（植物学专业论文）羊肚菌属及其相关属分子系统学研究.pdf

首都示范大学硕士学位论文 略语表 c i c h l o r o f o r m l s o p e n t a n o l 氯仿 c 眦 c e t y l t r i m e t h l - a m m o o i u m b r o m i d e十六烷基三甲基溴化铵 e d t a e t h y l e n e d i a m i n e d i x o d i u m t e t r a a c e t a t e 乙二胺四乙酸 n 1 si n t e m a l t r a n s e r i b l e ds p a c e r内转录问隔区 m pm a x i u m u m p a r s i m o n y 最大简约法 n j n e i g h b o r j o i n i n g 邻接法 l a r d n an u c i e a tf i b o s o m a ld n a核核糖体d n a p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 c i c o n s i s t e n c yi n d e x 一致性指数 r ir e t e n t i o ni n d e x 留存指数 首都示范大学硕士学位论文 羊肚菌属及其相关属 分子系统学研究 摘要 羊肚菌属( m o r c h e l l a ) 隶属于子囊菌f ( a s c o m y c o t a ) 盘菌目f p e z i z a l e s ) 羊肚 菌科( m o r c h e l l a c e a e ) ，该属成员是野生名贵食( 药) 用菌，最早收录于李时珍的 本草纲目。长久以来菌物学家针对羊肚菌属的系统学研究作了大量的工作， 然而至今在该领域内仍然存在诸多的分歧。随着分子生物学的发展，利用生物大 分子数据，尤其是d n a 序列分析，对研究和揭示菌物的系统发育具有重要的意 义。这使在充分利用己知各方面的证据基础上，进一步从分子水平揭示羊肚菌的 系统发育成为可能。本研究测定了羊肚菌科羊肚菌属6 种2 0 株的i t s 序列。并 在g e n e b a n k 中搜索下载了相关属 钟菌属( v e r p a ) ，皱盘菌属( d & c i o t i s ) 】的i t s 序列作为外类群。对本实验测定的序列及外类群的i t s 序列，采用最大简约法 ( m a x i m u m p a m i m o n ym e t h o d ，m p ) 和邻接法( n e i g h b o r - j o i n i n gm e t h o d ，n j ) 进 行分析，并构建分子系统树，探讨羊肚菌属及其相关属的系统发育关系。结果表 明，针对i t s 序列分析可以将羊肚菌属各种分为两个大的分支，包括黑羊肚菌和 黄羊肚菌( d a n i e lw i p f ，a n n ef r i b o u r g1 9 9 9 ) 。黑羊肚菌包括m a n g u s t i c e p s 、 m c o s t a t a 、m e l a t a 、m c o n i c a ，黄羊胜菌包括m e s c u l e n t a 、m c r a s s i p e s ，上述分 支结果与三集合种( s p e c i e sa g g r e g a t e ) 概念在形态上也是吻合的。在黑羊肚菌分 支里，m c o n i c a 可以明显地与其他种区分开来，其他各种间的区别也是可见的。 与此同时我们发现不同地域的同一种羊肚菌间或多或少的也存在着遗传和系统 发育距离，这也验证了不同生态环境对羊肚菌系统发育的影响。本课题研究结果 为羊肚菌属的系统分类研究提供了较为明确可靠的分子性状依据。 关键词：羊肚菌属，钟菌属，皱盘菌属，i t s 序列，分子系统发育 首都示范大学硕士学位论文 m o l e c u l a r p h y l o g e n y o f m o r c h e l l aa n dr e l a t e dg e n u s a b s t r a c t m o r c h e l l ab e l o n g st om o r c h e l l a c c a e ，p e z i z a l e s ，a s c o m y c o t a t h e yw e r ef i r s t e m b o d i e di nb e nc a og a n g m u , w r i t i n gb yl is h i z h e n ，a n dn o wp r o v e dt ob er a r e w i l d i n gf u n g u sa n df a m o u sf o rt h eo u t s t a n d i n gv a l u eb o t hi np h a r m a c o l o g ym e d i c a l u s e sa n de d i b l e n e s s a l t h o u g hal o to fe l a b o r a t e dr e