（环境工程专业论文）滨海湿地土壤微生物的群落结构研究.pdf

合肥工业大学 ) i ! l l ! l l ! l r l l l l ll l ! llllllllllllllllljllllll y1b19 6 8 3 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合合肥工业 大学硕士学位论文质量要求。 主席：同1 痛铁辕涵哆z 、叫院弓工 缴一轰 糯愚名问已纵、子 弘狄 删锄易观撑砀季抠t 弘匕厅m ，咖亏 函苏循 刷矶 霸缸研 八 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得 金胆王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 圣餐 签字日期： p 乎年6 月，日 学位论文版权使用授权书 王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复锖手段保存、汇编学位论文。 ( 纠研他处彳署绷二p ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)i 。 学位论文作者签名： 王譬 签字日期： ，睁月f ，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期： 电话： 邮编： 以1 j 阳 厉 肌 ，九 石殁嘛 致谢 时光茬蒋，转眼到了毕业分别的季节，在此硕士论文完成之际，我要特别感 谢我的导师周元祥老师，衷心感谢周老师在研究生三年期间对我的悉心指导。他 严谨治学的态度、严于律己的作风使我终生受益。 感谢北京大学的吴晓磊教授和清华大学的余素林博士在微生物学和分子生 物学领域的基本原理和实验技术所给予指导和帮助。 感谢在实验室并肩奋斗的陈康、池昌桥和姜正风在实验中给予的帮助。 感谢我的父母，他们对我无私的支持和宽容，对我的殷切期盼是激励我不断 奋进的人生动力。 最后感谢所有帮助过我的老师、同学和朋友们。 王赞 2 0 0 8 0 6 滨海湿地土壤微生物的群落结构研究 摘要 黄河三角洲湿地属于典型的滨海河口湿地，具有中国暖温带地区最完整、最 广阔、最年轻的新生湿地生态系统。黄河三角洲滨海湿地受海陆共同作用，生态 系统复杂而脆弱，其中包括我国第二大油田胜利油田，石油开采等人类活动 产生的污染物质已经进入滨海湿地，最终可能污染海洋。滨海湿地可以通过植物 吸收，化学和生物学等过程分解有害的污染物质，具有一定的自净能力，在这些 过程中各种微生物的活动起着关键性作用，阻止和延缓了污染物质进入海洋。了 解黄河三角洲湿地土壤中微生物的群落结构和分布，对开发其中微生物资源和保 护黄河三角洲湿地以及海洋环境具有重要的意义。 本研究采用终端限制性片段长度多态性分析( t r f l p ) 技术和1 6 sr d n a 克隆文库的方法分析黄河三角洲滨海湿地土壤微生物的群落结构。研究表明，该 土壤具有非常丰富的细菌和古菌资源，细菌有变形菌门、放线菌门、绿非硫细菌 等1 8 个大类群，其中6 变形菌纲、丫变形菌纲和放线菌门所占比例较大。古菌 有m a r i n eg r o u pi 、嗜盐杆菌、鬃毛甲烷菌等7 个类群。还有各种硫酸盐还原菌、 产甲烷古菌、光合细菌等具有降解污染物质功能的多种微生物，微生物种群的多 样性使得土壤有较好的自净能力和承受污染的能力。 用t r f l p 技术和聚类分析手段对三个钻孔土壤的不同深度和2 个系列共1 1 个土壤样品的微生物群落结构进行分析，表明群落结构随着深度的增加呈现出一 定规律的层状分布，且表层不同采样点的微生物群落结构差异较大。微生物群落 结构和多样性在空间和纵向深度上的差异主要是受土壤性质以及污染物质的影 响。 关键词：滨海湿地；微生物群落结构；t - r f l p i 1 6 sr d n a 克隆文库 t h ew e t l a n di ny e l l o wr i v e rd e l t ai st y p i c a lc o s t a lw e t l a n da n di th a st h em o s t c o m p l e t e ，b r o a d e s ta n dy o u n g e s tn e w b o r n w e t l a n de c o s y s t e mi nt h ew a r mt e m p e r a t e z o n eo fc h i n a t h ec o a s t a lw e t l a n d ，i n f l u e n c e dm u t u a l l yb yt h eo c e a na n