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有机磷农药吡唑硫磷环境行为研究 有机磷农药吡唑硫磷环境行为研究 摘要 手性农药约占农药总量的2 5 。外消旋手1 7 土仪约百伺寺亘酮个l 口j 对映体。尽管对映体的生物活性不同，大多数手性农药至今仍以其外 消旋体形式出售并施用。有关手性农药对映体的分离及其选择性环境 行为的研究尚十分有限。本报告对有机磷农药吡唑硫磷在环境中迁移 转化、对映体的分离及其选择性生物毒性进行研究。主要包括以下内 容： ( 1 ) 研究了吡唑硫磷的水解行为。通过改变水解体系的p h 值和培 养温度探讨了吡唑硫磷的水解动力学。实验表明：吡唑硫磷在酸性 介质中能稳定存在，在中性溶液中水解速率很慢，而在弱碱性或碱性 条件下，吡唑硫磷稳定性差，易发生水解反应：吡唑硫磷水解与体 系的温度密切相关，水解温度越高，反应速率越大。 ( 2 ) 研究了吡唑硫磷在不同土壤中的吸附行为。通过吡唑硫磷在 四种不同土壤上的吸附研究，结果表明毗唑硫磷在四种土壤中的吸附 能很好地与f r e u n d l i c h 等温吸附方程相吻合，吸附性与供试土壤理化 性质差异呈明显变化。吡唑硫磷在四种土壤上的吸附强弱顺序与土壤 有机质、粘粒含量呈正相关。 ( 3 ) 研究了吡唑硫磷对映体的分离分析方法。采用高效液相色谱 浙江工l k 大学硕士学付诊文l 有机磷农药吡唑硫磷环境行为研究 ( 如? l c ) 拆分。结果表明，柱温2 5 。c 下以体积比9 0 1 0 的正己烷异 丙醇为流动相且其流速为1m l m i n 时，吡唑硫磷两个对映体能在 c h i r a l c e lo d h 手性色谱柱上获得基线分离。 ( 4 ) 研究了吡唑硫磷对生物的对映体选择性毒性。以纯对映体标 样对丁酰胆碱酯酶( b c h e ) 的抑制能力和对以d m a g n a l 拘急性毒性 评价生物毒性。结果表明，( ) 吡唑硫磷对b c h e 的抑制能力约为( + ) - 吡唑硫磷的1 5 倍，但( + ) 吡唑硫磷对d m a g n a 的急性毒性( 2 4h ) 约为 ( ) 吡唑硫磷的6 倍，外消旋的毒性介于两个对映体之间。这部分研究 表明吡唑硫磷生物毒性存在对映体选择性，同时也揭示对映体在体内 与体外毒性的不一致。 关键词：手性农药，对映体分离，吡唑硫磷，对映体选择性，环境行 为 浙江工业大学硕士学位论文 i i 有机磷农药毗唑硫磷环境行为研究 s t u d yo ne n v i r o n m e n t a i ，b e h a v l o r o fi n s e c t i c i d ep y r a c l o f o s a bs t r a c t w h i l et h em a j o r i t yo fp e s t i c i d e sa r ea c h i r a l ，a b o u t2 5 o f p e s t i c i d e s c u r r e n t l yu s e da r ec h i r a la n dt h e r e f o r ec o n s i s to fm i x t u r eo fe n a n t i o m e r s e n a n t i o m e r so fc h i r a lc o m p o u n d su s u a l l yd i f f e ri nb i o l o g i c a la c t i v i t i e s b e c a u s eo ft h e i rd i f f e r e n ti n t e r a c t i o n sw i t he n z y m e sa n do t h e rn a t u r a l l y o c c u r r i n gc h i r a lm o l e c u l e s h o w e v e r , m o s to ft h ec h i m lp e s t i c i d e sa r e s t i l lm a r k e t e da n da p p l i e di nr a c e m a t e s t h ee n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o na n d e n v i r o n m e n t a lb e h a v i o r so fc h i r a lp e s t i c i d e sh a v es of a rr e c e i v e dl i m i t e d r e s e a r c h i nt h ep r e s e n tw o r k , t h ee n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o n ，b i o t o x i c i t ya n d t r a n s f e ri ne n v i r o n m e