s e a r c h e sh a v eb e e nc a r r i e do u tb y m y c o l o g i s t s a l lo v e rt h ew o r l d ，t h e s y s t e m a t i c ao fm o r c h e l l ac a t e g o r yi s s t i l la c o n t r o v e r s i a li s s u e w i t ht h en e w e s td e v e l o p m e n t si nm o l e c u l eb i o l o g y , u s i n gd a t a o f b i gb i o l o g ym o l e c u l ee s p e c i a l l yd n as e q u e n c ea n a l y s i s ，p l a ya l li m p o r t a n tr o l ei n i n v e s t i g a t i n ga n dr e v e a l i n g t h ep h y l o g e n e s i so ff u n g u s m e a n w h i l e ，i ta l s op r o v i d e t h ep o s s i b i l i t yo f e x p l a i n i n gt h ep h y l o g e n e s i so f m o r e l sa tt h em o l e c u l a r l e v e l ，b a s i n g o ne f f i c i e n ts u p p l yf r o mt h ed a t ae v i d e n c ew eh a v ea c q u i r e d i nt h i sr e s e a r c h ，2 0i t s s e q u e n c e sb e l o n gt o6s p e c i e so ft h em o r c h e l l ah a v eb e e nt e s t e d t h ei t ss e q u e n c e a c q u i r e df r o mt h et e s ta n dt h es e q u e n c ea c q u i r e df r o mg e n b a n ku s i n ga so u t g r o u p ( v e r p a ，d i s c i o t i s ) a r e a n a l y z e d w i t h m a x i m u m p a r s i m o n ym e t h o d ( m p 、a n d n e i g h b o r - j o i n i n gm e t h o d ( n j ) t h e nap h y l o g e n e t i ct r e e sh a sd e v e l o p e di no r d e rt o d e m o n s t r a t et h ep h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i pb e t w e e n m o r c h e l l aa n dr e l a t e dg e n e r a t h e r e s e a r c hs h o w st h a tt h e r ea r et w om a i nb r a n c h e si nm o r c h e l l aa c c o r d i n gt ot h ei t s s e q u e n c ea n a l y s i s ，b l a c k m o r e l sa n d y e l l o w m o r e l s b l a c km o r e l s i n c l u d e s m a n g u s t i c e p s 、m c o s t a t a 、m e l a t a 、m c o n i c a ，y e l l o wm o r e l si n c l u d e s m e s c u l e n t a 、 m c r a s s i p t h i st a x o n o m ya n d “s p e c i e sa g g r e g a t e c o n c e p t a r ea n a s t o m o s ei n m o d a l i t y n o t i c e a b l y , m c o n i c ai s d i f f e rf r o mt h eo t h e r so b v i o u s l y a n dt h ep r o l e p t i c e n v i r o n m e n t a la f f e c t i o n so n p h y l o g e n e s l s o fm o r e l sa r e p r o v e db y d i v e r s i t