dl a n d ，h a s c o m p l e xa n df r a g i l ee c o s y s t e m i th a sc h i n a ss e c o n dl a r g e s ts h e n g l io i lf i e l dt h e r e a n dt h ee x p l o r a t i o no fp e t r o l u ma n do t h e rh u m a na c t i v i t i e sh a v eb r o u g h tp o l l u t i o nt o t h ew e t l a n d ，w h i c hm a yu t i m a t e l yp o l l u t et h eo c e a n h o w e v e r , t h ew e t l a n dh a s s e l f - p u r i f i c a t i n ga b i l i t yd u et ot h ed e g r a d a t i o no fp o l l u t a n t st h r o u g ha s s i m i l a t i o no f p l a n t sa n dc h e m i c a la n db i o l o g i c a lp r o c e s s 1 1 砖a c t i v i t yo f d i f f e r e mm i c r o o r g a n i s m s i sv i t a li nt h ep r o c e s sa n dt h et r a n s p o r t a t i o no fp o l l u t a n t st ot h eo c e a nm a yb e e f f e c t i v e l yp r e v e n t e d s ot h ei n v e s t i g a t i o no ft h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eo f t h es o i li si m p o r t a n tt ot h ee x p l o r a t i o no ft h em i c r o b i a lr e s o u r c e sa n dt h ep r o t e c t i o no f y e l l o wr i v e rd e l t aw e t l a n da n dt h eo c e a n t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s ma n d16 sr i b o s o m a ld n a c l o n el i b r a r ya n a l y s i sw a sc o n d u c t e dt oa s s e s sm i c r o b i a ld i v e r s i t ya n dc o m m u n i t y s t r u c t u r e s n es t u d ys h o w st h a tt h ew e t l a n ds o i lh a sv e r yr i c hr e s o u r c eo fb a c t e r i a s a n da r e h a e a s t h em i c r o b i a lc o m m u n i t yh a s18g r o u p si n c l u d i n gp r o t e o b a c t e r i a ， a c t i n o b a c t e r i a ，c h l o r o f l e x ia n ds oo n a n dt h e r ea l e7g o u p so fa r c h a e a si n c l u d i n g m a r i n eg r o u pi ，h a l o b a c t e r m ，m e t h a n o s a e t aa n ds oo n w ef o u n dm a n ys e q u e n c e s t h a t 砌c l o s e l yr e l a t e dt om i c r o o r g a n i s m sw h i c hc o u l dd e g r a d a t ep o l l u t a n t s ，l i k e s u l f u r - r e d u c i n gb a c t e r i a , m e t h a