n to fp y r a c l o f o sw a si n v e s t i g a t e d t h ed e t a i l e d i n f o r m a t i o ni sa sf o l l o w s ： ( 1 ) t h eh y d r o l y s i so fp e s t i c i d ep y r a c l o f o sw e r e i n v e s t i g a t e d t h e k i n e t i c so fh y d r o l y s i so fp y r a c l o f o sw e r ei n v e s t i g a t e da td i f f e r e n tp h v a l u e sa n du n d e rv a r i o u st e m p e r a t u r e s t h er e s u l t sa r ef o u n d ： ：p e s t i c i d e p y r a c l o f o si ss t a b l ei na c i d i ca n dn e u t r a lw a t e r , b u tr e a d i l yh y d r o l y z e di n a l k a l i n ew a t e r f u r t h e r m o r e ，t h eh i g h e rt h ep hv a l u e ，t h ef a s t e rt h e h y d r o l y s i sr a t e ：t h er a t eo fh y d r o l y s i si si n c r e a s e da st h eh y d r o l y s i s t e m p e r a t u ri n c r e a s e 浙江工业大学硕士学位论文 i l l 有机磷农药毗唑硫磷环境行为研究 ( 2 ) t h ea d s o r p t i o n so fp e s t i c i d e sp y r a c l o f o si nd i f f e r e n ts o i l sw e r e s t u d i e d t h ei s o t h e r md a t aw e r ef i t t e dt ot h ef r e u n d l i s he q u a t i o n , a n d a d s o r p t i o no fp y r a c l o f o sv a r i e dw i t ht h ed i f f e r e n tp r o p e r t i e so ft h es o i l s t e s t e d t h ek fv a l v e si n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n go r g a n i cm a t t e ra n dc l a y ( 3 ) an o v e lm e t h o dw a sd e v e l o p e dt os i m u l t a n e o u s l ys e p a r a t et h e e n a n t i o m e r so f r a e - p y r a c l o f o su s i n gh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t h ee n a n t i o m e r sw e r es i m u l t a n e o u s l yr e s o l v e d o nac h i r a l c e lo d hc o l u m n ，w i t ham o b i l ep h a s eo fn h e x a n e 2 一 p r o p a n o l ( 9 0 10 ，v v ) a taf l o wr a t eo fl m l m i na n d2 5 。c ( 4 ) t h e e n a n t i o m e r i c b i o t o x i c i t y o ft h et w oe n a n t i o m e r so f p y r a c l o f o sw e r ei n v e s t i g a t e d t h ep u r ee n a n t i o m e r so fp y r a c l o f o sw e r e s t u d i e di nt h e i ri nv i t r oi n h i b i t i o nt o w a r db u t y r y l c h o l i n e s t e r a s ea n di n v i v oa c u t ea q u a t i ct o x i c i t yt od m a g n a t h ei nv i t