 前言一3 7 3 2 实验条件的选择3 7 3 2 1 操作温度的选择3 7 3 2 2 搅拌速度的选择一3 7 3 2 3 l ：燥条件的选择3 7 3 3 结果与讨论3 8 3 3 1 不同操作温度对微球粒径火小及分布的影响3 8 3 3 2 不同搅拌速度对微球粒径人小及分布的影响3 9 3 3 3 不同卡燥条件对微球分散性及表瞳形念的影响4 0 3 4 本章小结4 2 第四章壳聚糖海藻酸钙微球的制备及在4 i 同p h 条件下的溶胀实验4 3 4 1 前占4 3 4 2 实验方法4 3 4 2 1 壳聚糖海藻酸钙微球的制备4 3 4 2 2 不同p h 条件的确定一4 4 4 2 3 光学显微镜观察微球舀：不同p h 条件下的溶胀4 5 4 2 4 扫描电镜观察经不同p h 条件溶胀后的微球4 5 4 3 结果与讨论4 5 4 3 1 光学显微镜观察4 5 4 3 2 红外光谱分析4 7 7 4 3 3 微球的溶胀4 7 4 4 本章小结5 3 第五章结论与展望5 5 5 1 研究结论5 5 5 2 问题及展望5 6 参考文献5 7 发表论义情况6 3 致谢6 5 第一章绪论 f 1 1 研究背景 第一章绪论 生物技术足当今世界科学技术活动中最活跃、最具有前途的新技术，从中派 生出来的医药生物技术，为新药的研制开创了一条崭新的道路，如预防乙肝的基 因重组疫苗，治疗严重贫血症的红细胞生长素、治疗糖尿病的人胰岛素、治疗 侏儒症的人生长激素、治疗血友病的凝血冈子等特效药都是现代生物技术医药 新产品( 生物技术药物) ，它们正在改变医药科技界的面貌，为人类解决疑难病 症提供了最有希望的途径。 2 0 多年来，生物技术药物，尤其是蛋白质药物产业蓬勃发展。全球生物技 术公司总数已近5 0 0 0 家，上市公司有6 0 0 余家，销售总额近4 0 0 亿美元，其中 生物技术药物占总销售额的7 0 。从整个产业的分布情况看，生物技术公司主要 集中在欧美，占全球总数的8 5 ，欧美公司的销售额占全球生物技术公司销售额 的9 7 。美困是世界生物工程产业的龙头，其生物工程公司占全球总数的5 5 ， 销售额占全球生物工程产品销售总额的8 2 ；生物工程上市公司市值达3 0 0 0 多 亿美元。目前已批准近1 5 0 个蛋白质药物上市，适应症达2 2 0 种，使3 2 5 亿患 者受益，蛋白质药物的产值和销售额已超过2 0 0 亿美元。预计到2 0 2 5 年，美国 生物技术市场总额将达到2 万亿美元。日本在生物技术的开发上仅次于美国，目 前共有生物制药公司约6 0 0 家，上市的蛋白质药物近3 0 种，证在研发的有几十 种。欧洲是生物技术革命的重要发源地之一，目前有2 9 0 种蛋白质药物进入临床 试验，其中2 9 种已批准上市。 我国生物医药技术的研究和开发起步较晚，但发展较快。尤其是执行国家 8 6 3 计划以来，中阁的生物医药取得了飞速发展。“十五 期间，我圈增大了生 物技术及其产业的发展力度。国家8 6 3 、9 7 3 以及自然科学基金等重大研究发展 规划对生物技术的总投资接近6 0 亿元，生物医药及其产业发展到今已初具规模。 目前我国有2 0 个国家生物技术药物重点实验室，3 个蛋白质药物丌发中心，2 8 9 家生物制药企业，生物技术产业的群落和集约化已初见端倪。我网已开发成功 2 1 种基冈工程药物和疫苗，批准上市的蛋白质药物1 9 种。 蛋白质药物町分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重 组疫苗；与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、 生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全町靠， 已成为医药产品中的重要组成部分。