（核能科学与工程专业论文）离子束选育高产l乳酸菌种及米根霉代谢调控的研究.pdf

摘要 离子束培育高产l 一乳酸菌种的研究 葛春梅( 核能科学与工程) 导师：余增亮研究员 ( 中国科学院离子柬生物工程学重点实验室，安徽合肥2 3 0 0 3 1 ) - 本文根据育种理论和发酵工程理论，对l 一乳酸生产菌种的选育、发酵法生产 l 一乳酸进行了系统的研究。采用离子束诱变育种技术，以突变株r e 3 3 0 3 为出发 菌株，在研究其菌种特性及其发酵工艺的基础上，获得耐高温菌株r f 9 0 5 2 ， 该菌 在1 5 的葡萄糖浓度，4 0 - - 一4 5 c 温度条件下，3 6 4 0 h 产酸能力达到1 3 3 - - - 1 3 8 9 l ： 为了更进一步降低成本，将碳源由葡萄糖改为玉米粉液化液，再利用离子束诱变 育种技术，并最终筛选到乳酸生产能力和对糖转化率与原有菌株相比有较大幅度 提高的高产菌株r l c 4 1 - 6 ，该菌在1 5 的玉米液化液( 以葡萄糖计算) 浓度下，产 酸能力达到1 3 8 9 l ，对糖转化率为9 2 ，体积产酸速率达3 8 3 9 ( l h ) 。 1 论文介绍了国内外乳酸生产和应用状况及离子束生物工程学的创立、发 展和最新的研究动态。 2 报道了米根霉p w 3 5 2 和r e 3 3 0 3 的发酵工艺，发酵产酸过程与产l d h 之间 的关系。根据两株菌的发酵产酸结果，选用r e 3 3 0 3 作为耐高温菌以及高产糖化酶 和高产l - 乳酸菌的出发菌株。r e 3 3 0 3 在4 0 c ，1 5 的葡萄糖浓度下，产酸9 0g l ， 4 5 产酸7 3g l ；以1 2 玉米液化液( 以葡萄糖计算) 为碳源，3 6 条件下发酵， 产酸为9 0 - - - 9 3 9 l 。 3 报道了离子注入的能量、剂量等对米根霉存活率及突变率的影响，确定了 合适的矿离子诱变参数：能量l o , 一1 5 k e v ，剂量4 0 x 2 6 1 0 协i o n s c m 2 - - 6 0 x 2 6 1 0 h i o n s c m 2 。总结了诱变筛选的工艺流程，考察了诱变筛选的方法，经过离子 注入处理，筛选到耐高温菌株r f 9 0 5 2 及糖化酶和l 一乳酸高产的菌株r l c 4 1 - 6 ， 都具有很好的遗传稳定性。 4 对菌株r f 9 0 5 2 和r l c 4 1 - 6 的发酵工艺进行了优化。确定了其发酵产酸条 件。r f 9 0 5 2 在1 5 0 9 l 葡萄糖，( n h l ) ：s 仉3 o g l ，m g s o , 7 h 。00 0 7 5 9 l ，z n s o - 7 h ：0 离子束选育高产l - 乳酸菌种及米根霉代谢调控的研究 0 2 9 l ，k h ：p o 。0 3 9 l ，c a c o 。7 0 9 l 的发酵培养基中，接种4 m l 的培养1 2 小时的 种子液，3 0 m l 2 5 0 m l 装液量，在4 0 , - - - 4 5 ，2 0 0 r m i n 的条件下培养3 6 - 4 0 h ， 产酸可维持与r e 3 3 0 3 相当的水平，但最适发酵的温度范围则变为3 6 - 4 0 c 。 r l c 4 1 - 6 在1 5 0 9 l 玉米液化液( 以葡萄糖计算) ，( n h 4 ) ：s 0 1 5 9 l ，m g s o 7 h ：0 1 o g l ，z n s o , 7 h z 00 2 9 l ，k h ：p o , 0 2 9 l ，c a c 0 37 0 9 l 的发酵培养基中，接种 2 m l 培养6 小时的种子液，在3 8 c ，3 0 m l 2 5 0 m l 装液量，2 0 0 r m i n 的条件下培养 3 4 _ 3 6 h ，产酸可维持在1 3 3 - 一1 3 8 9 l 之间，体积产酸速率为3 8 3 9 l h ，较出发 菌株产酸提高了5 3 。 5 对玉米粉的处理方法做了研究，得出经过液化的培养基有利于发酵和加速 产酸的过程，不经液化的发酵液粘稠影响氧和营养物质的传递和吸收，产酸慢， 即使加入糖化酶与米根霉产生的糖化酶一同水解淀粉分子，也不能明显地提高产 酸速率。 6 论文第七章介绍了发酵液中的无机盐离子对发酵产酸的影响，得出合适的 无机盐可以抑制杂酸的产生，促进乳酸的生成，使生成的乳酸达到很高的纯度。 l ( h ：p o | 浓度在0 3 - - 0 4 ，m g s o 。浓度在0 0 7 5 0 1 2 5 ，z n s o 浓度在o 0 1 5 0 0 2 的范围内，富马酸等杂酸基本被抑制，发酵的过程沿着产l 一乳酸的方向。 7 通过对p w 3 5 2 ，r e 3 3 0 3 ，r f 9 0 5 2 ，r l c 4 1 - 6 四株菌产酸过程与分泌乳酸脱 氢酶过程关系的研究，得出在离子束诱变米根霉筛选高产l 一乳酸菌种的过程中， l d h 活性与l _ 乳酸的生成成正相关性。经离子束修饰的米根霉菌株r e 3 3 0 3 ，r f 9 0 5 2 ， r l c 4 1 - 6 ，与原始出发菌株相比，生成乳酸的关键节点丙酮酸代谢节点以及关 键酶一乳酸脱氢酶发生了变化。