r oa s s a y ss h o w e dt h a t ( - ) - p y r a c l o f o sw e r ea b o u t15t i m e sm o r ep o t e n tt ot h ee n z y m e st h a ni t s ( + ) - f o r m i nc o n t r a s t ，t h e ( + ) 一e n a n t i o m e rw a s6 0t i m e sm o r et o x i ct od m g n a n2 4 ht e s t s t h et o x i c i t yo fr a c e m i cp y r a c l o f o sw a si n t e r m e d i a t ei n b o t h i nv i t r oa n di nv i v ob i o a s s a y s t h e s er e s u l t s s u g g e s tt h a tt h e b i o t o x i c i t yo fp y r a c l o f o st on o n t a r g e t e do r g a n i s m sa r ee n a n t i o s e l e c t i v e a n dt h e r e f o r ep o s tt h ei n c o n s i s t e n to fe n a n t i o m e r si nv i t r oa n di nv i v o k e yw o r d s ：c h i r a lp e s t i c i d e s ，e n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o n ，p y r a c l o f o s ， e n a n t i o s e l e c t i v i t y , e n v i r o n m e n t a lb e h a v i o r 浙江工业大学硕士学位论文 i v 有机磷农药毗唑巯磷环境行为研究 k o c k e a 1 1 2 晦 c h i r l c e lo d h d ，m l c 5 0 i c 5 0 丁 r s d 0 1 尺 c d u y c i s t r a n c 口 c o p s b c h e h p l c g c 符号说明 有机碳分配系数 水解常数 活化能( k j m 0 1 ) 半衰期 吸附常数 手性柱的一种 d a p h n i am a g n a 半致死浓度 半抑制浓度 温度，k 相关性系数 标准方差 旋光检测器 圆二色检测器 紫外检测器 反式 顺式 初始浓度 给定反应时间时的浓度 有机磷农药 丁酰胆碱酯酶 高效液相色谱 气相色谱 浙江工业大学硕士学位论文 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙 江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明 的法律责任。 作者签名：扬擘三 日期：矽略年月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密“ ( 请在以上相应方框内打“扩) 作者签名：扬华云 导师躲叫中屏 导师签名： 纱vf b 箭 b 期：矽，年月2 日 日期：力昭年月2 日 有机磷农药毗唑硫磷环境行为研究 1 1 前言 第一章文献综述 随着农业经济的发展，农药己日益成为农业生产中不可缺少的生产资料，在 粮食等作物的稳产、高产和产品质量等方面起着极其重要的作用。伴随着农业机 械化程度的提高，预计农药的使用量和所起的作用将更加巨大。在农药广泛使用 的同时，农药也带来了严重的环境污染，并己引起了人们的高度关注。根据美国 环保局对4 5 个。) i 1 6 8 8 2 4 e l 井地下水的监测分析和统计结果，有1 0 0 0 0 ( 1 4 ) 口井的 地下水中农药含量超过健康标准，有13 0 种农药及其代谢物被监测出，其中3 5 种 超过健康标准。地表水受污染的程度也是极其严重的，据美国环保局预测，在美 国己有1 6 5 ，0 0 0 公里的河流、8 3 0 ，0 0 0 公顷的湖泊、水库受到农业生产活动中农药 污染的影响【i ，2 】。我国珠江三角洲一些城市水体的监测结果表明，几种有机氯农 药虽然己经停止生产多年，但在污水及河水中仍有残留【3 】o 美国科学院在1 9 9 3 年 7 月提交的一份报告中，对目前食品中的农药残留量以及农药对儿童健康的影响 提出质疑，呼吁人们加强对农药的进一步研究和了解【4 】。 农药环境行为的研究主要包括农药在土壤中的吸附和脱附，农药的水解，农 药在土壤、水体和其它固体表面的降解( 光降解) ，农药在土壤中的降解( 化学降解 和生物降解) ，农药在土壤中的淋溶、迁移，农药在环境中的转化，农药与土壤 活性组份作用机理等七个方面。