但蛋白质药物在常温下稳定性差，在体内易 降解，半衰期很短，临床上常用的剂型为注射h j 溶液剂和注射用灭菌粉末，给药 天津工业人学硕，l 二学位论文 途径单一且必须频繁注射。长期用药后注射部位町能会出炎症、硬结等副作用， 甚至产生耐药性，不可避免地要求病人忍受多次重复注引起的疼痛和给身体带来 的不适，严重影响病人的生活质量，而且也不能满足目益增长的生物技术药物的 临床应用需求。因此，发展使用方便、安全的蛋白质非注射给药途径，是目前圈 内外医药界广泛关注的重大问题。 目前，正在研究和发展之中的蛋白质非注射给药途径主要包括黏膜给药系 统( 口腔黏膜给药、鼻黏膜给药、直肠黏膜给药、眼黏膜给药等) 、肺部给药系统、 透皮给药系统、口服给药新剂型等。由于一直被认为是最方便、最安全、最易被 患者接受的给药方式，口服足蛋白质非注射给药的重要途径，它将是今后国际蛋 白质药物的发展前沿和热点。但蛋白质口服剂型的生物利用度很低，对于口服生 物利用度变化较大且成本较高的药物来说难以接受，因此这种给药形式一直末获 得成功。各闽科学对于蛋白质口服给药存在的问题已经进行了多方面研究，并提 出了许多解决这些问题的对策，加快了实现蛋白质口服给药的步伐： 1 2 微球给药系统研究进展 1 2 1 微球给药系统简介 微球( m i c r o s p h e r e ) 是指药物溶解或分散于高分子材料中形成的微小球状实 体，球形或类球形，粒径在毫米以下，包括微米级的微球和微囊( 通常二者统称 微球) ；粒径在0 1 1 阻的称为弧微球；而粒径狂1 0 - - 1 0 0h i l l 的纳米级粒子称为 纳米粒。相比传统和常规剂型，微球制剂的优点主要集中在：将药物包埋在 微球中可以避免药物在口服给药途径中被消化道水解酶解以及胃酸环境对药物 的破坏，可以增加药物的稳定性。药物从载体基质中逐渐释放从而具有缓释 和长效作用，可维持有效血药浓度，提高疗效，减轻患者频繁多次给药的痛苦， 提高患者的顺应性，而且采用具有良好生物相容性和生物降解性的高分子聚合物 作为微球的载体材料，可在体内安全降解为无毒产物排放到体外，不对人体造成 伤害( 图1 1 ) 。对于难溶性药物来说，由于其溶出速度低，往往难以被有效 吸收，使得生物利用率较低，微球载体的存在为提高难溶性药物的溶解度和溶出 速率，控制药物发挥长效作用提供了有效的手段。微球作为靶向给药的载体 在肿瘤治疗上已取得令人鼓舞的治疗效果，由于微球具有较高的靶向性，使药物 在肿瘤以外的组织器官中分布较少，可减少抗肿瘤药物的副作用。因此近几年来， 微球在蛋白质类、多肽类、d n a 等生物技术药物的包埋上已成为人们的研究热 点【1 翻。 2 第一章绪论 f 血 黎 度 i ” l门厂 f f fj 上滚y 十给药 f 绘药l 绘药 甲罨耀瑷 l f 蕞 薤治疗浓度 对阉。 时闽。 ( a ) ( b ) 图1 0 l普通制剂( a ) 和控释制剂( b ) 给药时血药浓度示意图【3 】 1 2 2 微球载体材料 在微球给药系统中，材料的性质足决定药物释放的主要冈素。作为药物缓控 释载体材料，必须满足以下，乙个基本条件：不影响人体的i f 常生理活动( 如炎症、 凝血或者溶血反应等) ，具有良好的生物相容性，无免疫原性，降解产物无毒副 作用；一定的机械强度和可塑性，避免制剂崩溃引起的药物，眦重突释而导致的药 物过敏甚至中毒：适宜的药物释放速率；能与药物配伍，彳i 影响药物的药理作用 和含量测定；具有符合要求的粘度、渗透性、亲水性、溶解性等性质；适宜的加 工性能，制剂的制备过程简瞥方便，价格便宜。