n o g e n i ca r c h a e a 、p h o t o t r o p h i cb a c t e r i aa n ds oo n s u c h r i c hm i c r o b i a lc o m m u n i t i e sm a k et h es o i lh a v en a t u r a la t t e n u a t i o np o t e n t i a la n dt h e a b i l i t yt or e s i s tt op o l l u t i o n 1 1 1 em i c r o b i a lc o m m u n i t ya n a l y s i so fd i f f e r e n td e p t h so ft h r e es o i lc o r e sa n dt w o s e r i e so fs a m p l e sa td i f f e r e n ts t a t i o nb yt - r f l pa n dc l a s s i f ya n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h e b a c t e r i a la n da r c h a e a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e so fd i f f e r e n td e p t h ss u b j e c tt os t r a t i f i e d d i s t r i b u t i o na n dt h e r ee x s i t e dg r e a tm i c r o b i a ld i f f e r e c eb e t w e e nt o p s o i la td i f f e r e n t s a m p l i n gs t a t i o n n es p a t i a l v a r i a t i o n sa n dd e p t hc h a n g e so ft h em i c r o i b a l c o m m u n i t ys t r u c t u r ea n ds p e c i e sr i c h n e s sa l ec a u s e dm a i n l yb yt h en a t u r eo f t h es o i l s a n dt h eo c c u r e n c eo fp o l l u t i o n k e yw o r d s ：c o a s t a lw e t l a n d = m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e l t e r m i n a lr e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ；16 sr i b o s o m a ld n a c l o n el i b r a r y i i i 目录 第1 章绪论1 1 1 研究背景与意义1 1 1 1 湿地定义及类型。l 1 1 2 滨海湿地的重要特征1 1 1 3 黄河三角洲湿地概况1 1 1 4 湿地受污染状况及污染源调查2 1 1 5 石油开发对湿地的影响途径3 1 1 6 本工作区湿地的污染源4 1 1 7 本研究提出的依据5 1 2 湿地环境中微生物群落研究进展5 1 3 微生物群落的研究方法7 1 3 1 传统培养的方法7 1 3 2 非培养的方法7 1 4 研究目的和意义l0 1 5 研究内容1 1 第2 章实验材料和方法1 2 2 1 采样点布置和样品采集1 2 2 2f r f l p 对微生物群落结构的分析方法1 3 2 2 1 湿地样品d n a 的提取13 2 2 2p c r 扩增反应。1 4 2 2 3p c r 产物的纯化15 2 2 4 纯化后p c r 产物的酶切反应l5 2 2 5 酶切产物的脱盐16 2 2 6 毛细管电泳分析。1 6 2 2 7 克隆文库构建1 7 2 3 数据分析方法19 2 3 1 多样性指数计算。1 9 2 3 2 聚类分析2 0 第3 章古菌和细菌克隆文库的构建2 l 3 1 古菌克隆文库。2 1 3 2 细菌克隆文库2 5 3 3 ，j 、结3 3 第4 章表层土壤微生物群落结构分析3 4 4 1 弓i 言3 4 4 2 实验材料与方法3 4 4 3 结果和分析。