农药环境行为的研究是农药使用过程中不可忽略 的问题，这方面的研究工作有助于对现有农药和新农药的污染规律及危害性的了 解，为采取必要、有效的防治措施提供科学依据，为新农药的合成提供理论指导 【5 】。 当今世界上使用的农药中有2 5 是具有手性中心( 又称不对称中心) 的分子 【6 】，具有手性中心的农药通常称为手性农药，手性农药分子的手性中心一般为碳、 磷或氮等原子。手性中心原子与4 个不同的基团( 或原子、电子对) 相连或分子结 构由于立体因素而引起不对称，这种由分子的不对称引起的异构现象类似左手是 右手的镜像一样，所形成的异构体称为对映异构体( e n a n t i o m e r ) ，对映异构体比 浙江工业大学硕士学位论文 2 有机磷农药毗唑硫磷环境行为研究 例为1 ：l 的混合体称为外消旋体( r a c e m a t e ) 。有机磷、苯氧羧酸类、拟除虫菊酯类 农药大多具有一个或多个手性中心，形成一对或多对对映体。手性农药在非生物 过程中( 如光降解、水解等) 一般不存在明显的对映体选择性，但大多数手性农药 在生物过程中( 如微生物降解、毒性等) 会表现出明显的对映体选择性1 7 ，8 】，手性农 药进入环境后会涉及到很多的生物过程，因此手性农药的环境行为应该在对映体 层面上展开。 吡唑硫磷，商品代码为“t i a 2 3 0 ”【9 】，化学名称为o - 1 ( 4 - 氯苯基) 吡唑4 基 o 乙基s 丙基硫代磷酸酯，是日本武田药品工业公司开发的含硫代吡唑磷酸酯。 吡唑硫磷具有一个磷手性中心，一对对映体，其结构见图卜l 。它对水果、蔬菜 和其它作物中的鳞翅类、甲虫类、螨虫类和线虫类具有优良的防治效果。根据美 国e p a 的分类，吡唑硫磷属于类一中等毒性组( 老鼠口服的l d 5 0 为5 0 5 0 0 m g k g ) d o 。 i 小i ! i o 卜 厂、泠。 图1 - 1 吡唑硫磷的结构式 f i gl - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fp y r a c l o f o s 关于吡唑硫磷环境行为，国内外研究极少，特别从手性层面上研究毗唑硫磷 的环境行为，目前国内外均未见报道。为了全面了解吡唑硫磷在环境中的滞留、 迁移、转化、毒理行为，本文研究了吡唑硫磷在缓冲溶液中的水解动态、在土壤 中的吸附及其在对映体层面上研究了吡唑硫磷的对映体选择性毒性。 1 2 有机磷农药水解综述 农药的水解是农药分子与水分子发生相互作用的过程，它是农药在环境中消 失的重要途径，与农药在环境中的持久性密切相关，是影响农药在环境中归宿机 制的重要判据之一，也是评价农药在水体中残留特性的重要指标 1 1 】。 有机磷农药多数为磷酸酯或硫代磷酸酯。它们均可以在酸性和碱性条件下发 生水解，但水解机理有所不同。磷酸酯在碱性条件下，羟基负离子进攻磷酰基的 磷原子，形成五配位磷过渡态，随后烷氧基离去，该反应属于s n 2 ；而在酸性或 浙江工_ k 大学硕士学位论文3 有机磷农药吡唑硫磷环境行为研究 中性条件下，首先磷酸酯p o c 键上的氧原子质子化，再由水分子进攻碳原子， 发生s 2 反应f 1 2 】。对于硫代磷酸酯来说，其碱性水解与磷酸酯相似，均为s n 2 反 应机理，但由于烷硫基比烷氧基酸性强，烷硫基常作为离去基团，即其水解时 p s 键断裂；而在酸性水解时，也是p s 键断裂，但水解过程不同，它是先通过 s 原子的质子化，再由水分子直接进攻p 原子进行的。部分农药水解动力学参数 见表1 1 。 表1 1 部分农药的水解动力学参数 t a b l e l 1k i n e t i cd a t af o rt h eh y d r o l y s i so f p e s t i c i d e 敌敌畏 2 5 甲基对硫磷 2 5 涕灭威 1 5 涕灭威亚砜 1 5 灭幼脲 2 5 杀虫双 5 0 3 0 4 7 1 4 8 。9 4 3 0 4 7 1 4 8 9 4 6 7 8 6 7 8 6 7 8 7 9 3 1 2 x 1 0 - 2 2 2 2 1 3 7 9 x 1 0 11 8 3 8 8 9 x1 0 10 。7 8 6 0 0 x 1 0 - 31 1 5 5 0 1 9 9 x 1 0 23 4 7 9 2 7 6 x 1 0 - 22 5 1 1 3 3 5 x 1 0 r 42 1 0 0 4 4 5 x1 0 。41 5 5 7 2 5 l 1 0 33 2 3 3 4 3 x1 0 - 42 0 2 3 2 1 2 x 1 0 - 33 2 6 7 3 4 x1 0 3 、 9 4 7 9 0 x1 0 - 28 7 8 1 2 2 x 1 0 15 6 9 1 4 9 x1 0 4 6 5 3 6 5 3 6 5 8 9 8 7 8 1 8 7 7 9 0 0 1 1 4 9 5 9 0 2 7 8 2 7 6 7 8 6 7 6 8 3 0 7 1 5 6 1 1 9 4 5 0 x 1 0 - 2 1 2 4 浙江工业大学硕士学位论文4 有机磷农药毗唑硫磷环境行为研究 1 3 有机磷农药吸附综述 农药在土壤中的吸附被认为是农药在土壤一水环境中归宿的主要支配因素 【1 7 】。