（纺织工程专业论文）羊毛tgase酶法接枝改性机理研究.pdf

摘要 摘要 转谷氨酰胺酶( t r 锄s 西u t a m i n 嬲e ，简称t g ) 是一类可催化蛋白质内赖氨酸残基上的 氨基和谷氨酰胺残基上的丫羟酰胺基胺基间结合的聚合性酶，使蛋白质内部形成交联。 羊毛蛋白中含有相对丰富的赖氨酸和谷氨酰胺，因此利用转谷氨酰胺酶可催化其内部形 成共价交联，进而对羊毛接枝改性，从而改善羊毛的物理和化学性能。传统的羊毛改性 常常使用氯化剂及其衍生物，但氯化过程所产生的a o x 会造成严重的环境污染，因此 受到严格的限制。 本课题，首先采用靛酚蓝分光光度法来测定m t g 酶催化反应体系所释放的氨，研 究发现，t r i s h c l 缓冲液中靛酚蓝显色法测氨不可行，而磷酸盐缓冲液对其影响不大。 通过测定m r g 酶催化羊毛织物交联反应释放氨量与羊毛织物强力和白度的对比发现， m t g 酶催化交联的经过咖0 4 和d c c a 预处理的羊毛织物，其强力分别恢复了6 和 4 ，d c c i a 预处理的羊毛织物其白度恢复了2 左右。而其反应体系释氨量却无法检测 到，说明m r g 酶催化羊毛织物交联释放氨较少，不易检测。通过对羊毛蛋白模拟物 酪蛋白的m t g 酶交联释放氨的检测，发现1 0 虮酶浓度下，反应体系释氨量在7 5 p 酌【i l l ， 证实了m t g 酶对酪蛋白的催化交联作用，最后采用自制的羊毛蛋白溶液通过对其m g 酶催化交联释氨的检测，1 6 l 酶浓度下，反应体系释氨量在2 5 恤咖l ，证明了m r g 酶 对羊毛蛋白溶液的交联作用。研究发现，还原剂d 1 盯的加入能改变羊毛的蛋白质结构， 反应体系中2 0 i i l m o l i ，的d t t 能促进m r g 酶对羊毛的催化交联作用。最后进一步通过 s d s p a g e 蛋白质电泳分离技术和红外光谱技术证实了 仃g 酶对酪蛋白和自制的羊毛 溶解蛋白的催化交联作用。 关键词：转谷氨酰胺氨酶；羊毛；酪蛋白；靛酚蓝显色法；电泳 a b s t m c t a b s t l ? a c t t s g l u t 锄u n 鼬e ( t g ) i s 锄e n z y m ec a p a b l eo fc a t a l y z i n ga c y lh 硼s 触r 嘶o n sb y i n 们d u c i n gc o v a l e n tc r o s s i n 哥l i n l ( s 锄o n gp r o t e i n sa sw e l la sp 印t i d e s 卸dv 撕。髑p r i m a 巧 锄i n e s t h ew o o lf i b e r sm a i n l yc o n s i s to fp r o t e i na n d 锄i n oa c i d ，l i k e 卫l u t 锄i ca c i d 觚d l y s i n e w i n l 廿l e 柏n s 酉u t 锄i n 淞e ，m ec m s s l i r l ko fp r o t e i n si nw 0 0 1 一矗b e 璐c 锄b ef - 0 肌e d c l l l o r i n eo ri t sd e f i v 枷v e si so n 锄u s e di n 仃a d i t i o n a lm o d i f i c a t i o no fw 0 0 1 a 0 f d b s o 而d b l e o r g 鼢i ch a l o g e n ) i nc ：t l l 耐n 抓l 喀p f o c e s s 髂c 躺鹤s e r i o 潞l y 锄们r o n m 锄t a lp o l l u t i o n 1 h 吼 s o m em e m o d sa r ed e v e l o p c di nw o o lm o d i f i c a t i o n i l i 廿l i sp a p e r i n d o p h e n o lb l u em 劬o di su s e dt 0d e t 锄i n a t e 廿l ep r o d u c t ( 鲫棚姗i 啪) o f m r g c a t a l y z e dr e a c t i o n so fw o o lf i 出r i c s t h ei n l p a c to fd i 舔玳i n tb u f 蚤日s y s 钯m s 氨wm e i n d o p h 黜o lb l u em e l h o dw 勰f i 鹉t 咖d i e d i tw 嬲f 1 0 u n dm a t 确s h c lb u f 断鲥砸i s u 吼s u i t a b l e 衙l i sm e t h o d ，w t