3 4 4 3 1 重点站位采样点土壤样品的微生物群落结构分析3 4 4 3 2 柱状采样点土壤样品的微生物群落结构分析3 7 4 4 微生物在湿地环境中的生态地位4 0 4 4 1 古菌在湿地环境中的生态地位4 0 4 4 2 细菌在湿地环境中的生态地位4 0 4 5 讨论。4 2 i v 第5 章不同深度土壤微生物群落结构分析4 3 5 1 引言4 3 5 2 实验材料与方法4 3 5 3 结果和分析4 3 5 3 1 钻孔z k l 土壤样品的微生物群落结构分析4 3 5 3 2 钻孔z k 3 土壤样品的微生物群落结构分析4 8 5 3 3 钻孔z k 5 土壤样品的微生物群落结构分析5 0 5 4 卅、结5 3 第6 章结论和建议5 4 6 1 结论5 4 6 2 建议5 4 参考文献5 5 v p c r t r f l p t i 己f b p i 强u o t u s r b g n s 主要符号对照表 聚合酶链式反应 末端限制性片段长度多态性 末端限制性片段 碱基对 荧光强度单位 分类单元 硫酸盐还原菌 绿色非硫细菌 v i 插图清单 图1 1 黄河三角洲湿地分布2 图1 2 本研究工作区( 2 0 0 7 ) 示意图2 图1 3 黄河三角洲湿地功能框图3 图1 4 湿地中物质的转化5 图1 5t - r f l p 法分析微生物群落结构流程图1 0 图2 1 黄河三角洲湿地采样点分布图1 0 图3 11 8 3 b p 古菌克隆的a r d a r 分型结果2 5 图3 2 古菌克隆文库的组成示意图2 6 图3 34 6 5 b p 细菌克隆文库的a r d a r 分型结果2 5 图3 4 细菌克隆文库的组成图2 6 图4 1 重点站位土壤样品古菌t - r f 的柱状堆积图3 4 图4 2 重点站位土壤样品细菌t - r f 的柱状堆积图3 5 图4 3 重点站位土壤古菌聚类分析图3 6 图4 4 重点站位土壤细菌聚类分析图3 6 图4 5 柱状采样点土壤古菌t - i 心的柱状堆积图3 7 图4 6 柱状采样点土壤细菌t - r f 的柱状堆积图3 8 图4 7 柱状采样点土壤古菌聚类分析图3 9 图4 8 柱状采样点土壤细菌聚类分析图3 9 图5 1z k l 不同深度土壤古菌t - r f 的柱状堆积图4 3 图5 2z k l 不同深度土壤细菌t - r f 的柱状堆积图4 5 图5 3z k l 不同深度土壤古菌图谱的聚类分析树状图4 7 图5 4z k l 不同深度土壤细菌图谱的聚类分析树状图4 7 图5 5z k 3 不同深度土壤古菌t - r f 的柱状堆积图4 8 图5 6z k 3 不同深度土壤细菌t - r f 的柱状堆积图4 9 图5 7z k 3 不同深度土壤古菌图谱的聚类分析树状图5 0 图5 8z k 3 不同深度土壤细菌图谱的聚类分析树状图5 0 图5 9z k 5 不同深度土壤古菌t - r f 的柱状堆积图5 1 图5 1 0z k 5 不同深度土壤细菌t - r f 的柱状堆积图5 2 图5 1 1z k 5 不同深度土壤细菌图谱的聚类分析树状图5 2 图5 1 2z k 5 不同深度土壤细菌图谱的聚类分析树状图。5 3 列表清单 表1 1 东营市工业废水中各污染物污染负荷指数统计4 表1 2 湿地微生物群落研究概况5 表2 1 各采样点的位置和描述1 3 表2 2p c r 反应体系1 4 表2 3r s a i 和t a q i 的酶切位点。l6 表2 4 酶切体系1 6 表2 5 构建克隆文库所需试剂1 7 表2 6 菌落p c r 扩增体系1 9 表3 1 古菌克隆文库的测序克隆与g e n b a n k 的比对结果2 2 表3 2 细菌克隆文库的测序克隆与g e n b a n k 的比对结果2 7 表4 1 重点站位微生物群落结构的多样性分析3 6 表4 2 柱状采样点微生物群落结构的多样性分析3 9 表5 i z k l 微生物群落结构的多样性分析4 6 表5 2 z k 3 微生物群落结构的多样性分析4 9 表5 3 z k 5 微生物群落结构的多样性分析。5 2 v i l l 第l 章绪论 1 1 研究背景与意义 1 1 1 湿地定义及类型 湿地是指天然或人工、长久或暂时性的、流动或静止的地面积水，包括淹没 很充分的沼泽地、湿草原、泥炭地和淡、咸水湖泊以及盐沼水域地带等，还包括 低潮时不超过6 m 的浅海水域，其作为地球上生产力最高的生态体系，与森林和 海洋并称为地球三大生态系统【。水库、稻田、池塘以及养殖水面称为人工湿地 【2 】 o 通常，除去人为构建的人工湿地，自然湿地可分为内陆湿地和滨海湿地两大 类。而滨海湿地受海陆共同作用，是脆弱的生态敏感区域。根据我国的实际情况， 滨海湿地定义为【l 】：陆缘为含6 0 以上湿生植物的植被区、水缘为海平面以下 6 m 的近海区域，包括江河流域中自然的或人工的、咸水的或淡水的所有富水区域 ( 枯水期水深2 m 以上的水域除外) ，不论区域内的水是流动的还是静止的、间 歇的还是永久的。