从环境的观点看，对农药在土壤上吸附的了解是极其重要的，因为它影响其 它一些决定农药最终归宿的过程，如化学、生物降解，挥发，植物的吸收，扩散， 在土壤中沥滤和对地下水的污染【1 8 ，1 9 】。一般而言，农药被土壤强烈吸附后，其生 物活性和微生物对它的降解性能都会减弱。吸附性强的农药，其移动和扩散能力 弱，不易迸一步造成对周围环境的污染。 1 3 1 影响吸附的因素 1 3 1 1 土壤有机质含量( o m ) 许多实验表明腐植质对农药( 尤其是非离子类农药) 的吸附量远远超过其它 土壤成份的吸附量，这充分证明了土壤有机质在农药吸附中的重要作用f 2 0 】。土壤 有机质中含有多种疏水基、亲水基、游离基等官能团，一般情况下其含量越高， 吸附越强。根据w a l k e r 等【2 1 】的研究，a t r a i z e ( 莠去津) 、p r o m e t r y n e ( 手l 草净) 、 p r o m e t o i e ，p r o p a z i n e 在3 6 种土壤中的吸附和土壤有机质含量具有很强的相关性， 相关系数r 2 为0 9 2 0 9 6 。又如沙蚕毒素在五种不同类型土壤上吸附的k 艟与土壤 有机质含量o m 之间的相关性极为显著( r 2 = 1 0 0 0 ) 1 6 。绿草定在6 种土壤上吸附 的研究也表明，其吸附等温线的f r e u n d l i e h 常数k f 和土壤o m 具有正相关关系 【2 2 】。 1 - 3 1 2 土壤粘土含量 粘土矿物是土壤中另一类活性成份，它主要包括高岭石矿物、滑石一叶蜡石 矿物、间层( 混层) 粘土矿物和非晶质粘土矿物【2 3 】。研究表明，蒙脱石对农药的吸 附作用要比伊利石、高岭石强，因为前者为双层结构，对有些农药能形成内层配 合物【2 4 】。异丙甲草胺在粘土、腐植质上的吸附研究发现c a - 蒙脱石、土壤腐植酸 的f r e u n d l i c h 吸附常数分别为2 4 8 ，2 0 7 ，这说明粘土对异丙甲苯胺的吸附性能 不亚于土壤腐植酸 2 5 】。 1 3 1 3 土壤p h 值 通常p h 值降低，农药的吸附量升高。尤其对于离子型及有机酸农药的吸附， p h 值影响更大，当p h 值趋近农药的p k a 时，吸附最强【2 6 】。有时为了研究p h 值的 浙江工业大学硕士学位论文 有机磷农药毗唑硫磷环境行为研究 变化对农药在同土壤上吸附的影响，常采用1m o l l 的h c l 及1m o l l 的n a o h 对 土壤p h 值进行改变，以研究其对吸附的影响【2 ，】。研究表明，p h 值的下降有利于 绿草定【2 2 】、利谷隆【2 7 】在土壤上的吸附。这一般决定与农药分子的结构，当p h 值 上升时，土壤表面趋于带负电荷，这时如农药分子也趋于离子化而带负电荷，由 于同性电荷的排斥作用，将不利于农药分子在土壤表面的吸附【2 8 】。 1 3 1 4 土壤阳离子交换容量c e c 当农药分子质子化后以阳离子形式存在时，可与粘土矿物或腐植质发生阳离 子交换吸附【2 9 】。此时土壤阳离子交换容量c e c 的大小将直接影响农药在土壤上的 吸附。根据f e l s o t 和d a h m 对有机磷、氨基甲酸酯杀虫剂在不同土壤上吸附的研究， l o g k e - 与c e c 存在极显著相关【2 0 】。 1 3 2 吸附等温线与吸附类型 w e b e r 和p e t e r 的研究1 3 0 】指出甲草胺和异丙甲草胺在有机质上的吸附等温线 为l 型，在蒙脱石上的吸附为s 型。l 型吸附等温线意味着吸附剂对农药分子有高 吸着力，吸附为平面构型，且是多官能团健合；s 型吸附等温线意味着土壤对水 分子比对农药分子有更高的吸着力，吸附为垂直构型，且是单官能团健合。甲草 胺和异丙甲草胺以平面构型被有机质吸附，通过农药分子的羧基和有机质表面的 o h 以氢键结合，也可以通过农药分子的芳核和有机质表面的芳环进行电荷转移 键合。甲草胺和异丙甲草胺可通过羧基和粘土表面的阳离子进行单官能团的配位 而被无规则地吸附，它可以被吸附于粘土内层表面，也可能相互发生键合。 1 4 手性有机磷农药的对映体分离综述 手性化合物的分析可分为直接分析和手性拆分两大类。直接分析法主要包括 旋光度测定法、核磁共振法、同位素稀释法、量热法和酶法等【3 1 】。旋光度测定法 有其局限性，它必须先知道单一对映体的比旋光度，要求化合物有中等以上的比 旋光度值，而且影响因素复杂，样品用量大，这些都使该方法在测定对映体纯度 时在灵敏度，精确度和可靠性上无法满足现代分析的要求【3 2 】。而核磁共振法，同 位素稀释法，量热法和酶法等凹或是因为仪器昂贵，操作繁琐，或是因为可靠性 和精确度不够，都没能得到普遍的应用。手性拆分法主要包括：直接结晶拆分法， 化学拆分法，生物拆分法和色谱法。 浙江工业大学硕士学位论文 有机磷农药毗唑硫磷环境行为研究 在诸多方法之中，色谱法通过将对映体分离完成对微量样品的分析测定，方 法简单快速，可靠性好，“准确度和精确度高，应用范围广，而且为得到高纯的单 一旋光手性化合物提供了一种简便快速的方法。