l i l ep h o s p h a t eb u f f 打s o l u t i o nh 嬲l 韶se 行e c t c 优珥瞰e dm c w l l i t e n e s s 弧db r e 砌c i l l gs 嘶l 星mo fm em 1 孓c a t a l 删w 0 0 lf a b r i c s 、i 吐l 也e 赶m t 蜥a c o n t e n to ft l l e 坞删o nr i m l e w e 内叫1 dt ：h eb 心蛐gs 打锄星mi s 阳：p a i r e d6 a n d4 r e s p e c d v e l ya n dt l l ew h i t 铋豁si sr 印a i r e d2 o fn l ew o o lf a b r i cd e a l c dw i t l ld c c a b u tw e c 觚td e t e c tn 地烈i l 瑚【o i l i a i nt h e 托 a c t i o ns y ；慨n s ow eh o w nt h a tt h ei n 山邛h 锄lb l u e m e m o di sr i o t 飘l 伍c i 铋te x a c tb a ；越塔eo f l el i m er e l 铭s e 缸o no fm em t g c a t a l v z e d 职删o i 坞 o fw o o lf 如r i c s u p o nm a t 、es t i l d yt 1 1 ew 0 0 l ss i m u l a n t ( c 嬲e i n s ) a i i dc t - 肌t h mm t ；c m b eu s e 触t 0c 嬲c i ：啮i t sm i t e c 屯e d7 5 斗r n la 衄m aw h 舳t h e 聊n ec o n c 嘲l 乜娟o ni sa t l 0 l a tl a s t ，w ec o n j f i 姗m a tm t g c a nb eu s e 丘l lt ot h ew o o lk 盯a t i n sw em a d eo 咖瞎e l v e s i t sd e l e c t e d2 5 肛g m l 锄m 砌a 、7 l ，h e n l ee 忆y m ec o n c a n l 您虹o ni sa tl6 l i tw a sa l s o 内u n d t l l a t 川u 咖ga g 吼td t tc o u l d 印v em e 枷昭- c 列) ，z e dr c a c t i o n 缸w o o lk 既砒1w h e n m ec o n o 嘶缸琶：t i 嘶i sa t2 嘶l l b 鹊e d0 nm es d s p a g ee l e c 呐p h o r e s i s 强d 枷鼢r e d s p 咖s c o p 弘w ea l s op r o v t ：d 廿l em 7 l i c a t a l y z e d 他a c 虹o n so fc 弱e m s 戤l dw o o lk e 豫缸n s k e y w o r d l s ：i n i c f o b i a l 仃a 璐g l u t a m i n 勰e ；w 0 0 l ； m 弛o d ；e l 烈灯o p 目录 目录 摘要i a b s 仃a c t i 目录i 第一章前言1 1 1 酶及其在纺织中的应用l 1 2 转谷氨酰胺酶介绍及其特性2 1 2 1 转谷氨酰胺酶介绍2 1 2 2 转谷氨酰胺酶的来源及其制各2 1 2 3 转谷氨酰胺酶的特征性能2 1 2 4 转谷氨酰胺酶活性影响因素3 1 2 5 转谷氨酰胺酶在食品领域中的应用。4 1 2 6 转谷氨酰胺酶在蛋白质加工中的应用5 1 3 羊毛纤维及其性能6 1 3 1 羊毛纤维的化学组成6 1 3 2 羊毛的主要结构：6 1 3 3 羊毛的生物改性技术7 1 4 转谷氨酰胺酶在羊毛中的研究现状及其发展8 1 5 本课题的研究目的及意义8 第二章基本原理1 1 2 1 转谷氨酰胺酶的作用原理1 l 2 2 转谷氨酰胺酶作用羊毛纤维原理1 2 2 3 靛酚蓝显色原理。：1 2 2 4 高锰酸钾对羊毛的作用机理1 3 2 5d c c a 对羊毛的作用机理1 3 2 6s d s 队g e 电泳原理1 4 2 7 红外光谱原理1 4 第三章实验。