从l d h 对底物l ( i i l 值的变化，说明由于离子束的 修饰作用，使得修饰后的菌株对辅酶n a d h 的依赖性降低，而对底物丙酮酸的亲和 力增加，这与被离子束修饰后的菌株产酸能力增强的结果是一致的。从l d h 同工 酶的变化来看，由于离子束的修饰作用，使得l d h 在分子水平上发生了变异，这 可能是为了更适应有利于l 一乳酸生成的代谢过程而引起的一种分子进化。 关键词：米根霉l 一乳酸离子注入诱变选育发酵工艺优化乳酸脱氢酶 代谢调控 n a b s t r a c t s c r e e n i n go fl ( + ) 一l a c t i ca c i dh i g h - p r o d u c t i n gr h i z o p u so r y z a eb y i o ni m p l a n t a t i o n c h u n m e ig e ( m a j o r ：n u c l e a rs c i e n c e & e n g i n e e r i n g ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rz e n g l i a n gy u ( k e yl a b o r a t o r yo fi o nb e a mb i o e n g i n e e r i n g ，c h i n e s ea c a d e m yo fs c i e n c e s ，h e f e i ， p r c h i n a ) a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h es t r a i nb r e e d i n gt h e o r ya n df e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n gt h e o r y , t h e s e l e c t i o na n db r e e d i n go fl l a c t i ca c i dp r o d u c i n gm u t a n ta n dt h ef e r m e n t a t i o n t e c h n o l o g yo fl - l a c t i ca c i dw e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e di nt h i st h e s i s b a s e do nt h e i n v e s t i g a t i o no fc h a r a c t e r i s t i ca n df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o no ft h em i d d l e m u t a n tr e 3 3 0 3 ， m u t a g e n i cb r e e d i n gw a s t a k e nb yt h em e t h o do f 矿i o n si m p l a n t i n gi nt h i st h e s i s 1 1 l e s t r a i nr f 9 0 5 2a n dr l c 41 6w e r eo b t a i n e d t h es t r a i ni 强9 0 5 2 ，w h i c hl a c t i ca c i d p r o d u c t i o na n dc o n v e r s i o nr a t et og l u c o s ew e r e13 3t o 13 8 9 n 。y i e l do fl a c t i ca c i da n d 8 8 t o9 2 a t4 阻4 5 n l es t r a i nr l c 4 1 - 6w a sg a i n e d 。w h i c hl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n a n dc o n v e r s i o nr a t et og l u c o s ew e r em u c hh i g h e rt h a no r i g i n a ls t r a i nr e 3 3 0 3 13 3t o 13 8 9 ly i e l do fl a c t i ca c i da n d8 8 t o9 2 c o n v e r s i o ne f f i c i e n c yt og l u c o s ew e r c c a r d e do u tb yt h es t r a i nr l c 4 1 6i n15 0 9 ll i q u e f i e dc o r ns t a r c h ( c a l c u l a t e da sg l u c o s e ) f e r m e n t a t i o nm e d i u m f i r s t l y , t h eu s e sa n dp r o d u c t i o no fl a c t i ca c i dw e r