（环境工程专业论文）胺菊酯的水生毒性及微生物降解.pdf

胺菊酯的水生毒性及微生物降解 摘要 在过去的几十年，拟除虫菊酯类杀虫剂因其广谱高效、低毒以及 低抗性等众多独特的优点，跻身成为现代农药中最主要的成员，占世 界杀虫剂市场3 0 的份额，被广泛的应用在农业和城市环境中。拟除虫 菊酯类农药可以通过地表径流或土壤淋溶等多种途径进入水体环境， 对地表用水及溪流河床底泥等造成污染。此外，拟除虫菊酯作为一种 手性农药，其水生生物毒性及其对映体选择性已经引起了越来越广泛 的关注。目前，对拟除虫菊酯类农药的水生生物毒性研究，多集中在 急性和亚急性毒性，而从基因水平上综合考虑其对鱼类免疫系统和内 分泌系统毒性的研究还较少。另外，通过微生物降解的方式来消减环 境中拟除虫菊酯类农药的残留，已经成为一种环保有效的途径。本文 以斑马鱼胚胎为模式生物，探讨了胺菊酯( t e t ) 的胚胎毒性，然后在 对胺菊酯进行手性分离的基础上，研究了反式胺菊酯( t r a n s t e t ) 的对 映体选择性。结果显示，在低浓度范围内( o 5 2 m g l ) ，t e t 会刺激斑 马鱼胚胎的孵化，随着t e t 浓度的升高，胚胎的孵化受到抑制。t e t 还能 进一步导致斑马鱼胚胎的发育出现异常，造成卵黄囊肿( y s e ) 、心包囊 肿( p e ) 和弯曲身体( c b ) 等形态学畸形。在孵化前4 8 h ，y s e 是主要的毒 理学终点指标，而7 2 h 时，y s e 、p e 币i c b 现象均有出现。在流动相为 正己烷乙醇( 9 5 ：5 ，v v ) ，流速为0 4 m l m i n 的条件下对t e t 手性拆分， 最终得到了一对t r a n s t e t 对映体。从对t r a n s t e t 对映体选择性毒性差异 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 的研究中可以得出：4 8 h 、7 2 h 和9 6 h 的急性毒陛l c s o 值均存在显著的差 异，且( + ) t e t 的毒性比( ) t e t 强。而从基因层次上的研究表明，t r a n s t e t 外消旋体及其对映体还会促进免疫基因的表：达，而抑制内分泌基因的 表达，显著性分析显示，高浓度暴露下均表现出显著的对映体选择性。 通过分离纯化胺菊酯降解细菌，我们获得了一株能够较好降解胺菊酯 的菌种，经过鉴定，为a n c y l o b a c t e r 属。经条件优化，其对5 0 m g lt e t 的7 d 降解率为5 4 。 关键词：胺菊酯；斑马鱼胚胎；对映体选择性；免疫；内分泌干扰； 微生物降解 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 a b s t r a c t d u r i n gt h ep a s tf e wd e c a d e s ，p y r e t h r o i d sh a v eb e c o m eo n e o ft h e m a i nf a m i l i e so fm o d e mp e s t i c i d e s ，b e c a u s eo ft h e i ru n i q u ea d v a n t a g e s i n c l u d i n gh i g he f f i c i e n c y , l o wt o x i c i t ya n db r o a ds p e c t r u m t h e yt a k ea b o u t 30 m a r k e ti nw o r l db yw i d e s p r e a da p p l i c a t i o ni na g r i c u l t u r a la n du r b a n e n v i r o n m e n t p y r e t h r o i dp e s t i c i d e sc a ne n t e ri n t ot h ea q u a t i ce n v i r o n m e n t v i ar u n o f ff a c i l i t a t e dp r i m a r i l yb ys e d i m e n tm o v e m e n t ，w h i c hb r i n g sa s e r i e so fp o l l u t i o n a sak i n do fc h i r a lp e s t i c i d e s ，i t se n a n t i o s e l e c t i v i t yi n t o x i c i t yh a v ec a u s e dm