15 3 1 实验材料1 5 3 2 实验仪器设备15 3 3 实验方法1 6 3 3 1 靛酚蓝法测氨浓度一吸光度标准曲线的制作1 6 3 3 2 酪蛋白和羊毛蛋白溶液的制备1 6 3 3 3 羊毛织物的高锰酸钾处理1 6 3 3 4 羊毛织物的d c c a 处理1 6 3 - 3 5 羊毛织物的m r g 酶处理1 6 3 3 6s d s - p a g e 电泳表征17 3 3 7 红外表征：17 3 4 测试方法17 3 4 1 断裂强力测试1 7 3 4 2 白度测试1 7 3 4 3m g 催化羊毛织物交联释氨量的测定1 7 3 4 4m g 催化蛋白质交联释氨量的测定1 7 第四章结果与讨论19 日录 4 1 缓冲液对靛酚蓝法测氨的影响1 9 4 2m t g 酶羊毛织物的催化交联释氨量的检测及其特征的变化1 9 4 2 1 经n 0 4 处理后的羊毛m t g 酶交联释放氨的测定及性能变化1 9 4 2 2 经d c c a 处理后的羊毛m t g 酶交联释放氨的测定及性能变化2 l 4 3m t g 酶催化酪蛋白和羊毛溶解蛋白反应释氨的测定2 3 4 3 1m t g 酶催化酪蛋白反应释氨量的测定2 3 d 3 2m t g 酶催化酪蛋白溶液反应释氨速度2 3 4 3 3m t g 酶催化羊毛溶解蛋白反应释氨量的测定2 4 4 3 4m t g 酶催化羊毛溶解蛋白溶液反应释氨速度2 5 4 4 还原剂d t t 对m t g 酶催化交联反应的影响2 5 4 4 1 还原剂对m t g 催化羊毛白交联反应的影响2 5 4 4 2 还原剂d t t 对m t g 催化酪蛋白交联反应的影响2 6 4 5s d s p a g e 电泳表征2 7 4 5 1m t g 酶催化羊毛溶解蛋白的s d s p a g e 电泳表征2 7 4 5 2m t g 酶催化酪蛋白的s d s p a g e 电泳表征2 8 4 6m t g 酶催化羊毛织物的红外表征2 9 第五章结论3 3 致谢3 5 参考文献一3 7 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文3 9 i i 第一章前言 第一章前言 羊毛是纺织工业重要原料，具有保暖性好，弹性好，不易沾污，光泽柔和，吸湿性 强等诸多优良品质。但是由于羊毛表面结构特殊性，导致羊毛纤维具有毡缩性，刺痒感 等缺点，严重影响毛织物的尺寸稳定性和风格【i 】。现行羊毛的改性整理工艺大多采用氯 化加树脂整理工艺，然而氯化中所产生的有机卤化物a o x 会严重污染环境，不符合“生 态纺织”的概念，因此研究羊毛无氯生态改性技术成为一项重要的领域。因此，蛋白酶、 等离子等各种新型的改性技术应运而生。蛋白酶改性技术是一种可替代氯化法的整理工 艺，符合“生态纺织”的要求，具有良好的防缩效果，并且对羊毛的柔软性，抗起毛起球， 低温染色，和生物抛光等方面都起到较好的作用。局限性是蛋白酶的处理，易使羊毛纤 维造成过度损伤而使织物减量率高，强力损失严重，过程难以控制。因此，需研究开发 新的生物酶制剂及其整理工艺，以弥补蛋白酶整理方面的缺陷【2 棚。转谷氨酰胺酶是一 种催化酰基转移反应的转移酶，可以催化蛋白质发生共价交联，蛋白质和氨基酸间的连 接以及蛋白质分子内部谷氨酸胺的水解，从而改善蛋白质的性能，目前广泛应用于食品， 医药等领域【s 】。该酶对蛋白质纤维的接枝改性作用，如对羊毛蛋白、丝蛋白的改性，正 逐渐被各国学者所关注。 1 1 酶及其在纺织中的应用 酶是一种由细胞产生的生物催化剂。酶的本质是由氨基酸组成的高分子化合物，因 此，它具有蛋白质的两性电解质性质，易受一些物理因素( 加热，紫外线等) 及化学因素 ( 酸、碱、金属离子、有机溶剂等) 作用而变性，丧失酶活。酶作为生物催化剂，具有三 个特性：专一性、高效性、反应条件温和。专一性体现在特定的酶只能作用于一种或一 类结构相似的底物，并催化某种类型的反应；高效性是指酶催化反应的速率极高，它的 催化作用要比_ 般的催化剂高1 0 6 1 0 ”；温和性指大多数酶催化反应均在常温常压的条 件下进行，因而容易控制，操作环境比较安全。根据国际酶学委员会的决定，将酶的催 化反应分为6 大类，分别为氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，合成酶【5 1 。 酶的催化反应机理：酶的作用机制概括的说，一般是通过其活性中心通常是氨基酸 侧链基团先与底物形成一个中间复合物，随后再分解成产物，并放出酶。酶催化某一特 定的化学反应是通过降低该反应的活化能实现的。它与底物的作用方式被喻为“钥匙锁 原理，先与底物形成酶底物络合物，改变底物能量，使其易于发生转变。反应结束后， 酶催化剂与其他所有的催化剂一样，仍保持其原状，并可进行更进一步的转化【5 】。因此， 只需要少量的酶便可以维持反应。影响酶催化反应的因素有，反应时间、温度、p h 值、 酶的浓度、反应物浓度以及酶活化剂和抑制剂。酶在纺织中的研究应用已经有很长的历 史，如纤维素酶生物抛光，淀粉酶退浆等，用于羊毛工业的主要为水解蛋白酶。蛋白酶 可改善羊毛织物毡缩、白度、手感、起毛起球等性能。酶在纺织加工中的应用可解决污 染及能源问题，且酶是天然化合物，反应专一，反应条件温和，副产品少，利于环保， 因此逐渐为人们所重视。 