er e v i e w e d ，a n dt h ef o u n d a t i o n , d e v e l o p m e n ta n dr e s e a r c hp r o g r e s so fb i o - e n g i n e e r i n go f i o nb e a mw e r ei n t r o d u c e d s e c o n d l y , 足o r y z a ep w 3 5 2a n dr e 3 3 0 3f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n dt h e r e l a t i o n s h i po fl l a c t i ca c i da n da c t i v i t yo fl d hw e r er e s e a r c h e d b a s e do nt h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no ft h ep w 3 5 2a n dt h er e 3 3 0 3 ，m u t a g e n i cb r e e d i n gw a st a k e n b y 也em e t h o do f 矿i o n si m p l a n t i n g r e 3 3 0 3w i t hc a p a c i t yo fl a c t i ca c i dp r o d u c t i o n w a s9 0g la t4 0 ，7 3g la t4 5 i n2 5 0 r a le r l e n m e y e rf l a s k sc o n t a i n i n g5 0 m l f e r m e n t a t i o nm e d i u ml a c t i ca c i dy i e l dw a s9 0t o9 3 9 la t3 6 o nar o t a r ys h a k e ra t 2 0 0 r r a i nf o r3 6 h o f15 0l i q u e f i e dc o r ns t a r c h ( c a l c u l a t e d 锻g l u c o s e ) i nc h a p t e rt h r e e ，s t u d i e da b o u tt h ee f f e c t so nt h es u r v i v a lr a t ea n dt h ep o s i t i v e m u t a t i o nr a t eb yi o ni m p l a n t a t i o n 谢n ld i f f e r e n tp a r a m e t e r s n er e s u l t ss h o w e dt h e o p t i m i z a t i o n a lp a r a m e t e r s 嬲f o l l o w i n g ：i o nt y p e - n + i o n ；e n e r g y - 10 15 k e v , d o s a g e i i i 离子柬选育高产l 孥l 酸菌种及米根缳代谢调控的研究 r a n g eo fi o ni m p l a n t a t i o n ：1 0 4 ) c 1 0 1 5 i o n s c m 2 1 5 6 x 1 0 t s i o n s c m 2 b yal a r g en u m b e r o fs c r e e n i n g s ，t w os t r a i n sr f 9 0 5 2a n dr l c 41 - 6w a ss e l e c t e d s t u d i e ss h o w e dt h a t l 强9 0 5 2a n dr l c 41 6h a sag o o dg e n e t i c a ls t a b i l i t y t h e n , t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ei t f 9 0 5 2a n dr l c 41 - 6w e r es t u d i e di nt h e f o u r t ha n ds i x t hp a r t a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t so ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n , t h eo p t i m u mm e d i u m ( g l ) f o rr f 9 0 5 2f e r m e n t a t i o nc o n s i s t so f15 0g l u c o s e ，3 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，0 2z n s 0 4 7 h 2 0 ，0 3k h 2 p 0 4 ，0 0 7 5m g s 0 4 7 h 2 0 ，e x c e s s i v ec a c 0 3 i n 2 5 0 m le r l e n m e y e rf l a s k sc o n t a i n i n g3 0 r n lf e r m e n t a t i o nm e d i u ma n di n o c u l a t i n g4 m l s e e dc u l t u r eb r o t hw h i c hh a dg r o w nf o r1 2 h ，l a c t i ca c i dy i e l dw a se q u t et or e 3 3 0 3a t 3 6 4 5 o nar o t a r ys h a k e ra t2 0 0 r m i nf o r3 6 - - 4 0 h a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t so ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n , t h eo p t i m u mm e d i u m ( g l ) f o ri t sf e r m e n t a t i o n c o n s i s t so f15 0l i q u e f i e dc o ls t a r c h ( c a l c u l a t e da sg l u c o s e ) ，1 5 ( n h 4 ) 2 8 0 4 ，0 2 z n s 0 4 7 h 2 0 ，0 2k h 2 p 0 4 ，1 0m g s 0 4 7 h 2 0 ，e x c e s s i v ec a c 0 3 i n2 5 0 m le r l e u m e y e r f l a s k sc o n t a i n i n g3 0 r a lf e r m e n t a t i o nm e d i u ma n di n o c u l a t i n g5t o1o s e e dc u l t u r e b r o t hw h i c hh a dg r o w nf o r6 kl a c t i ca c i dy i e l dw a s1 3 3t o1 3 6 9 la t3 8 co nar o t a r y s h a k e ra t2 0 0 r m i nf o r3 4 - - 3 6 h ，i n d i c a t i n gt h a tt h ec o n v e r s i o nr a t ew a s 弱h i 曲a s 8 8 * , - , 9 1 ，a n dt h ep r o d u c t i v i t yw a s3 s 3 9 l h t h e r ew a sa l m o s ta5 3 i n c r e a s e m e n t i nl a c t i ca c i dp r o d u c t i o nc o m p a r e d 、i t l lt h eo r i g i n a ls t r a i nr e 3 3 0 3 e f f e c t so fd i f f e r e n tt r e a t m e n tw i t hc 0 1s t a r c hw e r ea l s os t u d i e di nt h i sa r t i c l e r e s u l t s s h o w e dt h a tl i q u e f i e dm e d i u mc o u l df a v o rf e r m e n t a t i o na n da c c e l e r a t el a c t i ca c i d p r o d u c i n gp r o c e s s ，w h i l et h eu n l i q u e f i e df e r m e n t a t i o nm e d i u mw o u l da f f e c tt h er a t eo f a c i dp r o d u c i n g ，f o rt h e yw e r es t i c k ys ot h a tt h et r a n s p o r t a t i o na n da b s o r p t i o no fo x y g e n a n dn u t r i e n tw o u l db ei n f l u e n c e d e v e n t h o u g ha d d e db yg l u c o a m y l a s ew i t h g l u c o a m y l a s ea b i l i t yo f 足o r y z a et oh y d r a t et h es t a r c hm o l e c u l e s ，t h e yc o u l dh a r d l y i n c r e a s et h ea c i dp r o d u c i n gr a t eo b v i o u s l y i nc h a p t e rs e v e