o r ea n dm o r ee x t e n s i v ea t t e n t i o n t h e r ea r em a n y s t u d i e so nt h ea c u t et o x i c i t yo fp y r e t h r o i d sn o w , a n daf e wi sa b o u tt h ef i s h e m b r y o n i cd e v e l o p m e n ta n de n d o c r i n ed i s t u r b a n c e h o w e v e r , t h es t u d yo f e n a n t i o s e l e c t i v ee f f e c t so nt h ei m m u n es y s t e ma n de n d o c r i n es y s t e mo ff i s h s p e c i e sh a v eo n l yg o tl i m i t e da t t e n t i o n i nt h i sp a p e r , w ec h o s ez e b r a f i s ha s t h em o d e lo r g a n i s m , d i s c u s s e dt h ea q u a t i ct o x i c i t yt oz e b r a f i s he m b r y o ， t h e no nt h eb a s i so ft h er e s e a r c hi nc h i r a ls e p a r a t i o n ，t h ee n a n t i o s e l e c t i v i t y o ft r a n s - t e t r a m e t h r i n ( t r a n s t e t ) w a ss t u d i e d i ts u g g e s t e dt h a ti nt h el o w c o n c e n t r a t i o nr a n g e ( 0 5 - 2 0 m g l ) ，t e tc o u l dp r o m o t et h eh a c h i n go f z e b r a f i s he m b r y oa tl o w e rc o n c e n t r a t i o n ，w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n s o ft e t ，t h ep r o c e s sw o u l db eh i n d e r e d t e tc o u l da l s ol e a dt om o r p h o l o g i c a l a b n o r m a l i t i e sofz e b r a f i s he m b r y o i n4 8 h ，y o 【s a ce d e m a ( y s e ) w a st h e i i i 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 m a i nt o x i ce n d p o i n t ，u n t i l7 2 hm o r ee n dp o i n t sl i k ep e r i c a r d i a le d e m a ( p e ) a n dc r o o k e db o d y ( c b ) w e r eo b s e r v e d t h e n ，ah i g h p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y m e t h o di s p r e s e n t e d f o rt h e e n a n t i o s e p a r a t i o n o f t e t r a m e t h r i n ap a i ro ft r a n s - t e te n a n t i o m e r sw e r ea c h i e v e do nc h i r a l p a k a d u s i n gam o b i l ep h a s ec o n s i s t i n go f am i x t t u eo f n h e x a n e e t h a n o l ( 9 5 ：5 ， v v ) a f t e rt h a tt h et o x i c i t yd i f f e r e n c e sb e t w e e nt r