江南大学硕士学位论文 1 2 转谷氨酰胺酶介绍及其特性 1 2 1 转谷氨酰胺酶介绍 转谷氨酰胺酶( n a n s 酉u t 锄i n a s e ，简称t g a s e ，又称t g ) 是一类可催化蛋白质中赖 氨酸残基上的氨基和谷氨酰胺残基上丫羟酰胺基之间结合的聚合性酶，使蛋白质形成 共价交联【6 1 。羊毛蛋白中含有较为丰富的赖氨酸和谷氨酰胺，为酶的催比反应提供了先 决条件，利用转谷氨酰胺酶可以催化羊毛蛋白内部形成共价交联，对羊毛进行接枝改性， 从而改善羊毛的物理和化学性能【7 1 。 一般食品加工中所采用的酶，其作用原理在于把食品中比较粗糙的成分分解成较微 小的微粒。而转谷氨酰胺酶的作用原理却相反，它利用蛋白质与蛋白质之间会相互形成 共价键的特性，催化食品中蛋白质的聚合作用和交联作用【引。可以催化蛋白质分子内、 分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应， 从而改善蛋白质功能和性质，提高其营养价值。因此，转谷氨酰胺酶被认为是新世纪的 蛋白质交联剂，一种可生产出满足人们需要的新型蛋白质产品的酶制剂。 1 2 2 转谷氨酰胺酶的来源及其制备 转谷氨酰胺酶( t g a s e ) 是w a e l s c h 及其合作者在1 9 5 9 年首次发现的【6 】。很多年以来， 人们只能从动物组织中提取转谷氨酰胺酶，由于来源非常稀少，分离提纯工艺十分复杂， 因此该酶的价格比较昂贵。 直到1 9 8 0 年f o l k 总结出来源于哺乳动物转谷氨酰胺酶研究成果，指出转谷氨酰胺 酶存在于大量的生物体内，只要生物体内含有( 丫谷氨酰胺) 赖氨酸，该酶就肯定存在。 这一理论被广泛应用于筛选产转谷氨酰胺酶的微生物中，对转谷氨酰胺酶的工业化生产 起了巨大的推动作用【9 1 。1 9 8 9 年日本味之素公司和天野制药公司开始研究用微生物发酵 法生产转谷氨酰胺酶，并且于1 9 3 年向市场推出了商品化的转谷氨酰胺酶制剂，目前 已推出t g b 、t g f 、t g s 等不同用途的微生物转谷氨酰胺酶。 1 2 3 转谷氨酰胺酶的特征性能 转谷氨酰胺酶在动物、植物、微生物体内广泛存在，尽管有着大体类似的催化特性， 但由于其来源不同，因此在酶的氨基酸组成、理化性质等方面都有较大差异，具体性能 差异见表1 1 【1 0 j 。 2 第一章前言 表1 1 转谷氨酰胺酶的来源及理化特性 1 n l b i i 伽t g sp h 归i c ua i l dc h 锄i c i ip o p e 一篇o f d i 疵啪ts o u 1 2 4 转谷氨酰胺酶活性影响因素1 1 1 。1 3 l 1 2 4 1 转谷氨酰胺酶来源 d ej o n g 等采用p 酪蛋白作为底物交联的定量分析法对不同来源转谷氨酰胺酶的活 性进行了比较，研究发现来源于哺乳动物血浆和血红球中的转谷氨酰胺酶与来源于微生 物转谷氨酰胺酶相比较，后者能催化更多的底物蛋白质发现交联反应，活力更高。 1 2 4 2 蛋白质底物结构 转谷氨酰胺酶催化蛋白质发生催化交联反应的基本条件是蛋白质底物中需要足够 的能相互作用的赖氨酸和谷氨酰胺。某些蛋白质，如酪蛋白和明胶，在t g 酶的作用下 3 江南大学硕士学位论文 很容易发生催化交联，原因是它们含有大量的赖氨酸和谷氨酰胺，且能互相作用，而一 些食品中的蛋白质，如a 乳蛋白、p 乳球蛋白等较难被t g 酶催化交联，是因为它们的 结构紧密且更具有刚性，从而阻止了交联反应的进行。将一些具有还原性的物质添加入 t g 酶催化反应体系中，可通过改变蛋白质底物的结构而促进催化交联反应的进行。例 如在二硫苏糖醇( d 1 v r ) 的作用下，它能破坏蛋白质结构中的二硫键，使蛋白质暴露出更 多的反应活性基团，发生蛋白质共价交联。如0 【乳球蛋白和p 乳球蛋白中加入d t t 后， 均可在t g 酶的作用下发生催化交联作用。 1 2 4 3 金属离子 微生物转谷氨酰胺酶的活性不依赖c a 2 + 离子，但动物性的转谷氨酰胺酶活性对c a 2 + 离子具有明显的依赖性。由于食品中蛋白质如酪蛋白、肌蛋白、大豆球蛋白等对c a 2 + 敏感，在c a 2 + 作用下容易沉淀，会使动物性来源的转谷氨酰胺酶的反应活性降低，因此， 微生物来源的转谷氨酰胺酶对c a 2 + 的无依赖性能使在应用中更方便。而重金属离子 c u 2 + 、z n 2 + 、p b 2 + 等可与酶活性部位上半胱氨酸残基上的疏基结合，因而对微生物和动 物性来源的转谷氨酰胺酶活性均有明显的抑制作用。 1 2 4 4 其他因素 温度和p h 值都对t g 酶的活性有很大的影响。食品工业中，高温会改变蛋白质的 结构以及功能性质，过低或过高的p h 值会使蛋白质沉淀变性，因此这两种方法都不可 行。