i e s p r e s e n t e di n t h es a m es p e c i e si nd i f f e r e n ta r e a si nt h e i rg e n e t i ca n dp h y l o g e n e t i c c o n s e q u e n t l y ，t h i sr e s e a r c hp r o v i d e sas o l i dm o l e c u l a rc h a r a c t e re v i d e n c ei nt h e s y s t e m a t i cs t u d y o nm o r c h e l l a k e yw o r d s ：m o r c h e l l a ，v e r p a ，d i s c i o t i s ，i t ss e q u e n c e ，m o l e c u l a rp h y l o g e n y 2 首都示范大学硕士学位论文 1 前言 地球上的菌物约有1 , 5 0 0 ，0 0 0 种，迄今获得描述的有6 9 ，0 0 0 种。羊肚菌在较 早时期就被菌物学家们发现并研究，然而迄今为止在羊肚菌的系统学研究中还存 在着较大争议。传统的菌物分类研究主要以菌物的形态学、细胞学、生态学和生 理学等特征为依据，特别是以有性繁殖阶段的形态特征包括超微结构为主要依 据。长久以来茵物学家在对羊肚菌进行系统分类的时候，主要以其菌盖的大小及 颜色、脊脉的特征、凹陷的大小、菌柄的大小及颜色、菌盖在菌柄上的着生情况、 子囊及子囊孢子还有侧丝的形态特征为主要依据。不同菌物学家对以上特征在羊 肚菌分类中的重要性认识的侧重点不同，加 ：其研究方法的差异，以及不同生态 环境对羊肚菌诸多特征影响的不同，导致了羊肚菌科特别是羊肚菌属内的种类划 分出现很大分歧。由于羊肚菌科与马鞍菌科( h e l v e l l a c e a e 表面上有一定的相 似之处，曾有很多学者把它们作为一个类群来研究，历史上也有人把皱盘菌属划 归盘菌科( p e z i z a c e a e ) 研究，目前这些问题已基本被纠正。但是目前在羊肚菌 属内种类的划分、命名、界定依然还存在着较多分歧。 羊肚菌属是羊肚菌科内最大的属，在世界范围内分布较广，应用价值也很高， 不同历史时期不同的学者对其分类也有着不同的看法。据e m i l ej a c g u e t a n t 在 l em o r i l l e s ) ( 1 9 8 4 ) 一书中报道羊肚菌属共有2 8 个种，分布予法国、德国、 美国、印度、中国等地。戴芳澜中国真菌总汇( 1 9 7 9 ) 记载，己知羊肚菌属 菌物在中国有8 个种，它们是：小顶羊肚菌彪a n g u s t i c e p s ( p e c k ) b o u d i e r ： 尖顶羊肚菌膨c o n i c a ( p e t s ) b o u d i e r ；粗柄羊肚菌彪c r a s s i p e s ( k r o m b h ) g o u d i e r ：小羊肚菌彪d o l i c i o s a ( f r ) j e t ；开裂羊肚菌彪d i a t a n s ( f r 。) b o u d i e r ；高羊肚菌膨e l a t a ( f r ) b o u d i e r ；羊肚菌彪e s c m e n t ap e r s e xs t a m a n s ：硬羊肚菌彪五“幽j e t 。在较早前的研究中有人认为羊肚菌分为三种 ( g r o v e sa n dh o a r s e ，1 9 5 3 ) ，六种( s e a v e r ，1 9 2 8 ) ，3 2 种( b o u n d i e r ，1 9 5 3 ) 。 在以上众多菌物学家研究的基础上r i f a i ( 1 9 6 8 ) 等人认为羊肚菌科有大量的小 种，并提出了用集合种的概念来划分归类各小种。 首都示范大学硕士学位论文 近年来，现代分子生物学技术的迅速发展，为菌物系统与进化学研究提供了 丰富而翔实的资料，为解决分类学、系统发育、物种形成与进化等方面的难题提 供了极为有力的技术途径。在羊肚菌的分子系统学研究中不同研究学者分别采用 了核酸序列分析、同工酶分析以及蛋白质免疫技术等。不同的研究者可根据具体 的实验对象和目的，选择相应的技术手段。在基因片断的选择上，主要有核基因 组核糖体d n a1 8 s 、2 8 s 、i g s 区( i n t e r g e n i cs p a c e r ，基因间区) 基因和i t s 区( i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r ，转录间隔区) 等片段。1 8 s 、2 8 s 进化速率慢，常用于探讨科级 和科级以上等级的系统发育问题，而i t s 区进化速率较编码区快，一般用于研究 较低等级如属问、种间甚至居群问的系统演化关系，i g s 区只能用于遗传距离较 近种或是种内的一些亲缘关系鉴定。 本研究试图选取羊肚菌科中的羊肚菌属，选用m d n a 的i t s 区( 转录间隔 包括5 8 s 编码区) 作为分予标记，结合g e n b a n k 中羊肚菌科的钟菌属、皱盘菌 属序列资料，分析构建系统树。