a n s t e te n a n t i o m e r sw e r e s t u d i e d t h er e s u l t so fa c u t et o x i c i t ya s s a y si n d i c a t e dt h a tt r a n s - ( + ) 一t e tw a s m o r et o x i ct oz e b r a f i s he m b r y ot h a nt r a n s - ( - ) - t e t i na d d i t i o n ，t r a n s - t e t a n di t se n a n t i o m e r sm a yp r o m o t et h ee x p r e s s i o no fi m m u n eg e n e so f z e b r a f i s he m b r y o ，b u ti n h i b i t t h e e x p r e s s i o no fe n d o c r i n eg e n e s t h e s i g n i f i c a n ta n a l y s i ss h o w e das i g n i f i c a n te n a n t i o s e l e c t i v i t ya th i g he x p o s u r e c o n c e n t r a t i o nb e t w e e nt h et w ot r a n s - t e te n a n t i o m e r s b yc o n s i d e r a t i o no f t h eh i g ht o x i c i t yo ft e t ，i th a sv e r yi m p o r t a n tt of i n dam e t h o dt or e d u c ei t s e n v i r o n m e n t a lc o n e n t r a t i o n a sar e s u l t ，at e t d e g r a d i n gb a c t e r i u mw a s i s o l a t e d ，a n di d e n t i f i e da sa n c y l o b a c t e rs p b a s e do nt h ea n a l y s i so f16 s r d n a g e n e a f t e r7 d ，t h ed e g r a d a t i o nr a t eo f5 0 m g lt e tw a s5 4 k e y w o r d s ：t e t r a m e t h r i n ；z e b r a f i s he m b r y o ；e n a n t i o s e l e c t i v i t y ；i m m u n e ； e n d o c r i n ed i s t u r b a n c e ；m i c r o b i a ld e g r a d a t i o n i v 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 第一章绪论 拟除虫菊酯类农药是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一类杀虫剂，起源于除虫菊花， 是现代使用农药中最主要的一种，因其具有高效、低毒、低抗性、广谱性等众多 独特的优点，已经广泛应用于农作物害虫和卫生害虫的防治，在世界杀虫剂市场 中占了3 0 的份额 1 】。经过3 0 多年的发展，拟除虫菊酯类杀虫剂的使用量已经仅次 于有机磷类杀虫剂。 随着拟除虫菊酯类农药使用量的不断增加，其引起的环境污染与人类安全问 题也受到越来越广泛的关注【2 o 拟除虫菊酯类农药可以通过地表径流或土壤淋溶等 多种途径进入水体环境，对地表用水及溪流河床底泥等造成污染 3 。研究发现，拟 除虫菊酯类农药虽然对哺乳类及鸟类的毒性较低，但对鱼类等水生生物的毒性却 很大，拟除虫菊酯类农药可作用于神经膜钠通道，对神经传导进行干扰，还可作 用于鳃组织，从而引起鳃组织发生病变，并抑制鳃组织中n a + 一k + a t p a s e 的活力【4 8 1 。 除了急性毒性之外，拟除虫菊酯类农药还会在低浓度下引起蚤类、虾、鱼类等水 生生物的亚致死效应，包括行为变化1 1 ，生长迟缓1 2 】，免疫系统影唰”】，生殖 内分泌效应，组织病变及生化反应等【2 1 。 另一方面，拟除虫菊酯类农药具有手性结构。对手性化合物的研究表明，其 对映异构体具有相同的物理和化学特性，但不同构型的异构体进入生态环境被生 物摄取后，往往会表现出不同的生理、生化与毒理性质盼16 1 。