为了找到一种既能控制t g 酶的催化反应速度，又不会改变交联蛋白质的理化性质 的方法，而目前只有少数几种合成物抑制剂能起到这样的作用，如n 乙基一顺丁烯二 酰亚胺，对汞苯甲酸和二氯乙酰胺等。 1 2 5 转谷氨酰胺酶在食品领域中的应用 目前转谷氨酰胺酶已开始工业化大量生产，由于其特定的催化交联作用使得其在食 品业内得到迅速广泛的应用，并已取得非常良好的效果，具有十分广阔的应用前景。 1 2 5 1 在水产品加工内的应用 我国渔业资源非常丰富，水产品内含有大量的蛋白质，t g 酶在水产品中的应用已 经取得非常明显的效果，具有广泛的应用前景。目前，转谷氨酰胺酶在水产品中的应用 主要集中在增强鱼糜制品的弹性和增强凝胶强度等方面【1 4 ，1 5 】。除此之外，转谷氨酰胺酶 的另外一个用途就是作为新型蛋白质改良剂来重组低值水产品，提高其产品外观，风味， 质地及利用率。从而可提高产品附加值和市场价值。 1 2 5 2 在肉制品加工内的应用 肉制品一直都是人们获取蛋白质的主要来源。基于转谷氨酰胺酶能催化蛋白质形成 交联结构的特性，其可被广泛用于各种肉制品加工和重组中，可制得不同风味和形态的 食品。另外，在肉制品中添加转谷氨酰胺酶可以改进产品质地结构，增强保水性，提高 产品得率，提高产品的质量，提高原料利用率等【1 6 】。传统肉制品加工，常使用磷酸盐等 食品添加剂，改善肉质品粘着力，弹性等，但其会危害人体健康。转谷氨酰胺酶完全可 取代磷酸盐等常规的化学添加剂，达到同样的处理效果，并且对人体无害【l 7 i 。 4 第一章前言 1 2 5 3 在植物蛋白制品加工中的应用 使用转谷氨酰胺酶可以对植物蛋白，如酪蛋白、面筋蛋白、大豆蛋白等进行催化交 联。倪新华等应用转谷氨酰胺酶对面粉进行品质改良研究，结果表明转谷氨酰胺酶可催 化面筋蛋白形成( y 谷氨酰基) 赖氨酸共价键，从而明显改善面团的粉质性，使面团的 形成时间、稳定时间、断裂时间增加，面团的弱化度降低【1 8 】。此外，加酶面团的持水性 增加，面团表面粘性下降。而大豆蛋白经转谷氨酰胺酶改性后，其溶解性、对酸稳定性、 凝胶性、乳化性、乳化稳定性都得到提高。 1 2 5 4 在乳制品的加工中的应用 转谷氨酰胺酶在乳制品工业中应用广泛，具有良好的使用价值。乳制品中的洳酪蛋 白、肛酪蛋白、k 酪蛋白以及洳乳清蛋白、b 乳球蛋白等都是转谷氨酰胺酶的良好底物， 转谷氨酰胺酶可在相对比较宽的p h 值范围内( p h = 6 5 8 o ) 对乳品蛋白质进行交联，改善 其溶解性，乳化性，起泡性等性质【i 蛇。 1 2 6 转谷氨酰胺酶在蛋白质加工中的应用 1 2 6 1 提高蛋白质的乳化稳定性 转谷氨酰胺酶能提高蛋白质乳化稳定性。例如p 酪蛋白是转谷氨酰胺酶的良好底 物，经t g 酶催化交联作用，p 酪蛋白可形成二聚物、三聚物或多聚物，所形成的乳化 体系的稳定性得到明显改善，乳化稳定性随着聚合程度的增加而增加。分析天然肛酪蛋 白和p 酪蛋白聚合物的混合液乳化稳定性，发现随着混合液中聚合物比例增大，该混合 液的乳化稳定性明显增加f 1 9 刎。乳化稳定性提高的原因是因为多聚物p 酪蛋白分子粘弹 性比单体p 酪蛋白分子要高的多。p 酪蛋白形成多聚物后，产生支链基团，使蛋白质颗 粒的空间排斥力增强，因此界面蛋白质不易聚集。 1 2 6 2 改善蛋白质凝胶的特性 ：蛋白质经转谷氨酰胺酶催化交联作用后，引入了新的共价键，使得蛋白质分子内或 分子间的网络结构得到增强，从而使不容易形成凝胶的乳蛋白形成凝胶。蛋白质凝胶性 能的变化主要体现在凝胶强度的提高、凝胶耐热性和耐酸性得到增强、凝胶水合作用增 强，使凝胶网络中的水分不容易析出等【1 9 】。 1 2 6 3 提高蛋白质的热稳定性 高温加热处理容易使蛋白质变性，改变或降低其功能性质。在奶粉生产中，如何防 止奶粉在贮藏、销售过程中受热结块是个很重要的问题。t g 酶可应用在其中来降低奶 粉结块现象，这主要是因为奶粉结块与其玻璃化温度口蓟紧密相联，玻璃化温度越低， 越容易结块。奶粉经t g 酶作用处理后，其主要成分之一的酪蛋白在酶的催化作用下发 生分子间交联作用，形成网状交联结构，使得蛋白质的分子键能得到增大，其玻璃化温 度得到明显提高，从而其热稳定性能也明显提高【2 1 2 2 1 。 1 2 6 4 改善肉制品口感、风殊等特性 转谷氨酰胺酶可使肉制品中的许多蛋白质发生催化交联作用。因此，在肉制品重组 过程中使用转谷氨酰胺酶可发挥很好的作用。在重组肉制品中将各种非肉蛋白质通过交 堑堕盔堂堡主堂篁笙茎 联连接到肉蛋白上，从而可提高肉制品的口感、风味、组织结构和营养性等。交联的蛋 白质还能作为脂肪的替代物，生产低脂肉制品【1 5 】。此外，用转谷氨酰胺酶处理还可改善 肉制品的颜色外观。 1 2 6 5 提高蛋白质的营养价值 t g 酶可将某些限制性氨基酸交联到某种蛋白质上，从而提高此种蛋白质的营养价 值，这种方法与添加游离的氨基酸比较具有有两个优点：是可提高氨基酸的稳定性， 增强蛋白质的功能性；二是赖氨酸与蛋白质交联后，可以避免发生美拉德反应，防止营 养成分流失。 