研究的主要目的一是分析羊肚菌的类群划分及类 群下已知种间的关系，为羊肚菌科的羊肚菌属及其相关菌属系统发育提供详实的 分子证据，二是验证i t s 序列在羊肚菌分子系统学研究中的应用价值。 1 1 羊肚菌属及其相关科属的分类简史 1 1 1 经典羊肚菌属及其相关菌物的分类简介 传统的菌物系统研究已有很长的历史。在目前国际上公认的分类系统中羊肚 菌属隶属于子囊菌门( a s c o m y c o t a ) 盘菌目( p e z i z a l e s ) 羊肚菌科 ( m o r c h e l l a c e a e ) ，羊肚菌科下分三个属，分别为羊肚菌属( m o r c h e l l a ) 、钟菌 属( v e r p a ) 、皱盘菌属( d f s c i o t f s ) ( k i r k e t a l ，2 0 0 1 ) 。1 7 1 9 年d i l l 第一次提出 了m o r c h e l l a 这一名词，1 7 9 7 年p e r s o o n 最早一个建立羊肚菌属。1 8 1 5 年s w a r t z 建立钟菌属，b o u n d i e r 在1 8 8 5 年建立了皱盘菌属。由于羊肚菌科的很多种类与 马鞍菌科一些种类的宏观形态上有很多相似之处，都具有较大子囊盘柄的形态也 较为相似，许多学者在较长时间内都将羊肚菌科归入马鞍菌科内进行研究 ( s e a v e r ，1 9 2 8 ；b e s s e y ，1 9 5 0 ；i m a i ，1 9 5 4 ；a l e x o p o u l o s ，1 9 6 2 ：b e n e d i x ， 1 9 6 2 ) 。事实上上述两科菌物的子囊孢子特征有很大区别，组织结构也有较大区 别，细胞学证据也不支持二者的合并，如：羊肚菌菌丝较为粗糙，盘菌孢子内有 油滴分布等。因此随着研究的深入羊肚菌科还是被作为独立科进行研究 首都示范大学硕士学位论文 ( d e n n i s ，1 9 6 0 ；b e r t h e t ，1 9 6 3 ；o a m u n d i ，1 9 6 4 ) 。目前积累的分子系统学结果 也支持二者分别为独立的科，b u n y a r d ，n i c h o l s o n ，b o y s e ( 1 9 9 4 ) 等对羊肚菌 属、钟菌属、皱盘菌属和马鞍菌科的鹿花菌属( g y r o m i t r a ) 的2 8 s r d n a 进行p c r 扩增，对扩增产物的分析发现存在着限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n p o l y m o r p h i s m s ，r f l p ) ，根据r f l p 结果分析鹿花菌属与羊肚菌属 的差异约为6 2 。钟菌属与皱盘菌属包含的种类较羊肚菌少，特别是皱盘菌属 数量很少目前对其的研究也较少。s e a v e r 等人由于科研条件等因素的影响过于 注重外观特征而忽视了解剖学及化学特征，在1 9 2 8 年s e a v e r 建立的系统中一度 将皱盘菌属划分到盘菌科。直到1 9 6 3 年b e r t h e t 在他建立的系统中把皱盘菌属 纳入羊肚菌科中并为大多数人认可接受。 i i 2 羊肚菌系统学研究中存在的争议 羊肚菌科下属的三个属中，钟菌属、皱盘菌属种类相对较少种的界定的争议 也不大。钟菌属包括两个种分别为v c o n i c a ( m o l l ) s w a r t z 、v b o h e m i c a ( k r o m b h ) s c h 面t ：皱盘菌属有d v e n o s a ( p e r s ) b o u d i e r ( 1 9 0 7 ) 、d r e t i c u l a t a ( g r e y ) b o u d i e r ( 1 9 0 7 ) 。菌物学家们针对羊肚菌属的系统学研究已有1 0 0 多年的历史，然而在 其分类系统中仍存在大量争议。各种羊肚菌相互间的宏观特征有着明显的差距， 与此同时其子实层的微观结构却都很相似。由于不同学者研究的重点不同，分类 的主要依据有差别，势必造成各不相同的分类系统的建立，目前不同学者对羊肚 菌属种的划分从3 个种到3 2 个种不等。针对这种情况，很多人提出了多态种 ( p o l y m o r p h i cs p e c i e s ) 即集合种的概念( g r o v e s h o a r e ，1 9 5 3 ；d e n n i s ，1 9 6 0 ； b r e s i n s k y s t a n g l ，1 9 6 2 ；m o s e r ，1 9 6 3 ；w e b e r ，1 9 8 8 ) 。这些学者将羊肚属分 为三个多态种：半开羊肚菌( m s e m i l i b e r a1 、黑羊肚菌( m e l a t aa n d m a n g u s “c e p s ) 和普通羊肚菌( m e s c u l e n t aa n dm d e l i c i o s a ) 。