通常手性化合物中 只有一种异构体具有所希望的生物活性，而另一种没有显著的生物活性甚至无活 性，也或者其中一个异构体对环境会造成更大的危害。由于受到认识和技术的限 制，这种差异性还没有得到人们的足够重视，因此对手性农药在环境安全、生态 毒性以及人类健康风险方面的对映体选择性进行评价显得尤为重要。 在关注拟除虫菊酯类农药的毒理效应的同时，其在环境中的降解途径也引发 了学者们越来越多的研究兴趣。而微生物法降解拟除虫菊酯凭借其绿色环保的特 色优势，已成为国内外学者研究的热点。 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 1 1 拟除虫菊酯类农药概述 1 1 1 拟除虫菊酯类农药的发展过程 天然除虫菊为菊科( c o m p o s i t a c ) 菊属( c h r y s a n t h e m u m ) 除虫菊亚属 ( p y r e t h r u m ) 的若干植物，其中，白花除虫菊( c h r y s a n t h e m u mc i n e r a r i a e f o l i u m ) 含有较高的除虫菊素( p y r e t h r i n s ) 【1 ，因此成为唯一大规模栽培用作杀虫剂的品 种。 天然除虫菊具有的杀虫剂特性引起了人们的广泛兴趣，1 9 2 4 年，s t a u d i n g e r 和r u z i c k a 首先对除虫菊素的结构进行了研究，他们从天然除虫菊花的正己烷抽 提物中相继分离鉴定出一些化学成分，发现了六个化合物具有杀虫活性。其中除 虫菊素i 和除虫菊素i i ( 图1 ) 的含量最高，生物活性也最强。1 9 4 9 年美国谢克特 ( m s s c h e c h t e r ) 、拉福e ( f b l af o r g e ) 等人工合成了第一个拟除虫菊酯 丙烯菊酯，并于1 9 5 0 年商品化。此后各国研究者通：过改进酸和醇两部分的结构， 陆续合成了许多比天然除虫菊酯更有效的拟除虫菊酯品种。例如胺菊酯( t k a t o ， 1 9 6 4 ) 、苄呋菊酯( m e l l i o t t ，1 9 6 7 ) 、炔呋菊酯( y k a s t u d a ，1 9 6 8 ) 、苯醚菊酯 ( p h e n o t h r i n ，n i t a y a ，1 9 6 8 ) 等。这些拟除虫菊酯保持了天然除虫菊酯的优良杀 虫活性，在防治卫生害虫方面逐渐取代了天然除虫菊。但由于其对光的不稳定性， 尚不能用在田间防治农业害虫。 c h l _ 一 对k 尉= 一c h 3静一一c l 差2 一e h = 。】| c l _ 薹一c h * c h 2 为豫虫菊素薹 熨一一e o o c h ，r 2 = 一c h ：- c h - - c h - c h e h 2 为豫虫菊索f i 圈1 除虫菊素i 和除虫菊素i i 在研究光稳定性拟除虫菊酯的道路上，日本住友化学公司的研究人员于6 0 年 代初取得了第一个进展。他们采用间位苯氧基苄基代替醇部分的环戊烯酮醇，使 光稳定性有了改进，并在苄基碳原子上引入氰基，使杀虫活性大为提高。这个醇结 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 构被称为“住友醇”。英国洛桑( r o t h a m s t a d ) 试验站埃利奥特( m e l l i o t t ) ，经过 长期研究酸部分的不稳定因素，发现用二卤乙烯代替环丙烷侧链上的异丁烯基， 光稳定性有很大改进。他们用这种酸( 简称d v 菊酸) 和日本的“住友醇”结合酯 化，于1 9 7 3 年合成第一个光稳定的拟除虫菊酯氯菊酯，为拟除虫菊酯杀虫剂 用于田间作出了突破性贡献。1 9 7 4 年又合成了氯氰菊酯和溴氰菊酯等优良农用拟 除虫菊酯。其中溴氰菊酯是单一的、高效光学异构体，不仅光稳定性好，杀虫效 果也远远超过以往任何杀虫剂。每公顷用量仅1 5 克左右，这也是一次历史性突破。 1 9 7 4 年日本住友公司大野信夫m o h n o ) 等人以苯基6 c 异丙基乙酸取代了含三碳 环的菊酸，发明了一类新型拟除虫菊酯，其代表品种为氰戊菊酯。这使合成步骤 大为减化，成本降低，为拟除虫菊酯的开发打开了新的领域。这一结构上的重大 改变也曾引起争论，有人认为它已不能称为拟除虫菊酯了。然而，从理化性质、 生物活性和作用机制方面来看，它具有拟除虫菊酯的典型性质，而从分子构型上 看，经x 光衍射等技术研究发现仍与菊酸类似。因此，现在已公认这一类型化合 物仍归属于拟除虫菊酯杀虫剂。 