n , i n o r g a n i cs a l ti o n s e f f e c t so na c i dp r o d u c i n gw e r ei n t r o d u c e dt o s h o wt h a ta p p r o p r i a t es a l ti o n sc o u l di n h i b i tt h ef o r e i g na c i dp r o d u c t i o nb u tp r o m o t e l a c t i ca c i ds y n t h e s i s ，t h es y n t h e s i z e da c i d s p u r i t yw e r ev e r yh i g h i ft h e c o n c e n t r a t i o no fk h 2 p o ，m g s 0 4 ，z n s 0 4w a sc o n t r o l l e di n t h e f o l l o w i n gr a n g e s ， 0 3 - 0 4 ，0 0 7 5 一0 12 5 ，o 015 - 0 0 2 r e s p e c t i v e l y , t h ef o r e i g na c i d sl i k e f u m a r a t ee r e w o u l db em o s t l ys u p p r e s s e da n dt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s sw a sg e n e r a l l y i v a b s t r a c t o nt h ew a yo fp r o d u c i n gl l a c t i ca c i d t h r o u g ht h es t u d yo fr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea c i dp r o d u c i n gp r o c e s sa n dt h e l a c t i cd e h y d r o g e n a s es e c r e t i n gp r o c e s so ft h ef o u rs t r a i n s ，p w 3 5 2 ，r e 3 3 0 3 ，r f 9 0 5 2 ， r l 41 6 ，ac o n c l u s i o nc o u l db ed r a w nt h a ti nt h ec o u r s eo fm u t a g e n i z i n gr h i z o p u s o r y z a eb yi o n si m p l a n t i n ga n ds e l e c t i n gl ( + ) - l a c t i ca c i dh i 曲- p r o d u c i n gs t r a i n s ，t h e l d h sa c t i v i t yh a dp o s i t i v ec o r r e l a t i o n 、析t l ll l a c t i ca c i dp r o d u c t i o n b yc o n t r a s to f r h i z o p u so r y z a em o d i f i e db yi o n si m p l a n t i n gw i t ht h e i ro r i g i n a ls t r a i n s ，t h e i rc r i t i c a l p o i n to fp r o d u c i n gl a c t i ca c i d p y r u v i ca c i dm e t a b o l i s mp o i m a n dt h e i rc r i t i c a le n z y m e s - l a c t i cd e h y d r o g e n a s eh a dc h a n g e d t h ec h a n g eo fl d h sk r nv a l u ef o ri t ss u b s t r a t e s u g g e s t e dt h a tt h em o d i f i e ds t r a i n s d e p e n d e n c eo n t h ec o e n z y m e n a d hw a sw e a k e n e d ， b u tt h e i ra f f i n i t yf o rp y r u v i ca c i dw a ss t r e n g t h e n e d t h i sw a sc o n s i s t e n t 、i t l lt h ea b o v e r e s u l tt h a tt h ea c i dp r o d u c i n gc a p a b i l i t yc o u l db ee n h a n c e da f t e rb e i n gm o d i f i