三者的形态学鉴别特征分别如下： 半开羊肚菌子囊果的菌盖与菌柄连接处具有半离生的缘；黑羊肚菌的菌盖具深色 的纵向肋脉、浅色不显著的横向肋脉；普通羊肚菌的菌盖具不规则的网状或蜂窝 状的浅色肋脉。r o y s e 和m a y ( 1 9 9 0 ) 使用同功酶差异分析研究得到的结果将羊 肚菌属分为两个主要类群( 黑羊肚菌和黄羊肚菌) 。b u n y a r d 等( 1 9 9 4 ) 通过对 2 8 s 区基因片段的r f l p 分析，认为羊肚菌至少有两个分类群：( 1 ) 黑羊肚菌， 包括黑脉羊肚菌、尖顶羊肚菌和高羊肚菌；( 2 ) 黄羊肚菌，包括小羊肚菌、粗柄 首都示范大学硕士学位论文 羊肚菌，并且认为同一分类群的羊肚菌属于同一个种。g u z m a ua n d t a p i a ( 1 9 9 8 ) 通过形态学、细胞学等方面的观察比较，认为除了上述二个分类群，还有一个以 半羊肚菌( m s e m i l i b e r a ) 为代表的分类群。b r i t t 等( 1 9 9 6 ) 研究指出当前根据 羊胜菌的总体形态可将其分为三个类群：黑羊肚菌、黄羊肚菌和半开羊肚菌。综 上所述，目前羊肚菌属的系统分类的主要争议在于类群的划分及类群下种的鉴 定。 羊肚菌还有一个菌柄变红的分类群，包括红褐羊肚菌( m r u f o b r u n n e a ) ，危 地马拉羊肚菌( m g u a t e m a l e n s i s ) 和硬羊肚菌，这类羊肚菌主要分布于热带与亚 热带地区。羊肚菌的分布很广，在温带、热带与亚热带地区均有分布。发生地复 杂多样，在河岸边、山地斜波、草地和火烧山地都有可能发生；发生她的土质也 复杂多样，可以是沙地、富含有机质的湿土或泥浆地。由于不同的生态环境、营 养条件的影响，不同地域的羊肚菌的形态特征自然会有较大区别，因而在多态种 下的种类鉴定工作中依然存在很大争议。最新一版的菌物学概论( c j 5 可历索 保罗，c w 明斯，m 布莱克韦尔) 对羊肚菌系统分类的介绍基本上是采用w e b e r ( 1 9 8 8 ) 的观点，认为黑羊肚菌( 小顶羊肚菌) 、杂羊肚菌( 半羊肚菌) 、美味羊 肚菌( 小羊肚菌) 以及普通羊肚菌( 羊肚菌) 是羊肚菌属中界限明确的种。 目前，传统经典分类方法已经非常完善，然而在羊肚菌系统分类研究中不同 学者建立的系统仍然存在较大争议，这就要求我们寻求更多更可靠的方法为羊肚 菌的系统学研究提供新的可信的数据支持。分子系统学研究方法的应用为传统的 羊肚菌系统学研究提供了新的研究思路，新兴分子生物学技术与传统的系统学研 究方法的有机结合可以提供更好的可信的系统分类依据。 1 2 分子系统学 1 。2 1 分子系统学概述 生物系统学是研究生物多样性以及它们中间的任何一个类群和其他类群的 各种关系的科学。系统学的研究建立在分类学基础之上，对生物进行分类是人类 认识生物世界的第一步。1 8 世纪林奈双名法的建立为对生物多样性描述和分类 奠定了基础，由于林奈这一系统的严谨性、科学性而很快得到公认，并被进化学 家拉马克、达尔文、海克尔所采用。1 8 6 0 年海克尔提出了系统发生( p h y l o g e n y ) 这一概念。研究系统发生的主要任务是探讨物种之间的历史渊源以及物种之间的 首都示范大学硕士学位论文 亲缘关系，但早期建立起来的生物系统发生史很少有客观标准。直到二十世纪上 半叶，人们关注的焦点仍然是物种、物种形成和地理变异，而不是生物发生。1 9 4 2 年赫胥里出版的进化论的现代综合中仍未出现系统发生这个词。后来德国植 物学家齐默尔曼( w z i m m c r m 锄) 建立了顶枝学说( t e l o m e t h e o r y ) ，德国昆虫学家 亨尼希( w h e n n i g ) 仓t 建了分支系统学说( c l a d i s t i c s y s t e m a t i c s ) 。都是基于现存生物 和生物化石的共同特征来概括提炼出一些客观标准，进而重新构建生物进化史。 随着生物及其它诸如计算机科学的不断进步，生物大分子信息的不断累积，利用 生物大分子来研究生物系统发生成为可能。二十世纪六十年代相继提出的“分子 进化钟假说”和“进化中性理论”奠定了分子系统学的理论基础。z u c h e r k a n d l 和 p a u l i n g ( 1 9 6 5 ) 在其“蛋白质在进化上的趋同与趋异”的论文中指出：( 1 ) 分子变 化( 核苷酸或氨基酸的替换) 的速率与时间是相对应的( 分子钟假说) 。( 2 ) 进 化分支( 系统发育) 可以从分子变化中得出。这正是分子进化研究的最初理论基 础。随后，这一研究领域迅速展开，其中著名的工作有利用细胞色素c 氨基酸 序列数据进行系统发育重建；关于人一大猩猩一类人猿进化时间的推测。1 9 6 8 年日本群体遗传学家木村资生( m o t o ok i m u r a ) 提出：( 1 ) 进化过程中的核苷 酸置换，其绝大部分是中性或近似中性的突变随机固定的结果而不是正向达尔文 自然选择的结果：( 2 ) 许多蛋白质多态性必须在选择上为中性或近中性，并在 群体中由突变引入与随机灭绝两者间的平衡维持。这就是著名的“进化中性”理 论，更进一步奠定了分子系统学的理论基础。