1 2 6 6 提高蛋白质的成膜性能 由于t g 酶可在一些蛋白质间或蛋白质内形成共价交联，产生自我支持的网络结构， 是制备可食性膜的良好材料。可食性膜可用于食品包装，控制水分、氧气、二氧化碳转 移，防止食品表面污染，防止脂肪氧化和挥发性j x l 昧物质损失等等【2 3 1 。 1 3 羊毛纤维及其性能 1 3 1 羊毛纤维的化学组成 羊毛纤维本质上是一类复杂的蛋白质化合物。其9 0 以上的重量为角质蛋白，角质 蛋白属有机高分子化合物，含有十八种氨基酸，其中每种氨基酸的含量如表1 2 所示。 每种蛋白质中基本都含有碳，氢，氧，氮四种元素，羊毛的角质蛋白和其他蛋白的最大 差异就在于角质蛋白中含有大量的硫元素。硫在羊毛中主要存在于胱氨酸和蛋氨酸内。 在羊毛蛋白的各种氨基酸中，含量最高的有胱氨酸，谷氨酸，精氨酸，亮氨酸，苏氨酸 和酪氨酸【1 1 。 表1 2 羊毛氨基酸成分分析 t a b 1 2t h e 锄m oa c i dc o n s t i t l l e n t sa j l a l y s i so fw o o l 1 3 2 羊毛的主要结构【2 4 ，2 s l 羊毛纤维主要由鳞片层，皮质层和髓质层构成。他们的细胞有细胞间质c m c 相互 第一章前言 隔离，并把细胞粘接在一起，其中鳞片层由片状角质细胞组成，属于羊毛纤维的外表皮 层。鳞片相互重叠覆盖，其根部附着于毛干，稍部则伸出毛干表面，并指向毛尖，它对 羊毛的物理和化学性质以及加工工艺方面起着非常重要作用。 鳞片层( 约占1 0 ) 在纤维皮质层外面，有片状角质细胞组成，并通过细胞间质c m c 相连，是羊毛纤维的保护性外壳。鳞片层细胞由性质不同划分为三部分：鳞片表层，鳞 片外层和鳞片内层。鳞片表层( e x i l i d e ) 位于鳞片层的最外面，其性质与一般细胞膜比 较相似，主要含有磷脂化合物，角质化蛋白质以及少量碳水化合物，具有非常好的化学 稳定性，是羊毛化学惰性的主要依赖部分。鳞片外层( e x o 训d e ) 是典型的角质化蛋白， 氨基酸残基( c y s ) 含量相当丰富，是羊毛结构中硫元素量含量最高的部位，结构紧密且难 以膨化，主要起保护毛干的作用。鳞片内层( e x d - 训d e ) 属于非角质蛋白，化学极性基团 如c o o h ，- n h 2 含量比较丰富，化学性质活泼，反应性极高。鳞片层虽然仅占羊毛总 量的1 0 左右，但是其结构特殊，耐化学性较好。由于鳞片层的结构特殊性，使其在羊 毛的性质中起正非常重要的作用。 皮质层由纺锤型细胞组成，是羊毛纤维的主干部分，是决定羊毛物理、机械和化学 性能的重要部分。羊毛纤维的皮质细胞，主要有o ( 伽l o ) 和p ( p 嬲1 ) 两种，他们在化学组 成上有一定的差异。o 皮质细胞含硫量较p 皮质细胞低，容易染色，对酶和一些化学药 剂的反应活泼性比较高。在品种优良的细羊毛纤维中，两种皮质细胞分别聚集在毛千的 两边，并且沿纤维轴向相互缠绕成为双边异构现象。 ， 细胞问质是由细胞膜复合物( c e l lm 陇l b r 锄c ec 伽叩l c x ) c m c 组成，每一部分又有极 其复杂的微细结构。c m c 结构存在于羊毛细胞( 包括鳞片细胞和皮质细胞) 之间，在整个 羊毛结构中呈网状分布，是羊毛细胞联接的桥梁，因而对羊毛的物理机械性能起着非常 重要的作用。细胞间质与羊毛纤维耐磨性有直接的联系，其主要成分是角质化蛋白质。 染料和其他助剂一般都通过该层进入到羊毛皮质层中，进而继续对羊毛纤维发生作用。 在羊毛纤维的改性过程中，为了保持羊毛的机械稳定性能达到一定的水平，必须对羊毛 细胞中的c m c 给予一定的保护。 髓质层是由结构疏松且内部充满空气的薄膜细胞所组成。细胞之间的联很微弱，因 而，含髓质多的羊毛弹性和强力都相对比较弱。 1 3 3 羊毛的生物改性技术 羊毛纤维改性主要是针对羊毛易毡缩，易起毛起球，有刺痒感等缺点而研究开发的。 传统的改性技术主要有氯化法，树脂法等。新型的羊毛改性技术有生物酶、超声波、等 离子技术等。氯化处理是最早的羊毛纤维的改性方法，目前仍广泛的应用于羊毛的改性 整理中。氯化法能有效地提高羊毛织物的毡缩性和服用性能，缺点是同时氯化剂会渗入 纤维皮质层，造成纤维的机械性能受损，强力损伤，织物泛黄，手感粗糙等问题【2 6 2 7 1 。 同时其氯化整理过程中所产生的有机卤化物a o x 对人体有害，且会严重污染环境，因 此研究替代氯化法的生态改性技术正是纺织工作者的重要研究方向。 树脂法主要是指通过高分子聚合物沉积于羊毛纤维表面，阻止纤维鳞片之间的相互 7 江南大学硕士学位论文 齿合，从而减小顺，逆鳞片的有效摩擦系数差。目前工业化上中的树脂整理工艺一般都 需要先经过氯化预处理之后，才能获得比较好的防毡缩效果，羊毛织物的硬挺度、断裂 强度和耐磨性也都获得提高。