所以在近2 0 年间得到了迅猛的发 展，已在科研、质检等领域得到了广泛的应用。利用色谱法拆分手性化合物有以 下一些方法：纸色谱法( p c ) ，薄层色谱法( t l c ) 、气相色谱法( g c ) ，高效液相色谱 法( h p l c ) 、超临界色谱法( s f c ) 、经典电泳法、毛细管电泳法( c e ) 、电色谱法( c e c ) 和高效膜色谱法( h p m c ) 等。 1 4 1 高效液相色谱法 从2 0 世纪8 0 年代开始，高效液相色谱( h p l c ) 以其公认的直接、快速、 高效、简便和适用范围广等优点得到迅速发展，逐渐成为对映体拆分的一种重要 手段。h p l c 拆分方法包括直接法和间接法两种，直接法又可分为手性流动相添 加剂法和手性固定相法。目前认为手性固定相法是非常简单而有效的方法。其优 势在于：可用于多种外消旋体的拆分：可以同时高收率地得到两种高旋光纯度的 对映体；可以拆分一些特殊的外消旋体( 如不能衍生化或易消旋的化合物，具有 特殊手性结构如螺旋或螺旋桨构象的化合物) ；可实现大量制备，可用于制备性 分离。特别适用于极性强、热稳定性差的手性药物的分析 3 3 , 3 4 。 手性固定相法的研究发展异常迅速，大量的各种固定相研制成功，并开展了 有关作用机理的研究。c s p 可分为以下几类：( i ) 配体交换色谱c s p ：d a v a n k o v 等 首次用配体交换色谱拆分d l - 脯氨酸：还将l 脯氨酸健合到树脂上，经吸附c u ( i i ) ， n i ( i i ) 或z n ( i i ) 后，拆分了氨基酸对映体；后来，他们还以交联聚苯乙烯为载体， 以l 氨基酸为固定配体，合成了多种手性固定相。上述固定相虽然对映体选择性 强，但疏水性太高，氨基酸在色谱过程中传质困难，因此，人们又选用亲水性聚 合物如交联聚丙烯酞胺、交联聚甲墓丙烯酸醋和交联聚乙烯胺，虽然实现了d l 氨基酸的快速拆分，但机械强度较差【3 5 】。直n 6 u b i t z 等人使手性配体与硅胶结合， 从而将汞水性、高选择性和高强度的优点集于一体。( 2 ) “刷型 c s p ：m i k e s 等 首先报道了n 电荷转移接受体四硝基一9 一亚芴基氨基氧化丙酸( t a p a ) 健合到氨 丙墓硅烷化硅胶上制得的手性“刷型”c s p ，并分离了螺烯对映体。p i r k l e 在这 方面做了大量指导性的工作：提出了“互为相反作用原则”、“插入和非插入过程 、 “直接目标设计等思想：并且制备了许多c s p ，如第一们碱性的“刷型 c s p ，7 【 浙江工业大学硕士学位论文 有机磷农药吡唑硫磷环境行为研究 酸型的n ( 3 ，5 d n b ) 甘氨酸衍生物c s p 。亮氨酸衍生物c s p 、乙内酞脉类舡碱型c s p 和脉链型固定相等。此外，仅靠形成氢键的作用而拆分的固定相也有不少报道， 它们能拆分各种含有可形成氢键位置的外消旋体。含多个手性中心的“刷型 c s p 已经商品化并普遍使用，如o i 等报道的酰基化的氨基酸和菊酸为手性选择剂 的c s p 等。w e l c h 还报道了一个可模印的刷型c s p 3 6 3 7 。( 3 ) 大环c s p ：包括经修饰 的环糊精、手性冠醚和大环类抗生素作为手性选择剂的c s p ，a r m s t r o n g 等人对 c d 键合固定相的发展作出了杰出的贡献，基于含氮原子c d 键合相的缺点，他们 发展了一种不含氮的c d 键合相：将p c d 的2 一位的羟基用甲基或乙酰基官能团化， 一些在p c d 键合相中不能得到完全分离的化合物在衍生化的p c d 柱上得到了很 好的分离；还成功的开发了a c d 的键合相、制备了一系列酰基和异氰酸酯衍生 化的p c d 、合成y ( r ，s ) 2 和( s ) 一2 羟基丙基的p c d 固定相等【3 8 】。( 4 ) 蛋白质c s p ： s t e w a r t 和d o h e r t y 首次将牛血清白蛋白( b s a ) 键合到琼脂糖上并在其上成功的拆 分了d l - 色氨酸：其后有人将a 酸性糖蛋白( 0 【a g p ) 和b s a 化学键合到硅胶载体 粒子上用于h p l c 手性拆分【3 9 】。目前已经报道的被用作h p l c 手性分离的蛋白质 有b s a 、h a s 、伴清蛋白( c o n ) ，黄素蛋白、0 【一a g p 、胰蛋白酶、卵类粘蛋白( o v m ) 、 抗生物素蛋白( a v l ) 、溶菌酶、0 l 。胰凝乳蛋白酶( 仅c h t ) 、纤维素水解酶- - i ( c b h i ) 和鸡蛋白抗生物素结合蛋t 刍( r f b p ) 等。( 5 ) 此外，还有聚合物c s p ( 包括天然的多 糖衍生物如纤维素、淀粉及合成的手性聚合物制备的c s p ) 和分子印模c s p 等。 目前，很多知名公司都推出了商品化的手性柱，这为我们研究手性农药的环 境行为提供了极大的便利。