我国湿地面积达3 8 4 8 x 1 0 4 h m 2 ，居世界第4 位，其中滨海湿地 面积约为5 9 4 x10 4 h m 2 。 1 1 2 滨海湿地的重要特征 ( 1 ) 拥有非常丰富的微生物资源：滨海湿地中独特的梯度变化的地质环境 条件和人类活动的影响，造就了滨海湿地中特殊的微生物、微生物种群和群落。 这些微生物从陆地微生物到海洋微生物演替，并具有独特功能和基因资源。 ( 2 ) 是人类活动影响海洋最为剧烈的区域：人类的生产活动产生的污染物 质通过滨海湿地输送到海洋，所以人类对湿地的影响，以及污染物质在湿地中的 变化直接影响着海洋的环境质量以及海洋产业。 ( 3 ) 具有净化污染物的功能：通过植物吸收，化学和生物学等过程能分解 有害的污染物质，这种环境净化功能在阻止和延缓污染物质进入海洋方面发挥了 十分重要的作用。 1 1 3 黄河三角洲湿地概况 黄河三角洲的地理坐标范围为东经l18 0 3 0 - 119 0 2 5 ，北纬3 7 0 3 0 一3 8 015 ，位 于渤海西岸，地处渤海湾与莱州湾湾口，是典型的滨海河口湿地。包括东营、滨 州两市的全部和淄博市的高青县。 黄河三角洲湿地是暖温带增长速度最快的新生湿地，是在黄河不断冲积、淤 积和海水潮起潮落水动力共同作用下形成的。黄河平均每年约携带1 o x l 0 9 t 泥沙 输入到河e l 区，其中约4 5 x 1 0 8 t 淤积在滨海地带，缔造了以渔洼为顶点的现代三 角洲，指状辐射河道高地之间的河间洼地以及背河洼地、三角洲前部海陆交替带 等构成三角洲湿地空间。面积为4 5 x 1 0 5 h m 2 ，其中2 0 x 1 0 5 h m 2 为潮上带湿地， 1 0 x 1 0 s h m 2 为潮间带湿地，1 5 x 1 0 5 h m 2 的潮下带湿地，人工湿地6 8 4 x 1 0 5 l m 2 3 1 。 本研究的工作区见图1 2 “2 0 0 7 年工作区”所示，对照图1 1 ，可以看出此区湿地 类型以沼泽湿地为主，还有部分潮间带湿地类型。 。 焚 纽邋 j ，) 、：、0 图1 1 黄河三角洲湿地分布3 j图1 2 本研究工作区( 2 0 0 7 ) 示意图 注：图1 1 中i 自然湿地( n a t u r a lw e t l a n d ) ；i i 潮下带湿地( s u b l i t t o r a lw e t l a n d ) ；1 2 潮间带 湿地( i n t e m d a lw e t l a n d ) ；i i 河口湿地( 黜v 盯m o u t hw e t l a n d ) ；i i i 河流湿地( r i v e rw e t l a n d ) ；i v 沼泽湿地( m 嬲h l 锄d ) ；v 草甸湿地( w e t m e a d o w ) ；v i 人t 湿地( a r t i f i c i a lw e t l a n d ) ；v i i 农用地 ( f a r m l a n d ) 黄河三角洲湿地具有中国暖温带地区最完整、最广阔、最年轻的新生湿地生 态系统，是世界上生物多样性最为丰富的地区之一。它具有多种重要的作用，如 图1 3 所示。 1 1 4 湿地受污染状况及污染源调查 滨海湿地受海陆共同作用，具有特定自然条件和复杂生态系统，是脆弱的生 态敏感区。黄河三角洲上有中国第二大油田胜利油田，又是中国重要的农业 开发基地。城市化、工业化和农业活动的增强使湿地承受着巨大的压力。石油产 业以及其他行业等人类的生产活动会产生污染物质排放进入滨海湿地，已经对海 洋生态系统造成一定影响。 2 自然功能 经济功能 社会功能 生物多样性的物种基因库；湿 地生态系统“本底”地；水文 功能；海陆物质交换功能；地 球化学功能积累与循环功能 调节气候功能；污染水净化功 能：蓄水保水抗旱功能 水土资源；农林牧副渔业资源：石油、 天然气能源资源：精细化工资源；海陆 空交通 图1 3 黄河三角洲湿地功能框图1 3 1 1 1 5 石油开发对湿地的影响途径 黄河三角洲工业废水排放量19 9 6 年为3 3 6 5 万t ，其中石油矿产开采业废水 排放量为1 6 6 9 9 万，占排放总量的4 6 6 。 在石油开发过程中，油田各处产生了大量的落地原油、油砂、岩屑、泥浆等 固体废弃物。这些废弃物绝大部分得到回收利用，但仍有少量残留于地表。在降 雨的侵蚀和冲刷作用下，经过一系列水文过程，固体废弃物中的石油类污染物随 地表径流迁移( 其中部分被植被滞留或产流过程结束而发生滞留) 进入黄河三角 洲中的各河渠，形成水体的非点源石油污染，再经水体的初步自净后被携带进入 浅海滩涂，形成浅海滩涂水域的非点源石油污染。 