分子系统学是科学发展的必然趋势， 从某种意义上讲，它在研究生物系统发生和进化领域，具有最基本的意义。一方 面，生命系统从分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落和生态系统的不同 层次表现出多样性，同时每个层次的多样性又有其自身的发展规律，其中分子层 次的多样性构成分子系统学的研究领域，具有最基本的意义( 黄原1 9 9 8 ) 。另一 方面，传统的菌物系统与分类，其理论基础都是建立在分类群的性状分析基础之 上，从分子遗传学的角度来看，表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异， 即在基d n a 序列上的差异，对这种基因序列差异的比较研究无疑为植物系统与 进化提供最直接的证据。到二十世纪八十年代，重组d n a 技术和快速d n a 测 序方法的出现，使分子进化研究出现了高潮。菌物分子系统学正是在这一时期迅 速发展起来。 首都示范大学硕士学位论文 传统的菌物分类主要依据菌物的形态特征，不同的学者可能采用不同的性状 不同的研究方法，对同一性状的认知也存在差异，而且少数形态特征和生理生化 指标随着环境的变化而不稳定。因此，在传统的菌物分类中常引起分类系统的不 稳定或意见分歧。随着生物化学、遗传学以及分子生物学等相关学科的发展，同 时也是菌物分类学自身发展的客观需求，在菌物的现代分类学中已引入了分子 生物学技术。例如核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，p c r ) 技术、限制性长度多态性( r f l p ) 、随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a id ) 、电泳核型分析、核酸序列分析、同工酶分 析以及蛋白质免疫技术等。不同的研究者可根据具体的实验对象和目的，选择相 应的技术手段。国内外学者在羊肚菌分子系统学研究中主要应用核酸分析、同工 酶分析、蛋白质免疫分析技术等。大量分子性状研究数据如核酸序列同源性、酶 谱的相似系数和酶谱距离、免疫学差异的获得为羊肚菌系统学研究提供了最直接 的证据。 1 2 2i t s 序列在菌物分子系统学的应用 菌物分子系统学研究的基本方法之一是对菌物的一定d n a 序列进行同源性 比较，构建系统树，以此探讨它们的系统演化关系。采用核酸分子研究菌物系统 学乃至生物系统学具有广泛的可比性、准确可靠性、巨大的信息量、趋同性小、 严密性等优点。其原理是：核酸序列的变化基本上是趋异的，这种变异的程度与 流逝的时问之间存在着一个定量的关系，即两种生物从共同的祖先分歧的年代越 久远，在它们的核酸分子中所积累的核苷酸差异就越大。所以，来自不同生物物 种的核酸序列的相似程度，能够反映出这些生物之间遗传结构的相似性和亲缘关 系的远近，从而可以被用来重建这些生物的分子系统发育。真菌核基因组和线粒 体基因组的特定r d n a ，均可由专门的引物进行p c r 扩增获得。其中，核基因 组多为多拷贝、中度重复序列，一个重复单位中i t s 区位于1 8 s 和2 8 s 基因之 间，中部被5 8 s 基因一分为二，即i t s l 区和i t s 2 区，其结构如下： 9 首都示范大学硕士学位论文 i t s 之所以成为菌物系统与进化研究中的重要分子标记，主要基于其以下几 个特征。第一，作为1 8 s - 2 8 sr d n a 的一个组成部分，i t s 在核基因组中高度重复， 而且通过基因的不等交换和转换，这些重复单位间已发生了位点内或位点间的 同步进化( c o n c e r t e de v o l u t i o n ) ，即不同i t s 拷贝间的序列趋于相近或完全一致， 这就为对p c r 扩增产物直接测序奠定了理论基础。第二，i t s l 、i t s 2 分别位于 1 8 s 一5 8 sr d n a 、5 8 s 2 8 sr d n a 之间，而1 8 s 、5 8 s 、2 8 sr d n a 的序列又非常保 守，这样就可以用与它们序列互补的通用引物对i t s 区进行p c r 扩增、测序。 各物种的i t s l 和i t s 2 长度比较保守，现有发表的资料表明，羊肚菌i t s 长度主要集中在7 4 0 7 5 0 b p 和11 5 0 1 2 2 0 b p 之间( 包含两端1 8 s 、2 8 s 提供的引 物区段) 。但i t s 区序列变异较快、变化较大，可以提供较丰富的变异位点和信 息位点，已证实它是研究许多被子植物类群系统与进化的重要分子标记，不仅可 用于解决科、亚科、族、属、组内的系统发育和分类问题，而且可用于重建多倍 体复合体的网状进化关系，探讨异源多倍体的起源过程。 1 3 系统发育数据分析方法 对d n a 序列进行系统发育分析有四个主要步骤，它们是：序列比对( 数据 模型) 、建立取代模型、建立系统树以及系统树的评估。 1 3 。1 序列比对 获得分类群的核酸序列后，首先要对序列进行多重对比，也就是建立比对模 型，其基本步骤：选择合适的比对过程；然后从比对结果中提取系统发育的数据 集。比对好的碱基所占的位置称为位点。