其中基于环糊精的h p l c 手性固定相如 c y c l o b o n d l2 0 0 0 r n ，s n ，a c 和d m 可以在反相和极性有机模式下分离手性 农药；还有新近发展起来的大环糖肽固定相如c h i r o b i o t i cv 和t 在分离手性农 药中也显示出了很好的前景，这种固定相在正相和反相条件下都能够使用。而将 不同的h p l c 方法联用可以为准确测定痕量对映体纯和较大量的制备提供选择。 在用h p l c 分析时，不论是在农药种类、分析水平还是制备水平上基于大环抗生 素的固定相如c h l r o b i o t i cv 和t 都是最有用的工具。 1 4 2 气相色谱法 用于对映体混合物分析的受青睐的方法之一是手性气相色谱，它是最早用于 手性分离的方法。这种灵敏的方法不受痕量杂质影响，快捷而又便于操作。它的 浙江工业大学硕士学位论文 8 有机磷农药吡唑硫磷环境行为研究 原理是基于分子缔合可能导致充分的手性识别，因而产生对映体拆分。它使用含 有高纯对映体拆分辅助剂的手性固定相，要分析的对映体与固定相发生快速和可 逆的相互作用，其分离度取决于分析样品与固定相的相互作用强弱。 气相色谱中用于分离对映体的手性固定相主要有以下几类【加】：( 1 ) 以手性氨 基酸衍生物为选择体的二酰胺( 含手性聚合物固定相) 、二肽酯和二酰脲等，它们 可分离许多手性化合物 4 1 - 4 3 。异氰酸酯类和光气已成为多种化合物手性分离的万 能试剂；( 2 ) 光学活性金属配合物。s c h u r i g 提出了“络合气相色谱法”的概念， 把手性分离气相色谱推广到不足以生成氢键基团的化合物上。这一方法对分离信 息素特别有用，但受到热德定性的限制；( 3 ) 环糊精衍生物。它们为手性分离开 辟了一个新的途径，是最有前途的一种手性固定相。s a n d 等于1 9 6 1 年首先把环糊 精衍生物( c d s ) 用作填充柱气相色谱的固定液【4 4 】，1 9 8 2 年捷克的s m o l k o v a 对c d s 用作填充柱色谱固定相做了综合报道【4 5 】，但直至1 j 1 9 8 7 年才开始把c d s 及其衍生物 作为毛细管气相色谱固定相。j u v a n c z 等把全甲基化的p c d 用作毛细管气相色谱 柱的固定液；s c h u r i g 把全甲基化的p c d 和o v - 1 7 0 1 混合起来涂渍在毛细管柱上在 5 0o c 8 0o c 柱温下分离光学异构体f 蛔。1 9 8 8 年后k o e n i g 系统的研究了环湖精的各 种衍生物作毛细管气相色谱固定液，用以分离各种光学异构体。国内于1 9 9 1 年万 宏等报道了他们首次用全戊基化的b c d 作毛细管气相色谱固定液分离6 种对映 体的结果。此外，傅若农等在这方面做了大量研究【4 7 】。( 4 ) 冠醚。周喜春等合成 了一些冠醚修饰型手性固定液【4 8 】。曾昭睿等还合成环糊精一冠醚毛细管气相色谱 手性固定相【4 9 】。 能够用g c 方法分离的手性农药中，9 0 以上是在环糊精手性固定相的基础 上实现的。目前商品化的手性气相色谱柱的固定相基本上都是基于衍生化的环糊 精如g t a ( 2 ，6 二一o 一戊基3 一三氟乙酸基环糊精) ，b d m ( - - o 一甲基一环糊精) ， b - p m ( 2 ，3 ，6 三o 甲基环糊精) ，b p h ( s ) 2 经丙基甲基一环糊精】，b p t ( - - 氟 乙酰基b p h ) 和g p t ( - - 氟乙酰基g p h ) 。 在选择用g c 还是h p l c 方法上主要取决于农药的结构。一般农药都可能含有 芳香环、羧基、胺、羟基、氨基、烷氧基或烷基等官能团，h p l c 方法更利于分 离含有三个或者更多上述官能团的手性农药分子，而g c 方法则更易分离含较少 上述官能团的手性农药分子。 浙江工业大学硕士学位论文 9 有机磷农药吡唑硫磷环境行为研究 1 5 手性有机磷农药的对映体选择性毒性综述 关于手性药物对映体之间不同生物活性的研究工作已经开展了很多，但是对 手性污染物的对映体选择性毒性的研究却非常之少。大多数农药具有致癌作用和 毒性，它们可能破坏某个特定的身体器官比如肝脏、肾和骨髓等，而且还会改变 酶的活性f 5 0 】。此外，对映体选择性可能极大的影响手性农药在非耙标环境中的生 态毒理效应。由于对映体的选择性生物降解，特定的对映体可在地面水生生态系 统这样的非耙标环境中得到富集。通过非手性分析得到的农药浓度所指示的可能 与实际的生态毒理学效应并不相符。而且从经济和效率的目的出发，即使使用对 映体纯的农药也不一定能产生预期的环境效益。因此在研究时必须弄清它们对非 耙标生物毒性以及在敏感生态系统中生物降解或生物累积过程中的对映体选择 性。随着人类对环境污染物认识的不断深入，在对映体水平上研究农药的环境毒 理学将会成为必然。 有机磷农药被作为杀虫剂和杀菌剂广泛应用，有些也可用于除草。这些化合 物大都为含有p = s 或者p = o 键的正四面体结构： 酽 睁| 歹、 言 当取代基a 、b 和c 各不相同时，“p 原子就成为手性中心，这些化合物就 具有了手性。