8 0 年代以来，拟除虫菊酯的研究和开发已形成热潮，商品化品种已达4 0 多种， 使用面积已占整个杀虫剂使用面积的2 5 ，成为防治卫生和农业害虫的主要药剂 类型之一，结构类型亦有新的突破。美国f m c 公司合成了醇部分为联苯基苄基结 构的联苯菊酯兼有杀螨作用，日本东京大学合成了以肟醚代替酯键的肟醚菊酯，对 哺乳动物和鱼的毒性都较低。同时，对拟除虫菊酯的结构与活性关系，昆虫毒理、 代谢及在环境中归趋、环境影响，抗药性发展等基础研究也在广泛进行。 我国从7 0 年代初期开始对丙烯菊酯、胺菊酯和苄呋菊酯等进行合成和药效试 验研究；8 0 年代初，氯菊酯、氰戊菊酯、戊菊酯和胺菊酯等已进入中试或试生产； 到8 0 年代中期，拟除虫菊酯杀虫剂在卫生、农业等方面已取得广泛应用。研究工 作也在大专院校、研究单位广泛深入地进行。在今后一段时期内，高效、安全， 选择性好、杀螨作用强、对鱼类毒性低、可在稻田使用、不易产生抗药性等新品 种仍将是研究开发的方向【l 8 1 。 1 1 2 拟除虫菊酯类农药的水生生态毒理学研究 1 1 2 1 惫性毒性研究 目前，拟除虫菊酯杀虫剂广泛检出于自然环境如湖泊、河流、稻田、土壤中， 壁翌塑塑查生型墨丝! 三! 堕壁 在表层水体中的浓度为o 0 5 2 5 u g l 1 9 。2 0 】。拟除虫菊酯类农药对鱼类等水生生物具 有很高的毒性，因其具有很强的亲脂性，即使在水中浓度很低，也可进入鱼鳃和 血液中，而鱼类对它们的转化能力和排泄能力较低，因此对鱼类的毒性比较大【2 。 赵等研究了几种拟除虫菊酯对鱼类的毒性，研究中发现，暴露7 2 h 后，溴氰菊酯、 氯氰菊酯和氰戊菊酯对鲫鱼的l c 5 0 分别为0 4 7 u g l 、3 7 6u g l 和5 4 6u g l t 2 2 1 。h i l a l p o l a t 2 3 等研究高效氯氰菊酯对孔雀鱼的4 8 hl c 5 0 为2 1 4 u g l 。有时，同种农药对 不同鱼的毒性也会相差很大，氯菊酯对美洲原银汉鱼的4 8 hl c 5 0 为2 8 6u l ，而 对孔雀鱼毒性并不强，其l c s o 为2 4 5 7u “2 4 1 。王朝晖等【2 5 1 研究证明9 种菊酯的毒 性大小依次为：氟氯氰菊酯 溴氰菊酯 甲氰菊酯 高效氯氰菊酯 氯氰菊酯 氰戊菊 酯 二氯炔戊菊酯 胺菊酯 甲醚菊酯。 1 1 2 2 发育毒性研究 k e n a nk o p r u u a 等【2 6 研究了溴氰菊酯对鲤鱼的孵化率具有明显影响，其0 0 0 5 、 0 0 5 、0 5 、5 、2 5 和5 0 u g l 组的鲤鱼孵化率分别为7 5 2 、6 4 6 、4 7 4 、2 6 0 、 4 4 和9 o 。t a n n e r 和k n u t h 2 7 1 对大鳍鳞鳃太阳鱼的围隔实验中发现，两次施用 0 0 0 8 ，0 2 和l u g l 的顺式氰戊菊酯后，鱼的生长年龄分别减少了5 7 ，6 2 及8 6 。 叶伟红等 2 8 】报道0 5 “g l 及以上的氟氯菊酯溶液对大型蚤的体长和怀卵时间都有明 显抑制，f 1 代放入没有农药的培养液中进行恢复实验，其体长和产卵数与对照实 验相比均受到明显影响。x u 等 2 9 研究发现，斑马鱼胚胎经功夫菊酯暴露后，出现 了诸如卵黄囊肿、心包囊肿和身体弯曲等畸形现象。， i i 2 3 神经毒性研究 拟除虫菊酯是神经性杀虫剂，其作用机制主要是通过抑制脑突触体膜上的腺 苷三磷酸酶( a t p a s e ) ，使突触体膜上的乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 等神经递质大量聚集， 从而引起脑a c h e 被抑制 3 0 - 3 2 。a c h e 是一组特异性较强的水解酶，存在于中枢神 经系统( 如脑) 、运动终板( 如肌肉) 、交感神经和红细胞等处，! t n a c h e 活性降低 或失活，则引起乙酰胆碱在中枢突触、神经肌肉接头等处的积累，表现出各种病 状，如惊厥、麻痹等。已有研究表明，鱼类脑中a c h e 活性的下降将影响鱼类完成 一系列正常功能，比如食物的获取、寻找配偶以及逃避天敌等【33 1 。菊酯类农药能 明显抑制鱼类肾组织中的n a + a t p a s e 、k + a t p a s e 和脑组织中的c a 2 + - a t p a s e 、 m 9 2 + a t p a s e 的活性，实验证明低浓度的甲氰菊酯( 1 u g l ) 可降低鳃中的n a + a t p a s e 和k + a t p a s e 达4 0 ( 质量分数) 以上，会严重影响鱼类正常的生理功能并导致死亡 4 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 3 4 - 3 5 。