一般来说，药物载体通常采朋町 降解高分子材料。可降解高分子材料是指在生物体内能被水解或酶解，生成的小 分子物质通过代澍而被机体吸收或排出体夕 的一类高分子材料。可降解高分子材 料常用作一些半衰期短、稳定性蔗、易降解及毒副作用人的药物的控释制剂基材， 这样能有效地减少给药次数和给药量、提高药物的生物利用度、最大程度减少药 物对全身毒副作用。生物高分子材料按来源可分为天然高分子材料和合成高分子 材料两大类。 ( 1 ) 天然高分子材料 天然高分子载体材料主要包括两人类：蛋白质类( 明胶、白蛋白、血纤维蛋 白原) 和糖类( 淀粉、海藻酸钠、阿拉伯树胶、壳聚糖) 。天然高分子材料由于 性质比较稳定、无毒、成膜性好且价廉易得，因而是最常用的微球载体材料。 明胶 由多种氨基酸顺序结合形成的两性蛋白质，分子间存在着_ 硫键、 离子键或氢键等交联，为氨基酸与肽交联形成的直链聚合物。其平均相对分子质 量在1 5 0 0 0 - - 2 5 0 0 0 之间，通常足不同分子量的混合物。因制备时所用水解方法不 同町分为酸法水解明胶( a 型明胶) 和碱法水解明胶( b 型明胶) 。a 型明胶的 p h 值为3 8 6 0 ，其等电点为7 9 ，而b 型明胶的p h 值为5 7 4 ，等电点为4 7 5 0 。 3 灭津t 业人学颁l j 学位论文 两者黏度均为0 2 o 7 5m p a s ，随明胶来源而异，但两者的成膜性能无明显差异， 可生物降解性，几乎无抗原性。用于制备微球的用量一般为2 0 1 0 0g l 。 白蛋白又称清蛋白。溶于水f l 遇热凝固的一种球形单纯蛋白。在自然界 中分布最广，几乎存在于所有动植物中。如卵白蛋白、血清白蛋白、乳白蛋白、 。肌白蛋白、麦白蛋白、豆白蛋白等都属于此类。因为其制备工艺简謦、可生物降 解、对人体几乎无毒性等特点，被广泛应用于肿瘤治疗及其它药物的研究【4 】。 阿拉伯树胶为高分子多糖类及其钙盐、镁盐和钾盐。作载体的用量一般 为2 0 - - - l o o g l ，但一般不单独使用，弓明胶等量配合使j j ，亦可与白蛋白配合作 复合材料。 ( 2 ) 合成高分子材料 合成高分子相比于天然高分子材料而言有其独特的优点，其可以根据需要进 行设计，改良其性质。合成高分子载体材料主要有：聚酯类、聚酯聚醚类、聚氨 基酸类等，目前用于注射与植入，可在体内降解。 聚酯类是迄今研究最多、应j 玎最广的可生物降解的合成高分子，它们基本上 都足羟基酸或其内酯的聚合物。其中，聚乳酸是种线型聚酯类高分子，主要足 由内交酯在催化剂存在的条件下，通过高温或减压，开环聚合而成。其降解速度 与其分子量和结晶度有关。分子量越高，降解越慢。聚乳酸水解的中间产物为乳 酸，它是体内糖的证常代谢产物，乳酸参与体内生化代谢，最终生成水和二氧化 碳排出体外。 1 2 3 高分子材料的生物降解过程 生物降解指高分子材料通过水解或酶解反应，转化为相对简单的中间产物或 小分子的过程。生物町降解高分予主链上一般含有可水解的不稳定化学键( 例如 酯键、酸酐键) ，在有水存在的环境以及酶或微生物的作用下可水解降解，从而 使得高分子主链断裂，分子量逐渐变小，以致最终成为瞥体或代谢成c 0 2 和h 2 0 的过程。在生理环境条件下，高分子材料的降解主要包括水解和酶解。 水解过程：首先生物可降解高分子材料被水解为小分子，然后再被吸收排泄。 大量研究表明町降解合成高分子材料的降解主要是水解。 酶解过程：虽然生物町降解高分子前期的水解过程不一定需要酶参加，但水 解生成的低分子量高分子片段町能需要通过酶作用转化为小分子代谢产物。普遍 认为酶解和酶促氧化反应是高分子材料在体内降解吸收的重要冈素，酶在一定程 度上影响降解机制和速度。 