在进行系统发育分析时，这些位点等同 于特征符，而占据这些位点的真实碱基( 或者空位，i n d e l ) 被称为特征符状态。 对准的序列位点被用来进行发育分析。 c l u s t a l x 程序，然后进行手工对比， 一个典型的比对过程包括：首先应用 最后提交给建树程序。一般来说，不能 首都示范大学硕士学位论文 将计算机的比对结果直接提交给建树程序，这是因为，第一，建树程序不能发现 比对错误：第二，在比对中出现可变长度时，这时系统发育数据集同比对就不会 完全吻合，需要根据比对的不确定性程度和空位状态对结果进行取舍，其中对空 位状态的处理方法取决于建树方法以及从比对结果中发掘出的系统发育信息。 1 3 2 建立取代模型 建立取代模型同比对以及建树方法一样重要，它主要涉及两个要素：特定碱 基之间的相互取代模型和序列中不同位点的所有取代的相对速率。一般而言，生 物化学性质相近碱基之间的取代频率较高，也就是说四种转换( a g ，g a ， c t ，t c ) 的频率比八种颠换( a c ，a t ，c g ，g t 以及它们的反 向取代) 的频率要高，这种偏向会影响两个序列之间预计的分歧。因此在后面的 系统分析时，可以对频率高的取代进行加权，如果在m p 使用这种权重，就称为 “加权节约”。但是对于是否加权，权重为多大，要慎重考虑，通常需要经过观察 和经验进行估值。 除了上述取代模型的多元化外，序列中不同位点之间取代速率的差异也会对 建立进化树的结果产生影响，位点之间的差异也叫做位点异质性，比如一个编码 d n a 序列，在三联体编码中，第三个位点比前两个位点更加容易发生变化，因 此许多系统发育分析方法在分析编码序列时，都会把第三个编码位点排出在外。 对位点差异的取代速率进行估值的方法有非参数化模型，不变式模型和g a m m a 分布模型。在进化树建立程序中，有各种位点速率差异修正的方法可供选择。 1 3 , 3 系统树构建方法 分子系统发育分析的一个主要目的是根据分子数据构建系统树，进而推断某 一特定类群系统发育的分支式样，已经发展了许多系统树构建方法，目前最常用 的方法，主要有距离矩阵法( d i s t a n c em a t r i xm e t h o d ) 、最大简约法( m p ) 和最 大似然法( m a x i m u m l i k e l i h o o dm e t h o d ，m l ) 。 距离矩阵建树法是根据双重序列比对的差异程度( 也就是所谓的距离) ，获 得一个对称距离矩阵，依此为基础来建立进化树。在序列数据中，广泛应用的距 离系数有j u k e s c a n t o r 单参数距离系数、h k y 8 5 距离系数和k i m u r a 两参数或者 三参数距离系数。获得距离系数矩阵后，建树的方法常用：类平均法( u n w e i g h t e d p a i r - g r o u p m e t h o d u s i n g a r i t h m e t i c a v e r a g e s ，u p g m a ) 、邻接法( n j ) 、 首都示范大学硕士学位论文 f i t c h m a r g o l i a s h 法( f m ) 。 最大简约法是一种优化标准，遵循“奥卡姆剃刀原则”( o c c a m sr a z o r ) ：对 数据最简单的解释也许是最恰当的，即从一系列可能的树中找到一个需要最少的 核苷酸替换就可以解释所看到的序列差异的树。比对序列进行最简约分析时，只 关心那些可以提供进化信息的位点，先确定所有的信息位点，对每个信息位点计 算碱基变化的最小数目，并对所有信息位点的最小数日求和，最后选取碱基变化 总和最小的树作为最简约树。 最大似然法和最大简约法类似，也是对给定的一组序列的每种可能的拓扑结 构树进行评价。它是一种概率统计方法，也就是，通过在信息位点的每种可能的 进化改变的概率进行排列和计算，使树的总概率最大化来选择最优化的系统树。 构建分子系统树的方法很多，然而，还没有一种方法适合各种数据条件，因 为不同的建树策略是建立在不同假设的基础之上的。在实际工作中需要根据序列 的特点，综合各种因素，选用合适的建树方法。 1 3 4 系统树的检验与评估 利用上述方法得到系统树后，需要用统计学的方法来评估系统树所反映系统 发育关系的可靠性和稳定性。重复取样法( r e s a m p l i n g m e t h o d ) 是目前应用十分 广泛的一种统计检验工具，主要包括自展法( b o o t s t r a p ) 和刀切法( j a c k k n i f e ) 。 其中自展法在实际应用中最为普遍。该方法利用对原始数据随机抽样产生的自展 数据集获得多个系统树，然后检验这些系统树对其一致树各分支的支持率。进化 树模拟研究表明，在合适的条件下( 各种替换速率基本相等，树枝基本对称) ， 如果自展支持率值大于7 0 0 4 0 ，那么所得到的系统发育树能够反映真实系统发生 史的可能性要大于9 5 ，当然，如果条件不合适，即使自展支持率很高，也可 能和真实相差很远。 上述只是目前我们对分子系统学的初步了解、认识，各种实验方法、计算工 具及程序还有待进一步的完善改进。