向枭等 3 6 j 报道，试验中黄鳝苗种在溴氰菊酯药液中表现出来的狂游、击壁、 身体强烈抽搐和扭曲是典型神经中毒的症状。 1 1 2 4 免疫毒性研究 免疫毒性有很多种，包括免疫器官的病理、体液免疫和细胞免疫水平的下降 等。当环境污染物进人鱼体，会对鱼类造成生理和生化危割37 1 。靳远祥删等报道， 斑马鱼雌性成鱼经氯氰菊酯暴露后，会影响其肝细胞内关于氧化应激和细胞凋亡 方面基因的表达。拟除虫菊酯对幼鱼免疫系统中一些免疫信使分子( 细胞因子) 的转 录表达的改变，会导致鱼类对疾病的抵抗能力的下降，使幼鱼更易感染病毒 3 9 - 4 0 】。 k a i 等 4 1 】通过标记热休克蛋白研究发现，氰戊菊酯作用于双分子通道，使热休克免 疫蛋白的含量增加，从而影响幼年鲑鱼的免疫系统。 1 1 2 5 内分泌千扰研究 环境内分泌干扰物质是指进入机体后，具有干扰体内正常内分泌物质的合成、 释放、转运、代谢和结合等过程，激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏内分 泌系统维持机体稳定性和调控作用，并影响生物体或其后代的发育、繁殖和( 或) 行为的外源性化合物【4 2 4 3 1 。野外和实验室的研究结果均表明，经环境雌激素和抗 雌激素暴露后，成鱼体内的雌激素信号将受到干扰，进而影响鱼类的配子发育、 性腺成熟和产卵能力等 4 4 郴 。 目前国内外合成的拟除虫菊酯类物质有数十种，作为一种内分泌干扰物，该类 物质具有毒性选择性强、哺乳动物体内代谢和排泄迅速、环境中残留较少等特点， 且具有较强的雌激素效应。近年来，随着研究的逐渐深入，其生殖内分泌方面的 毒性也日趋受到重视。研究表明，氯氰菊酯及顺式氰戊菊酯会影响大西洋鲑鱼、 大鳍鳞鳃太阳鱼和青鲻鱼的繁殖能力及幼鱼成活率【4 6 舶 。 1 2 拟除虫菊酯类农药的手性分离 实物与镜像不能重叠的现象称为手性( c h i r a l i t y ) ，手性分子存在着一对互为镜 像关系而又不能重合的对映异构体( e n a n t i o m e r ) ，简称对映体【4 9 1 。拟除虫菊酯类农 药是常用的手性农药之一，其不同的对映体在生物活性、代谢及毒性等方面往往 存在着显著差异。因此，研究外消旋农药中有效体与无效体的比例、评估药品对 映体纯度、在自然环境中对不同对映体的残留进行检测和评价各对映体的毒性效 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 应等，都需要通过合适的手性拆分方法对外消旋农药进行分离 5 0 - 5 1 】。手性拆分法 主要包括直接结晶拆分法、化学拆分法、生物拆分法和色谱拆分法 5 2 1 。其中，色 谱法主要通过分离对映体来分析测定微量样品，方法快速简易，准确度高，应用 范围广，可靠性好，在近2 0 年里发展迅速，已广泛应用在科研、质检等领域。 色谱法可分为：薄层色谱法( t l c ) 、超临界色谱法( s f c ) 、气相色谱法( g c ) 、 纸色谱法( p c ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 、高效膜色谱法( h p m c ) 、毛细管电泳法 ( c e ) 、和电色谱法( c e c ) 等。其中应用最为广泛的是h p l c 。h p l c 不会改变待测 物质构型( 对映体之间发生异构作用) ，也不会破坏待测物质的生物活性。使用 该方法可以得到高光学纯度的对映体，并可发展成为具有工业规模的对映体制备 分离方法，此方法特别适用于对热不稳定、有极性、不挥发农药的制备分离。另 外，h p l c 具有很多种类的检测器，除了常用的紫外检测器和示差检测器，还可使 用专门检测手性物质的圆二色检测器和旋光检测器。h p l c 直接拆分包括手性流动 相( c h i r a l m o b i l ep h a s e ，c m p ) 添加剂法和手性固定相法( c h i r a ls t a t i o n a r y p h a s e ， c s p ) 5 3 1 。 近些年来，随着手性分离技术的不断提高，许多种常用的拟除虫菊酯都在高 效液相色谱上得到了很好的拆分，l i u 等 5 4 - 5 5 1 使用o a 2 5 0 0 1 型c s p 对多种拟除虫菊 酯对映体拆分进行了研究。使用己烷1 ，2 二氯乙烷( 其体积比为9 9 5 0 5 ) 作流动相， 顺反式联苯菊酯及氯菊酯在该柱上都得到了完全分离。j i a n g 等【5 6 在c h i r l c e l o j h 柱上完全分离了r 型乙氰菊酯对映体，在c h i r l c e l o d h 柱上完全分离了s 型乙氰菊 酯对映体。