可降解材料包埋的药物释放主要分为药物扩散和材料降解。在材料未降解之 前，药物主要是水分渗入材料内部，然后药物溶解随水分扩散出来；当材料降解 时，药物在伴随材料降解的同时也释放出来。 4 1 3 材料 的制 ( 1 ) 本法的基本原理是药物与载体材料溶液混合后，将其分散在不相溶的介质中 形成乳液，然后使乳液内相同化并分离制备微球。按照内相同化方法，可分为加 热网化法、交联剂网化法、溶剂蒸发法二种类型。乳化溶剂挥发法( 图1 2 ) 足 制备生物町降解高分子微球最常用的方法，根据制备时形成的乳液的不同，又叮 分为孽乳法( 如o w ，0 0 ) 和复乳法( 如w o w ，w o o ) 。o w 溶剂挥发法 已经被成功地应用于包封脂溶性药物或在水中溶解度不大的药物。0 0 法则是 o w 用于包封水溶性药物的改进，因为采用后者方法制备时，药物容易从有机 相扩散进入外水相，导致包封率的降低。复乳法( w o w ) 是应用最广泛的用 于包封水溶性药物的溶剂挥发法。该方法避免了0 0 法中内油相对活性药物( 如 基冈、蛋白质类药物) 的破坏。复乳法虽然有利于制备水溶性药物，但是影响参 数却要比单乳法复杂的多，而且复乳的稳定性较差，容易破乳导致包封率的降低， 此时多采用将外水相用药物饱和的方法来提高载药量和包封率i j j 。 含药牛寸和裁体 材科的商机楣 ， 、 匕_ 含乳化荆的水相 漆囊n 攥发固 化或獭球 r 一l ，。 乙翻一 步骤2 步骤l 乳化分数成球状 图1 2 采用乳化溶剂挥发法制备微球示意图 ( 2 ) 相分离法 相分离法是在药材和载体材料的液相混合物中，加入另一种物质或溶剂或采 用其他适当的手段使载体材料的溶解度降低并在药材周闱固化，形成一个新相析 出。其微球形成过程主要有以下二个过程：高分子溶液发生相分离，高分子聚合 后吸附药物，微球表面的固化。此种方法是一种非水的制备方法，尤其适于油一 水相界面易失活的蛋白质、多肽类药物微球的制备。用该法制备药物微球，主要 存在的问题足需用人量的有移l 溶剂。相分离法又町进一步分为单凝聚法、复凝聚 法、溶剂一非溶剂法等，因这些方法所用的设备比较简单，高分子来源j “泛，可 天津t 业人学硕i 二学位论文 包埋多种类别的药物，所以相分离法已成为包埋药物的主要方法【5 】。 ( 3 ) 喷雾下燥法 将聚合物溶解在低沸点的溶剂中，药物通过溶解或以小颗粒分教的方法预先 载入聚合物溶液中，然后将溶液用雾化器喷雾，同时川向上流动的氮气干燥。本 法既适合微球的工业化生产，又简化了灭菌工艺。已有采刚喷雾干燥法制备的微 球产品问世，如s a n d o z 公司的澳麦角环肤微球制荆p a r o l d e l 。g a v i n i 等f 6 h i l l 化 一喷雾十燥法制备了用于治疗眼部严重感染的多肽类抗生素万古霉素p l g a 微 球。将药物溶液与p l g a 的二氯甲烷溶液高速分散乳化后形成w o 乳液后进行 喷雾j t ：燥，进口温度8 0 - - 8 5 ，出1 ：3 温度6 8 7 0 ，喷雾腿力为2 0 3 妒a ，一次 喷液量为3 0 0m l 。经检测，万古霉素微球的包封率达8 4 2 9 9 5 ，半均粒径为 l l 肛m ，并且载药量越大，释药速率越大。体内药动学研究显示，万古霉素的微 球滴眼剂比静脉注射万古霉素水溶液的生物利用度高出一倍f 7 1 。 1 4 药物在微球中的释放过程 c 囝一黎 弋厶哆铲一巧一篆 。k 。4 彩凌“ 图1 3 药物从微球中释放示意图 6 第一章绪论 1 5 存在的问题 尽管f t 前对微球制备材料和成型工艺的研究较为广泛，但存红很多问题。 ( 1 ) 生物相容性蔗 微球包埋生物人分子并红生物体内应j l j 时，其制备材料必须典有很好的生物 相容性，即往不引起或引起的生物异常反应( 宿主反应，如过敏炎症反应及最 终导致的排斥反应) 很轻的情况下，发挥有效作用。乳酸乙醇酸共聚物( p o l y ( 1 a c t i c a c i d c o g l y c o l i ca c i d ) p l g a ) 足町降解聚合物的代表，表现出化学稳定性和成膜 性好，易于规模制备的优点，假其牛物相存性差。例如，p l g a 微球制备过程残 留溶剂的毒性町能导致微球内胰岛细胞分泌胰岛素能力下降：而且p l g a 降解j 娩 生局部酸环境，既引起生物体刺激反应f 8 】 又影响包封蛋白质活性【鲥。 ( 2 ) 微球成型条件苛刻 兀前基于上述材料的微球成型工艺几乎全部是乳化一溶剂挥发法，主要问题 在于大量使用有机溶剂、强烈彬l 械剪切造成的药物活性丧失，以及町预见的环境 污染；另外，乳化法工艺繁琐的后处理工序亦是微球制备效率低的限制性冈素之 一o ( 3 ) 材料成本高 载药微球材料中对聚酯及其衍生物、脂质体的研究最为集中，其优势在于聚 合物本身及降解产物无毒，町彼人体吸收，但问题足材料成本较高，限制丫载药 微球规模化研发及未来产品的市场份额。 多糖( 如海藻酸钠和壳聚糖) 和蛋白质( 如白蛋白和明胶) 是天然材料的代 表，通常无毒、免疫原性低。壳聚糖是由氨基葡萄糖和_ 乙酰氨基葡萄糖瞬种 氨基多糖组成，_ 乙酰氨基葡萄糖也是细胞外基质( e x t r a c e u u l a rm a t r i x ，e c m ) 的成分，它可与核心蛋白通过共价键连接成蛋白多糖，形成多孔亲水的凝胶结构， 有利于水分及小分子的渗透，并调节细胞生长、分化与胶原形成。因此，壳聚糖 在组成和结构上与e c m 具有部分相似性，且生物相容性好。海藻酸钠足美国食 品药品管理局( f d a ) 定义为“通常认为安全( g e n e r a l l y r e g a r d e da ss a f e ，g r a s ) 的一种化合物【m 】。同时，壳聚糖、海藻酸钠来源j 。、成本低，符合载药微球规模 化研发需求。这些特点使得它们作为包埋生物人分子微球材料的麻j j 备受关注 1 l l 。 1 6 海藻酸钙及壳聚糖海藻酸钙微球的研究 1 6 1 海藻酸钠的性质 海藻酸钠( 简写为n a a l g 或a l g ) 足存在于褐藻类海洋生物中的线性阴离子 7 天津t 业火学硕l ：学能论文 天然多糖，由p d 甘露糖醛酸( m ) 和咖l - 古罗糖醛酸( g ) 通过( 1 4 ) 糖赞 键聚合而成( 如图1 - 4 ) 。海藻酸钠分子链中既有均相片段( 如m m 、g g ) ， 也有非均相片段( 如m g ) ，且g 和m 比例随原料产地和季节不同而变化。 h 争d - m a n n u r o n i ca c i d ( m 铷l - g u l u r o n i ca c i d g ) g ：1 c 4 赫：1 c gi g i赫鞠g g mmm 麟g g g g a 镰g 氛籁翱e 翱g mmm 朋m 雠g 、- p _ ，、_ _ _ 。 m m o c kg m o c k _ 。- ，_ 、_ _ _ _ _ 。，_ 。- _ _ 。_ ， 轴g m o c k精b l o c k 图1 - 4 海藻酸钠分子结构式g ：古罗糖醛酸，m ：h 。露糖醛酸【1 3 】 1 6 2 海藻酸钙凝胶化反应机理 海藻酸钠在遇见c a 2 + 、b a 2 + 等二价阳离子，在离子移交作用下c a 2 + 将n a + 簧换出，形成既有强度性能又有弹性的海藻酸钙凝胶。