但其中的氯化预处理过程依然释放对人体有害的a o x 且 会污染环境。 羊毛的等离子体改性。羊毛织物经氮气或氧气的等离子体处理后，由于羊毛纤维表 面极性基团的引入和物理刻蚀作用，可有效地提高羊毛织物的防毡缩性能，同时羊毛的 强力，染料上染速率，染色牢度也都可得不同程度的提高，从而可实现低温染色【2 8 ，2 9 1 。 如果选用一些树脂和柔软剂对经等离子体处理的羊毛进行进一步后处理，那么可更进一 步提高羊毛织物的防毡缩性能和服用性能。 羊毛的蛋白酶改性整理。蛋白酶可起到水解部分羊毛鳞片蛋白的作用，减小鳞片层 间的定向摩擦效应，提高羊毛的防毡缩性能，同时还能提高羊毛白度，手感，染色性能 等。蛋白酶改性整理符合生态纺织的发展要求，但不足之处是，蛋白酶处理羊毛，会导 致作用不匀，水解不易控制，蛋白酶会直接通过细胞间质进入皮质层，从而使羊毛强力 下降较大。 1 4 转谷氨酰胺酶在羊毛中的研究现状及其发展 目前国内外有关转谷氨酰胺酶主要集中在食品工业方面，其在纺织上应用研究才刚 刚起步。英国诺丁汉大学的j o a 0 c o r t e z 教授等利用转谷氨酰胺酶处理羊毛织物，认为转 谷氨酰胺酶可以降低蛋白酶及碱性洗涤剂对羊毛的损伤，同时还具有一定的防缩效果 3 0 1 。s t l i r i e y vg e l n b e h 利用转谷氨酰胺酶催化交联的特性，把磷酸乙醇处理到羊毛纤维 上，磷酸乙醇胺和羊毛纤维的蛋白质形成了共价键【3 l 】。这为进一步利用转谷氨酰胺酶进 行羊毛织物的阻燃研究奠定了基础。国内也有一些学者开始研究转谷氨酰胺酶对羊毛性 能的影响。江南大学的崔莉利用转谷氨酰胺酶修复高锰酸钾和蛋白酶对羊毛的损伤【3 2 1 。 实验结果表明，经过高锰酸钾和蛋白酶处理后再用t g 处理的织物，与只经高锰酸钾和 蛋白酶相比，织物强力提高了3 0 ，面积毡缩率下降至2 3 0 ，并且处理液中的c o d 值只有树脂整理的1 3 。江南大学的卢雨正等用m t g 处理羊毛精纺织物，认为转谷氨酰 胺酶可以提高织物的尺寸稳定性，抗皱性，压烫性等一些性能【3 3 】。天津大学的侯学锋还 用转谷氨酰胺酶修复绵羊绒，驼绒在加工过程中的化学及机械损伤，经修复后的羊绒， 驼绒纤维的断裂强力均有不同程度的提高，并且机械性能也得到了一定的维持和改善 【3 4 o 对于转谷氨酰胺酶在羊毛纤维上的接枝改性研究还处在初级探讨阶段，并没有在工 业化中得到普遍采用。而对于转谷氨酰胺酶作用羊毛的机理，作用方式，影响因素及对 性能的影响还需我们做更深一步的研究。 1 5 本课题的研究目的及意义 羊毛生态改性技术是羊毛功能改性整理重要发展方向之一。转谷氨酰胺酶是一种转 移酶，通过催化肽键或蛋白基团内谷氨酰胺残基的y 酰胺基团和伯胺之间的酰基转移反 第一章前言 应，将蛋白质中氨基结合的赖氨酸残基，作为转谷氨酰胺酶的受体。因此可利用转谷 氨酰胺酶催化其内部形成共价交联，进而对羊毛接枝改性 本课题，从检测m t g 酶催化反应体系释放氨入手，通过对m r r g 酶催化羊毛释放 氨的测定来确定酶对羊毛的催化交联作用。首先确定用靛酚蓝分光光度法来测定m t g 酶催化反应所产生的氨，其检测精确度能达到l o 气帅l 。用该法来测定羊毛织物交联反 应释放氨，通过测氨与羊毛织物强力和白度的对比发现m r g 酶催化羊毛织物交联释放 氨较少，不易检测，然后通过对羊毛蛋白模拟物酪蛋白的m t g 酶交联释放氨的检测， 证实了m t g 酶对酪蛋白的催化交联作用，最后采用自制的羊毛蛋白溶液通过对其m t g 酶催化交联释氨的检测，证明了m t g 酶对羊毛蛋白溶液的交联作用，并且发现，还原 剂d t t 的加入能改变羊毛的蛋白质结构，促进m 陌g 酶对羊毛的催化交联作用。并且进 一步通过s d s p a g e 蛋白质电泳分离技术和红外光谱技术去证实m t g 酶对酪蛋白和自 制的羊毛溶解蛋白的催化交联作 1 0 第二章基本原理 第二章基本原理 2 1 转谷氨酰胺酶的作用原理 t g 酶能催化蛋白质分子内、分子间的交联，蛋白质分子和氨基酸之间的连 接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解【l i 】。它利用肽链上的谷氨酰胺残基的r 甲酰胺基做为酰基供体，而酰基受体可以是： ( 1 ) 多肽链中赖氨酸残基的氨基，形成蛋白质分子内和分子间的似谷氨酰基) 赖氨酸异肽键，使蛋白质分子发生交联。 孛m 1 一腿脚一跏旦 i n l 删跏峨 图2 一i 横向结合反应 f i 9 2 lh 妇a li n l e g 豫t i o n 溅蜘 ( 2 ) 伯胺基，形成蛋白质分子和小分子伯胺之间的连接，从而可将一些限制性氨基 酸引入蛋白质中。 i 1 g l p 1 妈嘲一? ”暮。