e db yi o n s i m p l a n t i n g i na d d i t i o n ，t h ec h a n g eo f l d h i s o e n z y m es h o w e dt h em o d i f i c a t i o no fi o n s i m p l a n t i n gb r o u g h to ns o m ev a r i a t i o no fl d h o ni t sm o l e c u l a rl e v e l i tw a sp e r h a p sa k i n do fm o l e c u l a re v o l u t i o nc a u s e dt oa d a p tt ot h em e t a b o l i s mw h i c hp r o m o t e dl - l a c t i c a c i dp r o d u c i n g k e y w o r d s ：r h i z o p u so r y z a el ( + ) l a c t i ca c i d ；i o n si m p l a n t a t i o n ；s c r e e n i n g ； f e r m e n t a t i o na n do p t i m i z a t i o n ：l d h ；m e t a b o l i cr e g u l a t i o n v 笫一章前言 第一章前言 乳酸在食品工业，医药化工领域，绿色环保塑料，环保纤维中的应用已经成 为世界关注以及研究的热点问题。随着石油资源的日渐枯竭和“白色污染 的泛 滥，生物转化生产的以聚乳酸( p l a ) 为代表的可降解塑料取代石油源高分子塑 料的技术变革可能提早到来。作为p l a 的前体，l 一乳酸的高效生物合成直接关系 到p l a 的成本和质量，大量低成本，高品质的乳酸的生产已经成为制约聚乳酸产 业发展的关键因素。 第一节乳酸的研究概况 乳酸最初是由酸牛奶中得到的，故因此而得名j 它是牛奶中含有的乳糖受微 生物的作用分解而成的。蔗糖发酵也能得到乳酸。人体在运动时，肌肉里便有乳 酸积存，经休息后，肌肉里的乳酸就转化为水，二氧化碳和糖。早在1 8 4 1 年b o u t r o n 和f r e m y 采用自然发酵生产乳酸，至u 1 8 8 1 年美国c h a r l e se a v e r y 公司实现了 纯种发酵工业化生产乳酸乜m 1 。而大规模工业化生产乳酸是在上世纪9 0 年代初期 形成的“3 。乳酸被广泛应用于食品、医药、制革、纺织、卷烟工业、化学工业、 环保和农业等领域。 1 1 乳酸的性质 1 1 1 乳酸的分子结构 乳酸，英文名l a c t i ca c i d ，学名a 一羟基丙酸( a - h y d r o x y p r o p a n o i ca c i d ) ， 分子量为9 0 0 8 ，是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微 生物中啪们。乳酸分子内含有一个不对称的c 原子，因此具有旋光性，从而具有d - 型和l - 型两种构型m 。l 一乳酸是右旋，d 一乳酸为左旋的，d l - 孚l 酸是消旋的，其 结构式如下： c o o h l h - ( _ o h i c h 3 c o o h l h o 一| - h | 1 0 i c h s l ( + ) 一乳酸( 右旋) d ( 一) 一乳酸( 左旋) 图1 1 乳酸异构体的结构式 f i g 1 1s t r u c t u r a lf o r m u l ao fi s o m e ro f l a c t i ca c i d 离子柬选育高产l 乳酸菌种及米根稼代谢调控的研究 1 1 2 乳酸的理化性质 乳酸异构体的理化性质如表卜l 所示叭引： 表1 1 乳酸异构体的理化性质 t a b l e1 1p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so f i s o m e ro fl a c t i ca c i d 构型 熔点 沸点比旋光度【c c 】d 2 0解离常数熔化热( k j m 0 1 ) 溶解度g 1 0 0 9 水 l2 5 2 6+ 3 31 3 7 * 1 0 _1 6 8 7 d2 5 2 63 31 3 7 * 1 0 _1 6 8 7一 d l 1 8 1 2 2 ( 1 8 6 6 s p a ) o1 3 7 1 0 。1 1 3 5 通常乳酸为无色透明或浅黄色糖浆状的粘性液，几乎无臭或微带有脂肪酸 臭，味酸，其浓溶液有腐蚀性。与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶， 它几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯，相对密度1 2 4 9 嘲，沸点1 2 2 c ( 2 k p a ) ， 常压沸点1 9 0 。 乳酸分子中同时含有羧基和羟基两个极性基团，它们都能与水形成氢键，所 以易与水互溶，不易结晶出来。