它们的一对对映异构体之间存在着不同的生物活性，包括毒性，酶 抑制活性和生物降解能力等。表1 2 给出了不同有机磷的对映体纯异构体的相对 毒性、酶抑制活性和生物降解能力等。对映异构体之间的体外( 砌v i t r o ) 活性如 乙酰胆碱酯酶( a c l l e ) 等可能不同，但是其中一个或多个对映体纯异构体的代 谢性解毒、中毒可能也是一个主要的因素【5 i 】。手性杀虫剂还会发生对映体局部选 择性代谢转化【5 2 5 5 】，尽管这些转化与对映异构体之间的活性差异并不相关。一般 来说，杀虫活性与小鼠毒性相关：通常r 型异构体相对于s 型具有更高的活性， 但是也有例外如苯硫磷的对映异构体对小鼠的毒性相似，而苯硫磷和稻丰散的异 构体对小鸡的毒性顺序确实相反的。总而言之，对映异构体之间的活性差异有的 时候非常大( 如苯腈磷及其地虫磷) ，而有的时候又非常小( 如蔬果磷) 。 浙江工业大学硕士学位论文 1 0 一一 查塾壁奎垄咝些堕壁至望堡垄里壅 - - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i - _ _ - _ - _ _ - _ - _ - - _ _ - - - - _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ i - _ _ _ _ 一一 表1 - 2 手性有机磷农药结构，对映体选择性毒性 t a b l e1 - 2s t r u c t u r ea n de n a n t i o m e r i cb i o t o x i c i t yo fc h i r a lo p s i _ i _ l l _ _ l _ _ _ l _ - 一i i i i i i _ - _ l i 一 化合物 体内( 砌v i v o ) 体外( 砌v i t r o ) 一_ - _ - - l - i _ l l - _ _ - - _ - _ l - _ - l - i _ l l i - - l - - 一 稻丰散( p h e n t h o a t e ) 杀虫活性( 蚊子，粘虫 乙酰胆碱酯酶抑制 ：一h ， o 龠泓 嚷i a 克线磷( f e n a m i p h o s ) h s 巷麓静 c h 3 s ) l w a o t t , ：h 3 - - 7 , 基马拉硫磷( d i e m ) d m a l a “o n ) 和二 唧 异马拉硫磷( i s o m a l a t h i o n ) 等) ： 试验： ( + ) ( ) 家蝇：( _ ) ( + ) 小鼠 毒性：( + ) ( - ) 【5 6 】 对溴磷毒性： 家蝇：( r ) - ( + ) ( s ) ( ) 小鼠：( r ) 寸) s ) - ( 一) 滞后神经毒性： 母鸡：( s ) 一( + ) ( r ) - ( - ) 大型蚤：( + ) ( - ) 【5 6 。5 8 】 大型蚤毒性： ( + ) ( - ) 【删 ( + ) ( ) 【5 6 】 乙酰胆碱酯酶抑制 试验：( + ) ( - ) 丁酰胆碱酯酶抑制 试验：( + ) ( 5 ) ( - ) 【5 9 】 丁酰胆碱酯酶抑制 试验： ( + ) ( 19 ) ( - ) 【删 杀虫活性( 家蝇) ： 乙酰胆碱酯酶抑制 ( + ) ( 2 ) ( - ) 试验：( + ) ( - ) 小鼠毒性： 羧酸酯酶抑制试 ( + ) ( 2 ) ( - ) 【6 i 6 2 验：( + ) ( 一) 【6 1 】 乙酰胆碱酯酶抑制 试验： ( r ) ( x 8 6 ) ( s ) t 6 3 1 乙酰胆碱酯酶抑制 试验：( r ) ( 3 1 3 ) ( s ) 脑乙酰胆碱酯酶抑 制试验：( r ) ( 4 9 ) ( s ) 浙江工业大学硕士学位论文 有机磷农药毗唑硫磷环境行为研究 苯硫磷( e p n ) 阿c 2 h s q , p h 云ro n 。： g p o n 。： 苯腈磷 c y a n o 矗跚p h o s ( 0 4 c y 强叩h e n y l d e t h y lp h e n y l p h o s p h o n o t h i o a t e ) 】 子o c n s - a l k y l o - 4 - n i t r o p h e n y l - m e t h y l p h o s p h o n o t h i o a t e 吣n 吼 a 0 ( s ) 一 ( - ) 母鸡毒性：( s ) - ( - ) ( r ) - ( + ) 小鼠毒性：0 t ) 一( + ) = ( s ) 一 ( - ) f 6 4 6 5 】 杀虫活性： ( r ) - ( + ) ( 2 0 ) ( s ) - ( 一) 小鼠毒性： ( i u - ( + ) = ( s ) - ( 一) 1 6 6 , 6 7 杀虫活性： ( 一) ( + ) 【6 8 】 杀虫活性： ( -