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 。1 材料和菌株 本课题研究中主要从两类材料中提取d n a ，一是从干标本中直接提取d n a ， 首都示范大学硕士学位论文 二是从单孢分离菌丝中提取d n a 。材料的来源有三个途径，自己采集、菌种购 买、标本借用等。 表1 供试标本和菌株 t a b l e1f u n g a lm a t e r i a lu s e df o re x p e r i m e n t 注：m 自单孢分离菌丝提取d n a ；f 自子实体提取d n a n o t e ：m m o n o s p o m ；e f r u i tb o d y e x c i c a t a 2 1 2 试剂 p c r 试剂盒( l a t a q w i t h g c b u f f e r ) 购自上海生工公司；d n a m a r k e r ( m d l 0 2 1 购自北京天为时代公司：d n a 纯化回收试剂盒( a 0 1 4 1 ) 购自北京鼎国公司； 1 3 首都示范大学硕士学位论文 引物由上海博亚公司合成。其它生化试剂购自北京天来生物医学科技有限公司。 常用化学试剂均为分析纯。 2 。2 方法 2 2 1 总d n a 提取 本课题研究材料总d n a 的提取分为两种情况，一是从菌丝培养物中提取 d n a ，二是从干标本中提取d n a 。 2 2 1 1 菌丝总d n a 提取 对于购买的菌种我们可以直接进行活化培养获取菌丝并从菌丝中提取总 d n a 。对于自己采集的菌种首先要进行单孢分离并培养菌丝，然后从菌丝中提 取d n a 。 ( 1 ) 单孢分离 镜检已培养了2 4 小时的孢子，若大部分孢子已经开始萌发，则进行以下操 作。在1 0 x 4 0 倍显微镜下观察已萌发的孢子，并用自制的单孢分离装置加以标 记。然后用自制的毛细玻璃管( 针) 挑取单孢子，接种于已倒好的分离培养基上 ( 平皿中培养基厚度在3 m m 左右) 。挑取孢子时必须一次成功，不能重复挑取， 以免粘上其他孢子。每个平皿接种3 个单孢予，3 者间保持一定距离，于2 5 。c 恒 温培养2 3 天，并及时观察。( 以上操作均需在无菌条件下进行) ( 2 ) 菌丝培养 事先将培养皿、蒸馏水、镊子、玻璃纸于1 2 1 c 下灭菌2 0 m i n 。在超净工作 台上用解剖针在玻璃纸上扎几个孔。用一已灭菌的平皿盛无菌水，将扎好的玻璃 纸放入水中，待玻璃纸全部浸湿展平，再用镊子夹起玻璃纸平铺在待接种的m y g 平板上。用接种铲从己活化的菌种中取0 5 x 0 5 m 2 大小的菌丝块转接到m y g 平 板中央。每个菌种设置2 个重复，2 5 恒温培养。待菌丝长满平皿将菌丝刮取下 来，用已灭菌的玻璃纸包好，一2 0 保存。 ( 3 ) d n a 的提取 1 ) 7 0 7 , 醇、异丙醇2 0 c 冷冻备用：c t a b 缓冲液置于6 5 c 水浴中预热备用。 2 ) 取出保存的菌丝称重，加入与菌丝等重量的石英砂，立即捣碎成粉末( 研磨 时间不要超过3 - 4 m i n ) ，将研磨好的菌丝转移到e p p e n d o r f 管中，平均每管装1 9 。 3 ) 在e p p c n d o r f 管中加入已预热的c t a b 缓冲液约7 0 0 ul ，之后置于6 5 6 c 水浴 1 4 首都示范大学硕士学位论文 3 0 一6 0 分钟，并经常颠倒混匀。 4 ) 加入等体积的氯仿异戊醇，充分混合( 颠倒) 1 0 分钟，1 2 0 0 0 r p m4 0 c 离心 1 0 分钟，取上清。 5 ) 重复步骤4 。 6 ) 加入0 6 倍体积的已在- 2 0 c 顸冷的异丙醇或2 倍体积无水乙醇 同时也可加 0 1 倍体积或少量3 mn a a c ( p h 5 2 ) ，颠倒混匀，簧于2 0 c 冰箱中3 0 分钟以 上或过夜。 7 ) 8 0 0 0 r p m4 c 离心2 0 分钟，弃上清。 8 ) 用预冷的7 0 乙醇清洗沉淀2 次。 9 ) 干燥，不要干透。 1 0 ) 在沉淀中加入3 肛_ 5 0 1 1l t e 缓冲液或d d 水，加入的量视沉淀量而定，尽可 能少，量多时可加到5 0ul 着想加速溶解并除去其中残留的d n a a s e 活性，可 置于6 5 6 c 水浴加热1 0 分钟。溶解后置于4 c 或一2 0 c 保存备用。 附：培养基 1 ) 分离培养基：( 分离单孢子用) 酵母浸膏l g葡萄糖5 9琼脂1 5 9氯霉素0 4 0 5 9 l 蒸馏水 1 0 0 0 m l p h 7 01 2 1 灭菌2 0 m i n 2 ) m y g 培养基：( 培养菌丝用) 麦芽浸膏5 9酵母膏4 9葡萄糖1 0 9 淀粉1 5 9 k i - 1 2 p 0 4 l g m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9琼脂1 5 9氯霉素o 4 加5 9 l 蒸馏水1 0 0 0 m l p h 6 51 2 1 灭菌2 0 r a i n z 2 1 2 干标本材料总d n a 提取 1 ) 7 0 e 醇、异丙醇2 0 。c 冷冻