乳酸浓度达6 0 以上有很强的吸湿性，商品乳酸 通常为6 0 溶液，药典级的乳酸含量为8 5 0 - - 9 0 0 ，食品级的乳酸含量为8 0 以上m 1 。 在6 7 - - - 1 3 3 p a 的真空条件下反复分馏，可以得到高纯度的乳酸，进而获得单 斜晶体的结晶乳酸。但乳酸属于热敏性物质，为保证乳酸无明显的分解，蒸馏温 度不得超过1 3 0 。 羟基酸有一个羟基和一个羧基，由于羟基的吸电子效应，羟基酸的酸性比相 应的羧酸强，所以乳酸的酸性比丙酸强。乳酸还可以参与许多反应。如氧化反应、 还原反应、缩合反应和酯化反应等m 嗍。 1 2 乳酸应用 乳酸在食品、医药、化工、环保等领域有广泛的用途。l 乳酸的生产及其聚 合物作为可降解塑料和医用材料的研究日益深入。d - 乳酸的聚合物亦可以用于药 物的缓释技术和可降解环保农药的前体物。因此，高光学纯度的d 一乳酸或l 一乳酸 均具有广阔的应用前景。 1 2 1 乳酸在食品工业中的应用 目前在世界乳酸总消费中，食品工业约占6 0 ，由于乳酸的酸性柔和且稳定， 有助于食品的风味，在食品工业上广泛用做酸味剂、防腐剂和还原剂。又由于人 2 第一章前言 体内缺乏d 一乳酸代谢酶，只能利用l 一乳酸，不能代谢d 一乳酸。摄入d 一乳酸或 者d l 一乳酸将会导致血液中富含d 一乳酸，轻者引起疲劳，重者引起代谢紊乱， 出现酸中毒，世界卫生组织( w t o ) 限制人体对d 一乳酸的摄入，禁止d 一乳酸和 d l 一乳酸加入到婴幼儿食品中。因此l 一乳酸将在食品工业中逐渐取代d 型乳酸和 d l 型乳酸。表i - 2 反映的是乳酸在食品工业中的应用情况嘲。 表1 2 乳酸在食品工业中的应用 t a b l e1 2a p p l i c a t i o no fl a c t i ca c i di nt h ef o o di n d u s t r i e s 名称用途 乳酸 l 一乳酸 d l - 乎l 酸 l 一乳酸钾 l 一乎l 酸钙 l - * l 酸钠 l - 乳酸锌 l - * l 酸亚铁 l - * l 酸镁 l - * l 酸铜锰锘镍锶 乳酸酯类 乳酸乙酯 乳酸正丁酯 丁酰乳酸丁酯 脂肪酸的乳酸酯 乳酸脂肪酸丙二醇 脂肪酸的甘油乳酰酯 其他 硬脂酰- 2 - 季l 酸钙 硬脂酰- 2 - 尊l 酸钠 聚l 一乳酸 抗菌剂防腐剂、熏制、腌菜、风味剂、p h 调节剂、酸味剂 增味剂、配科、p h 控制、溶剂和载色体乳酸盐类 风味增强剂、风味剂、保湿剂、- p h 控制 风味增强剂、固化剂、膨松剂、营养补充剂、稳定剂、增稠剂 调味剂，乳化剂、湿润剂、稀释剂、p h 调节剂、增香剂、缓冲剂 和抗氧化增效剂等 营养强化剂 营养补充剂、婴幼儿食品 缓冲剂、面团调节剂、营养补充剂 微量元素强化剂( 运动保健饮料，果汁、沈食配方食品等) 具有较强的酒香味，食用香精、酒用香精等 呈甜奶油香味，焙烤食品的品质改良剂、保湿剂 食用香精、具柔和的奶油和烤面包香气 乳化剂、增塑剂、表面活性剂、稳定剂、发泡剂 乳化剂、增塑剂，表面活性剂、稳定剂、发泡剂 乳化剂、增塑剂、表面活性剂 焙烤食品用、面团质量改进剂、蛋制品中的起泡荆 面团质量改进剂、乳化剂、焙烤食品加工剂、牛奶或冰淇淋代用 品的稳定剂、加工助剂、休闲食品调味剂、人造奶酪调味剂 购物袋、保鲜膜、包装薄膜、餐盒、方便面碗、食品用金、餐巾、 桌布、冷热饮杯、瓶类、桶、罐、发泡片材等 1 2 2 乳酸在医药业和农业中的应用 乳酸，特别是l 一乳酸，对人畜无害，而且具有很强的杀菌作用，其杀菌作 用几倍的高于柠檬酸、酒石酸、琥珀酸，可以用作手术室、病房、试验室、车间 等场所的消毒剂h 1 。由于乳酸分子内具有羟基和羧基，充分脱水能完全聚合成聚 乳酸，加热让其自动酯化，可形成乳交酯。从乳酸的丙交酯二聚物出发可合成聚 丙交酯，从丙交酯和乙醇的乙交酯二聚物出发可以合成丙交酯一乙交酯共聚物。 这些聚合物具有良好的生物相容性，生物可降解性，用于制备外科手术用的缝合 线、纤维包扎、创伤夹、内置器、骨板、药物长效缓释制剂的载体以及其他医用 3 离子柬选育商产l 乳酸菌种及米根禧代谢调控的研究 材料n 钔。2 一l o 个l 一乳酸分子的聚合体，是良好的植物生长调节剂1 。聚乳酸的 应用价值还在于作为农药和药物的可控制释放体系。可作为水果、蔬菜以及其他 农作物的混合覆盖降解地膜。在将来有可能代替目前困扰世界各国的白色热塑污 染产品，成为名副其实的“绿色 环保制品n 羽。 1 2 3 乳酸在化学工业中的应用 乳酸添加于烟草中，能保持烟草的湿度，提高卷烟的质量。乳酸可用于制革 工业中的脱石灰，它能使石灰变成可溶性的乳酸钙盐而除去，使皮革柔软、细密， 从而制成高级皮革。乳酸还可用来处理纺织纤维，可使之易着色，增加光泽，触 感柔软。l 一乳酸的乙基乳酸酯作为“绿色溶剂 可以取代氯化烃溶剂，在电子 学、航空和航天以及半导体工业中作为精细金属清洁剂n 引。由于l ( + ) 一乳酸是 皮肤固有天然保湿因子的一部分，在化妆品和清洁卫生用品方面，乳酸和乳酸钠、 乳酸钙可提供保湿方面的性能。酰基乳酸酯是化妆品和保养用品中有效的乳化 剂、物料填充和稳定剂，可改进由于老龄而造成的皮肤结构和外表的老化，起到 保护皮肤的作用。 