脓喁 图2 2 酰基传递反应 f i 9 2 2a c y l 仃a 船缸凇c 如n ( 3 ) 当不存在伯胺时，水会成为酰基受体，结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成谷 氨酸残基。 驴嚣一啦+ 麟旦亭1 1 嘲吗 图2 3 脱爨基反应 f i 9 2 - 3a c y lo 行r e a c 6 0 n 江南大学硕士学位论文 图2 4 蛋白质交联模拟示意图【1 2 】 f i g2 _ 4t h es i m u l a t i o nd i a g r a mo fp r o t e i nc r o s s l i i l l 【s 2 2 转谷氨酰胺酶作用羊毛纤维原理 羊毛蛋白中含有丰富的谷氨酰胺和赖氨酸，谷氨酰胺的含量为4 5 0 u m o 垤， 赖氨酸含量为2 6 0 啪o l 詹为转谷氨酞胺酶催化交联提供了丰富的底物。在转谷 氨酰胺酶的作用下，谷氨酰胺和赖氨酸在蛋白质分子间或分子内形成“谷胺酰 基) 赖氨酸键( 图2 2 所示) ，从而影响和改变羊毛纤维性能。 一亘一一l c = o n h l l y s 图2 5 谷氨酰胺与赖氨酸交联示意图 f i 9 2 5t h e c r o s s l i l l l ( sb e 似e e ng l na n dl y s 2 3 靛酚蓝显色原理 氨在硝普钠( 亚硝基铁氰化钠) 的催化下与碱性次氯酸盐和苯酚反应形成蓝 色的靛酚，氨的摩尔浓度与靛酚的吸光度值成正比【3 5 - 3 6 1 。 第二章基本原理 n h 3 十o c r n h 2a + 0 h 。 。一o + m c l + 3 0 h 丽丽丽p o n c + 3 h 2 0 。一。一眦+ 旷。一。一。一肛。一+ 删 一 盯 。一o i n o o h + c i 一 图2 _ 6 靛酚蓝显色反应原理 f i 9 2 - 6 m 呻c i p l e 讯丑0 岫ib l c o l 甜础枷 2 4 高锰酸钾对羊毛的作用机理 高锰酸钾与羊毛作用，可断裂水解羊毛纤维外角质层的二硫键，肽键，其反 应式如图2 7 所示【3 ”引。二硫键、肽键被氧化成的亲水性基团s 0 3 h ，c o o h ， 小m 3 + ，- s h 等，由于亲水性基团的吸水作用，使得鳞片软化变形，顺逆摩擦系 数差值减小。高锰酸钾与纤维作用后生成褐色m n 0 2 ，可用n a h s 0 3 将其去除。 0 1 w s s w 二- 2 w s 0 3 h 一垦一一垦一+ l l 【o 】 一l | 一n h + m ，+ e n h 啼 u u 几。l 、n 1 f i g2 - 7t 1 1 ep 血c i p i eo f w d o l sp o t a s s i u mp a m n g 卸吡i t eo x “l a 6 0 n 2 5d c c a 对羊毛的作用机理 + h 2 0+ 2 h o c l 图2 8d c c a 水解原理 f i g2 - 8 1 1 1 ep 血c i p l eo f d c c a sh y d m l ) ，s i s 氯化剂二氯异氰脲酸钠( d c c a ) 在成衣防缩处理中获得广泛的应用，d c c a 在有水存在时，发生水解平衡反应，水解生成的h o c l 释出较低的有效氯与羊毛 缓慢反应。 h 喇 、 夕 o k _ 、 夕 。- 八 、 刚 0 江南大学硕士学位论文 2 6s d s p a g e 电泳原理1 3 9 l 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺在催化剂 的作用下，聚合交联形成的具有网状结构的凝胶，并以此为支持物进行蛋白质电 泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子量的不同所 产生的迁移率不同将蛋白质分离成若干条区带。 s d s 是一种阴离子表面活性剂，其能破坏蛋白质的氢键和疏水键，并按一定 的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有 的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质一s d s 复合 物在电泳时的迁移率，将不再受原有电荷的影响，而只是与分子大小有关。这种 电泳方法称为s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( 简称s d s p a g e ) 。由于s d s p a g e 可 设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此 常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有 一种具三级结构的蛋白质或含有相同分