海藻酸钠分子链中只有g 能与c a 2 + 键合，所以高g 含量的海藻酸钠最适合形成海藻酸钙凝胶。随着g 与 c a 2 + 的键合，古罗糖醛酸开始折叠堆积，使得相邻的海藻酸钠分子链从自然伸展 的卷曲状态向整齐有序的带状结构转变，最终导致了海藻酸钙三维网状凝胶结构 的形成，通常被称作“蛋盒( e g g b o x ) ”结构【l 引。进一步分析表明，“蛋盒”构 的形成足由于在1 个c a 2 + 与2 个g g 片段间形成了4 个配位键，即g 中5 - c 0 0 和2 - o h 参与了配位键的形成( 图1 5 ) t 1 5 】。这种温和的转变条件及提供的水环境 对于保持微球内包封的细胞或生物分子活性相当重要，而且二三维网状凝胶结构有 利于细胞生长及代谢。 8 第一章绪论 图1 5 海藻酸钙凝胶“蛋盒”结构示意图 在生理条件下，海藻酸钙凝胶同样在离子移变作用下被n a + 或k + 箴换出 c a 2 + ，又转变为海藻酸钠溶胶，其分子链f i 会发生水解或酶解而断裂降解，但是 静脉注射2 4h 后分子量( m w ) 4 8k d a 的海藻酸钠可被缓慢从生物体中代谢排 出，高m w 海藻酸钠仍存在于血液循环系统并不易和任何组织中蓄积。当移植入 小鼠体内，高m 海藻酸钠( 2 5 9 k d a ) 失重少覆弹性模量没有降低，而低m w ( 2 0 0l a n ) ，难于规模化生产。乳化内部凝 胶技术的发展为人规模生产更小尺寸的海藻酸钙微球提供了有效方法。本章研究 的日的采用乳化内部凝胶工艺制备出具有较高包封率的海藻酸钙微球，同时以 酪蛋白为模型研究了蛋白质在模拟胃肠液p h 条件下的体外释放过程。 2 2 材料和方法 2 2 1 实验材料 表2 1 实验材料一。览表 1 7 天津t 业人学硕 j 学 证论文 2 2 2 实验仪器 表2 2 实验仪器览衷 1 8 第一章载酪蛋白海藻酸钙微球的制备及体外释放性能的研究 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 外部凝胶工艺实验步骤 取0 1g 酪蛋白溶于6 0l n l 水中，搅拌均匀，向溶液中加入0 6g 海藻酸钠粉 末，于4 0 水浴中加热溶解，配制成质量分数1 的海藻酸钠溶液，常温下静止 脱泡。在磁力搅拌作用下，采用lm l 规格的医用注射器针头将海藻酸钠溶液滴 加入质量分数5 的c a c l 2 水溶液中，海藻酸钠溶液与c a c l 2 水溶液体积比为l ：1 0 ， 3 0m i n 后收集海藻酸钙凝胶珠，光学显微镜观察。 2 2 3 2 乳化内部凝胶工艺实验步骤 取0 1g 酪蛋白分散于2 0m l 水中，搅拌均匀，向溶液中加入0 6g 海藻酸钠 粉末，于4 0 水浴中加热溶解，常温下静止脱泡。取2g 纳米c a c 0 3 粉末分散 于1 0 湖水中，搅拌均匀并将其加入剑海藻酸钠溶液中，磁力搅拌3 0m i n 左右。 将含有酪蛋白的海藻酸钠溶液滴加到质量分数1 的s p a n8 0 的液体石蜡中，水 油相体积比为3 1 8 ，4 0 0r p m 乳化2 0m i n 后，形成稳定乳液。向乳液中滴加体积 分数2 0 的冰醋酸液体石蜡混合液2 0i n l ，冰醋酸与c a c 0 3 摩尔比为3 6 。反应 lh 后，溶液p h 由5 6 下降到4 0 。向体系中加入等体积的水，静止4 0r a i n 后， 收集海藻酸钙凝胶珠。凝胶珠j f 】质量分数1 的t w e e n8 0 水溶液清洗。 2 2 3 3 海藻酸钙凝胶微球粒径分析 。 用滴管吸取一滴海藻酸钙凝胶微球液滴，放入载玻片中于光学显微镜下观 察，取一视野下的微球5 0 0 个，计算其粒径，并统计粒径分布。 1 9