1 ) 石油类污染物直接产生地 由于石油开发，使得石油类污染物进入地表，这类非点污染源有：井台、作 业现场、计量站、接转站、联合站。与非点源石油污染有关的主要污染物为作业 废水、含油废砂( 油砂) 、岩屑、泥浆等固体废弃物。 油田开发建设包括钻井工程、井下作业工程、油田地面建设工程、采油工程 等，综合分析各个工艺过程，可以看出油田开发产生的主要污染物有【4 l ： ( 1 ) 采出水：采出水随原油一起从地下采出，并同原油混合进入集输系统 进行脱水分离，托出的水仍含有一定浓度的油。由于这些水在地下时与油层物质 接触，溶进或混进了盐类、悬浮物、油质、有机物及一些微生物。这些废水产生 量很大，但绝大部分用于回注，在湿地中极少排放。 ( 2 ) 钻井污水：钻井污水是在钻井施工过程中产生的废水，有振动筛冲洗 水、钻井泵冲洗水、钻台和钻具机械设备清洗水、废气钻井液池清液、柴油机排 出的的冷却水及井场生活污水组成。钻井污水所含有的污染物主要是石油类，钻 井液添加剂( 如铁盐、褐煤、磺经酚醛) 、岩屑等。 ( 3 ) 洗井水：洗井水主要来自井下作业洗井及注水井的定期洗井。洗井水 主要含有石油类、表面活性剂及酸、碱等污染物。 另外还有大气污染物、固体废弃物等造成的污染。 2 ) 石油类污染物间接产生地 由于来自石油类污染物直接产生地的径流所携带的石油类污染物在该类地 表的滞留和下渗等，在以后的降雨侵蚀和作用，随地表径流迁移而进入水体，形 成水体的非点源石油污染，从而使该类地表成为含石油类污染物的非点污染源。 这类非点污染源主要有：黄须菜地、茅草地、裸土地、林地、芦苇区、农田、居 民区、公路。 1 1 6 本工作区湿地的污染源 2 0 0 7 年湿地工作区( 见图1 2 ) 靠近东营市，东营市是一座迅速发展的石油 城，石油开采及石油化工是东营市的支柱产业，造纸业在地方工业中占有重要地 位。东营市工业废水主要来自这三个行业。废水污染物以化学需氧量、石油类为 典型污染物。 “九五”期间，东营市工业废水主要污染物中，化学需氧量和石油类的污染负 荷在各年度总污染负荷中的比例占绝对优势( 见表1 1 ) ，是典型污染物，两者污 染负荷占全市污染负荷的8 8 1 ，说明东营市的工业废水污染是以化学需氧量和 石油类为特征污染物的有机型污染。 表1 1 东营市工业废水中各污染物污染负荷指数统计 4 1 1 7 本研究提出的依据 石油等污染物质进入滨海湿地后会以各种方式影响湿地环境中微生物群落 的结构和功能；湿地环境中微生 物的生命活动过程可以对污染物 质产生作用，改变污染物质的吸 附性、水溶性、移动性等，也可 以对污染物质进行降解、转化， 比如反硝化、硫酸盐还原、产甲 烷等反应【5 】( 见图1 4 所示) ，从 而影响污染物质在海岸带湿地中 的迁移、转化和归趋。 图1 4 湿地中物质的转化 1 2 湿地环境中微生物群落研究进展 目前，国外研究者采用各种方法包括培养方法和非培养方法对湿地环境中微 生物的群落进行了研究( 表1 2 ) ，而国内这方面的研究还很少有报道。 表1 2 湿地微生物群落研究概况 5 6 1 3 微生物群落的研究方法 1 3 1 传统培养的方法 传统的群落分析方法是建立在微生物纯种分离培养基础上的，通过对分离出 来的纯菌种进行显微观察和生理生化特性研究来认识群落结构。但是，环境中可 培养的微生物的数量至占总的微生物数量的0 0 1 1 0 t ”】，这就导致能培养得到 的微生物数量对整个微生物群落来说是微乎其微的。而且传统的分离富集培养的 方法是有选择性的，培养后检测得到的微生物在种类、数量和功能上都无法准确 地反映微生物群落的自然状态，以及微生物群落的代谢功能和关系等【1 6 】。 1 3 2 非培养的方法 基于生理学、生物化学和分子生物学的原理发展起来的新方法，力图克服传 统培养法的局限，极大地推动了微生物检测监测技术的发展。尤其是以遗传标 记或生物特征化合物为标记的现代分子生物学的产生发展这些技术基于细菌体 内含有的d n a 信息来进行研究的，它避开了传统方法的不足。由于d n a 中碱 基序列的多样性以及特定基因片断的唯一性，因此d n a 技术是最为全面和可靠 的分析方法。以下对各种非培养的方法的原理作个简要地说明。 1 ) b i o l o g 微平板法 b i o l o g 是基于微生物代谢生理学的方法，其测定原理旧：在分析用的微平板 上有9 6 个孔，其中有一个孔没有含任何碳源作对照，其余9 5 个孔每孔含有不同 的单一碳源和氧化还原染料四氮唑蓝。底物被微生物利用产生的氧化还原电势的 变化可导致染料的颜色发生变化。变化的速率和程度代表了底物被利用的速率和 程度。微生物群落结构不同，9 5 个孔的颜色变化方式就不同，这样可以知道不 同样点微生物区系的差异。 