1 2 4 乳酸在生产可再生塑料代替传统聚乙烯材料中的作用 2 1 世纪，针对人口、资源、环境等诸多挑战，各国政府、企业和学术界充分 认识到以石油为代表的化石资源日益枯竭问题的严重性，寻求各种石油替代途径 成为各国政府优先的发展战略。利用自然界中大量存在的生物质资源，工业化生 产大宗有机化学品，替代传统的石油原料，实现资源结构多元化，是应对日益严 重的各种能源挑战、实现可持续发展的重要战略选择。其中，以生物合成技术生 产可降解塑料取代“白色污染 的高分子塑料的技术变革已经提早到来。 聚l - 乳酸( p l a ) 有着现实的和潜在的巨大国际市场，它将替代聚乙烯类传 统的石油化工材料，被称为生物化工产品中即将唤醒的巨人。p l a 纤维在可降解 纤维中熔点最高，玻璃化转化温度t g 为5 7 ，比p e t 略低，故其机械性能有许多 与p e t 相似的地方。更重要的是：p l a 纤维可控制降解速率，是一种来自自然又回 归自然的无害材料，将成为新世纪合成纤维中的主要品种。 1 3 乳酸的生产方法 l 一乳酸生产传统上有化学合成法、酶法和生物发酵三种方法。化学合成产 物为外消旋的d l 混合物，原料毒性大、成本高；酶法工业生产虽然可以得到理 4 第一章前言 想的产物，但由于工艺复杂导致产品成本较高，难以工业化大规模生产；微生物 细胞转化法生产乳酸因其原料来源广泛，生产成本较低、产品光学纯度较高、安 全性高等优点而成为生产乳酸的重要方法。 1 3 1 微生物发酵生产乳酸 发酵法是以淀粉、葡萄糖、纤维等为原料，接种微生物( 乳酸菌或霉菌) 经发酵生成乳酸而得，如d 一乳酸或l 一乳酸，由此作为乳酸聚合体的原料。 自然界中可以产乳酸的微生物很多，但产酸能力较强，能够应用到工业生产 上的只有霉菌中的根霉属和细菌中的乳酸菌类，即乳酸细菌和米根霉两类。 乳酸细菌的主要特点是转化率相对较高、能耗低；缺点是营养要求复杂，发 酵周期长、发酵液中杂质和色素含量较多，分离提取工艺相对复杂，发酵产物容 易发生消旋作用，导致光学纯度不高。乳酸细菌不能直接发酵淀粉质原料，必须 经过糖化过程，转化为糖质原料才能发酵。糖质原料( 葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、 乳糖、蔗糖、戊糖等) 和短链糊精可由不同的乳酸细菌直接发酵生产乳酸。乳酸 细菌属于化能异养型微生物，除了主要原料糖外，乳酸细菌的生长和发酵还需要 复杂的外来营养物，必须提供各种氨基酸、维生素、核酸等营养因子。 传统理论认为，根霉生产乳酸理论转化率低，仅为7 5 ，而且能耗较高，但 是通过代谢通量分析研究表明，米根霉催化合成l - - 孚l 酸最大理论转化率大于9 8 n 钔，与乳酸细菌同型发酵理论转化率较接近。而且根霉营养要求简单，能够 以许多淀粉类物质为原料发酵生产乳酸，发酵周期短、色素生成少、杂质含量低、 易于提取分离和产品纯度高等优点。菌种的改良和发酵工艺的改进，使根霉发酵 产乳酸仍具有很大的潜力。对米根霉发酵生产乳酸的研究一直都是国内外研究的 重点。 1 3 2 化学合成法生产乳酸 化学合成法包括乳腈法和丙烯腈法两种，采用较多的是乳腈法。该法是在乙 醛中加入氢氰酸，于常压下液相内反应生产乳腈，粗乳腈通过蒸馏纯化并用浓盐 酸或硫酸水解为乳酸，反应副产物为氨盐，粗乳酸再经酯化法精制形成不同等级 的产品。目前利用化学合成法生产乳酸主要由美国标准化学品公司和日本武藏野 化学公司实施。化学合成法的缺点是产品为外消旋乳酸即d l 一乳酸，另外成本也 高，而且由于该法所用的原料为乙醛和剧毒的氢氰酸，应用受到一定的限制。 1 3 3 酶法生产乳酸 5 离子柬选育高产l 孚l 陵菌种及米根得代谢调控的研究 酶法生产乳酸主要包括丙酮酸酶和2 一氯丙酸酶转化口一1 两种。日本京都大学 的本杉等人分别从恶臭假单孢菌( p p u t i d a ) 和假单孢菌1 1 3 细胞中抽提纯化出 l - 2 - 卤代酸脱卤酶( 简称l 一酶) 和d l - 2 一卤代酸脱卤酶( 简称d l - 酶) ，使之作用 于底物d l - 2 - 氯丙酸，即可制得l 一乳酸和d l 一乳酸。h u m m e l 等从d - - 孚l 酸脱氢酶活力 最高的混乱乳杆菌( l c o n f u s e s ) d s m 2 0 1 9 6 菌体中得到d 一乳酸脱氢酶，以无旋光 性的丙酮酸为底物制得d - - 孥l 酸。 - 酶法虽然可以专一性地得到旋光乳酸，但工艺条件复杂，导致产品成本较高， 应用到工业上还有待研究。 1 4 乳酸发酵微生物 只有同型发酵乳酸才有工业上的意义，具有产酸能力强，可用于工业生产的 主要是细菌中的乳酸菌类和霉菌中的根霉属( p m z o p u s ) 。 1 4 1 乳酸细菌 用于发酵生产乳酸的细菌主要有乳杆菌属( l a c t o b a c i u s ) 、链球菌属 ( s t r e p t o c c o c c u s ) 、乳球菌属( l a c t o c o c c u s ) 、芽孢杆菌属( b a cill u s ) 。利用 细菌发酵生产乳酸具有糖的转化率高，能耗要求较低等优点。但乳酸菌在合成培 养基上难以生长，对营养要求严格，需要氨基酸和维生素等多种生长因子存在才 能正常生长。同时乳酸菌发酵生产乳酸需要严格的无菌操作，若在发酵过程中混 入了杂菌将会大大降低产量，也很难得到高