虽然由b i o l o g 实验得到的数据量很大，但是从微生物代谢功能信息中所能 得到群落结构信息非常有限。仅通过b i o l o g 代谢指纹图谱难以直接研究环境微 生物群落的结构。因此它主要适合用于进行群落活性与功能分析。 2 ) p l f a 谱图分析法 磷脂脂肪酸( p h o s p h o l i p i d sf a t t ya c i d ，p l f a ) 谱图分析和甲基脂肪酸酯( f a t t y a c i dm e t h y l e s t e r , f a m e ) 谱图分析在群落动态分析上的应用也比较广泛。磷脂是构 成生物细胞膜的主要组分，在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅 速代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。另一 个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类 的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸用一定的方法从环境样品中提 取出来，然后用气象色谱分析，得出p l f a 谱图。群落的微生物结构发生变化即 可以通过谱图的变化得到快速有效的监测。 3 ) 分子生物学方法 7 分子生物学方法主要是基于d n a 和r n a 序列信息，特别是1 6 sr r n a 基因 ( 1 6 sr d n a ) 来研究微生物群落多样性。主要包括克隆文库和d n a 指纹图谱法。 ( 1 ) 1 6 sr d n a 克隆文库序列分析法 其基本原理是：提取环境样品微生物群落的总基因组d n a ，通过设计合适 的引物利用p c r 技术扩增出各种细菌的1 6 sr r n a 基因或其部分序列，然后建 立1 6 sr d n a 克隆文库。为了使回收的序列具有代表性，通常需要选取至少1 0 0 个左右的单菌落进行序列回收【l 引。回收的序列最好全部进行测序，以便进行后 续微生物分类分析。但有时限于测序费用，不能将回收的全部序列测序，则需要 先进行筛选，剔除重复序列，仅将代表性的、丰度较大的序列测序。筛选后的回 收序列进行序列测定分析。可进行相似性分析和系统发育分析( p h y l o g e n e t i c a n a l y s i s ) 等。系统发育分析，就是根据能反映微生物亲缘关系的生物大分子( 如 1 6 sr d n a 、a t p 酶基因) 的序列同源性，计算不同物种之间的遗传距离，然后采 用聚类分析等方法，将微生物进行分类，并将结果用系统发育树( p h y l o g e n e t i ct r e e ) 表示，可以直观地反映群落中各种微生物种类构成及其亲缘关系的远近。 ( 2 ) d n a 指纹分析法 环境样品中的微生物d n a 提取物通常是不同微生物的d n a 混合物，经过 p c r 扩增后，其产物是序列长度相等但不同源d n a 片段的混合物。混合物中序 列的多样性和不同序列的丰度在一定程度上反映了原始样品中微生物种群的多 样性和不同物种的丰度。如果可以将这些序列等长但碱基组成和排列不同的 d n a 片段分离开，则可对样品中微生物群落的组成进行初步的分析。d n a 指纹 技术主要包括：变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ， d g g e ) ，温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) ，单 链构象多态性分析( s i n g l e s t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y r n o r p h i s m ，s s c p ) ，随机扩增多 态性d n a 分析( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ，r a p d ) ，限制性片段长 度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) ，终端限制性片 段长度多态性分析( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，t - r f l p ) 等。 a ) d g g e 和t g g e d g g e 的基本原理1 1 9 1 为：长度相等但碱基序列存在差异的不同d n a 双链在 其解链时需要不同的变性剂浓度，d n a 双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中 的电泳速度将会急剧下降。因此，将p c r 扩增得到的等长的d n a 片段加入到含 有变性剂浓度梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的d n a 片段就会在各自相应的 变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最终停留 在其相对应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。每 个条带代表一个特定序列的d n a 片段。d g g e 技术快速简便、应用较广，但用 来分析复杂的微生物群落分辨率较低。 8 t g g e 的原理和优缺点都与d g g e 是类似的，唯一的差别在于在凝胶中形 成温度梯度，利用不同序列结构的d n a 双链具有不同的熔点温度t m 来达到各 条带分离检测的目的。 b ) s s c p s s c p 方法的基本原理【2 0 】是：对群落的p c r 扩增产物进行变性处理，使得双 链d n a 变为单链。单链d n a 片段呈现复杂的空间折叠构象，这种立体结构主 要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。长度虽然相同但序列不同 的单链d n a 具有空间构象上的差异，因此在聚丙烯酰胺凝胶中所受排阻不同， 具有不同的电泳迁移速率，从而通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可以将来自不同微 生物种群的序列有差异的单链d n a 分离开来。 c ) r a p d 随机扩增多态性d n a 的基本原理：在不知道或不考虑模板基因序列的情况 下，利用随意设计的非特异引物，在不严格的p c r 条件下( 如低退火温度) 使随机 引物与模板d n a 序列互补结合后，经t a q 聚合酶的作用使引物延伸，在两个扩 增引物之间释放的d n a 片段再经p c r 扩增，很快达到相当的数量，并能在琼脂 糖电泳中出现明显的谱带。数个循环后，终产物电泳后得到d n a 图谱，通过图 谱间的比较可分析群落间的差异。 d ) i 心l p r f l p 的基本原理是【2 1 】：利用能识别特定d n a 序列的限制性核酸内切酶处 理群落1 6 sr d n a 的p c r 扩增产物，基于不同种群1 6 sr d n a 序列的差异，将得 到长度与数量不同的d n a 片段，通常用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离， 并利用溴乙啶等荧光染料进行显色，得到的特异性的电泳图谱称基因的酶切指纹 图谱。 e ) t - r f l p t - r f l p 在原理上同前面的r f l p 技术有许多相似之处，只是p c r 扩增中所 用引物的一端或两端带有荧光标记，因此酶切所得的终端片段被标记，电泳后通 常只分析终端片段的种类、长度与数量。t - r f l p 法方便快捷，由于使用了荧光 标记，具有比d g g e 等方法更高的灵敏度。与r f l p 相比，t - r f l p 技术由于酶 切片段中仅有终端片段被检测，每一种长度的终端片段至少代表一种微生物基因 型，因此可以认为检测到的终端片段数目给出对群落中微生物种群数的最小估计 值。而且该技术采用自动d n a 测序仪对终端片段进行检测，并通过加入的d n a 分子量标准参照物，自动d n a 测序仪可以定量给出每个t - r f 的碱基大小和相 对荧光强度，从而可以定量地计算微生物群落的多样性并对不同环境样品的微生 物群落进行定量化比较。 t - r f l p 是在r f l p 技术基础上发展起来的，与以上介绍的其它遗传图谱指 纹分析技术相比，t - r f l p 技术分辨率更高，可以实现自动化，因此最近几年被 9 日益广泛地用于复杂微生物群落的分析。 本研究采用t - r f l p 技术分析微生物群落结构，t - r f l p 的流程见图1 5 所示。 群落中的总数 提取总d n a 竺画 _ _ - - - - i - o - 一 i ii _ 用末端荧光标 记的引物p c r 扩增把序列 易pc辫r l 切酶消化l 产物i 5 。t 住皿士 15 血盂 测序仪 上片断 分离 5 气孟击 妣物质 图1 5t - r f l p 法分析微生物群落结构流程图 1 4 研究目的和意义 由于自然和人为因素的影响，特别是近5 0 年来人类对滨海湿地资源的不合 理开发和利用，滨海湿地资源遭受到