x uc h a o 等t ”l 在c h i r a l p a ka d ，c h i r a l p a k a s ，c h i r a l c e lo d 以及c h i r a l c e l 0 j 手性柱上很好的分离了高效氯氟氰菊酯( l c t ) 对映体。直接连接2 个固定相是 一个普遍而有效的方法，该方法不但可以提高分离效率，还可以延长手性柱的使 用寿命。l i u t 5 7 1 等串联2 个c h i r e x 0 0 g 3 0 1 9 d o 手性柱拆分氯氰菊酯和氟氯氰菊酯8 个对映体，在己烷1 ，2 二氯乙烷乙醇( 其体积比为5 0 0 ：1 0 ：0 0 0 5 ) 作为流动 相时，只获得7 个峰，增加1 ，2 二氯乙烷和乙醇浓度时，分离效果会有所提高，最 后，在己烷1 ，2 二氯乙烷乙醇的流动相体积比为5 0 0 ：3 0 ：0 1 5 条件下时，8 个对映 体出现完全分离。 1 3 拟除虫菊酯类农药的对映体选择性水生毒性 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 随着手性分离技术的不断发展，很多手性农药都已经可以获得单一对映异构 体，因此，拟除虫菊酯类农药单一对映异构体的毒性研究受到越来越广泛的关注。 虽然手性分子对映异构体之间有相同的理化性能，但在生物环境中，其性能( 如生 理、毒理、生物降解、生物代谢等) 却区别很大，甚至犹如不同的化合物。 l i u 等人 5 4 】认为将手性农药的选择性环境行为与选择性毒理相结合，可以更合 理的对手性农药的生态风险性进行评估，因此，他们测定了氯氰菊酯异构体对淡 水蚤类的毒性差异，结果表明，1 月c 括栅口lr t r a n s 。0 【i s i 异构体表现出较强的毒性。 另一篇报道中，l i u 等人【5 8 】还在b g b 1 7 2 手性柱上成功拆分了顺式氯菊酯( c i s p m ) 和顺式联苯菊酯( c 括b f ) 的一对对映体，结果显示，两种菊酯的对映体对淡水蚤类 都存在毒性差异。 x u 等【2 9 以斑马鱼为受试生物，研究了功夫菊酯( l c t ) 的对映体选择性毒性。 结果表明，( ) 对映体的9 6 hl c s o 为( + ) 对映体的7 2 倍。此外，l c t 还能够诱导斑马 鱼胚胎发生脊椎弯曲、卵黄囊肿和心包囊肿等畸形症状，而且，l c t p b 消旋体及( ) 对映体在低浓度下( 5 0 u g l ) 就会诱导畸形的产生，而( + ) 对映体只有在较高浓度下 ( 之1 0 0u g l ) 才能引起畸形。 刘维屏等人【5 8 】通过联苯菊酯( b f ) 不同对映体对日本青鲻鱼的内分泌干扰试 验发现，l 尺c 括一b f 对公鱼的内分泌干扰大于1 s - c 如一b f 的内分泌干扰影响。j ：i n 等【5 9 】 研究表明，斑马鱼胚胎在2 5 0 n g l 的氯菊酯( p m ) 外消旋体及其对映体中暴露7 天 后，其v t g l ，e s r a 和c y p l 9 b 的表达均表现出明显的对映体选择性。在1 0 0 0 n g l 浓度下，( ) t r a n s p m 对v t g l ，e s r a 和c y p l 9 b 诱导的基因表达量分别为 ( + ) t r a n s p m 的3 2 ，1 8 和1 5 倍。在c 妇异构体中，( + ) c 妇p m 对c y p l 9 b 诱导的基因 表达量为( ) c 西p m 的1 5 倍。四个对映体中，( ) - t r a n s p m 的雌激素效应最强。 1 4 拟除虫菊酯类农药的微生物降解 随着拟除虫菊酯类农药的广泛使用，在带来一定经济效益的同时，其在环境 中也大量累积，不仅会污染环境，还会造成对生态系统的破坏，并可能威胁到人 类健康。农药残留很难降解，人们在使用农药防治病虫害的同时，也使粮食、蔬 菜、瓜果等农药残留超标，污染严重。果蔬中拟除虫菊酯类农药的检出率及超标 率均约占2 0 左右，当前出口欧盟的农产品中，拟除虫菊酯类农药残留限量标准的 7 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 降低幅度最大，要求也越来越严格。目前，这类农药的残留已成为我国农产品中 的主要残留，严重影响了食品安全和我国农产品的出口 6 0 1 。 与其他方法相比，微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复 性好等优点，是当前国内外的热门研究领域，已成为国际上正在发展的一项新型环 保产业 6 1 _ 6 2 1 。 1 4 1 微生物降解能力的发现 早在2 0 世纪6 0 年代，人们就发现土壤中的某些物质对农药具有降解作用。 c r o w e 在1 9 6 1 年发现菊酯农药在土壤中很快被降解并失去杀虫活性。之后的研究 发现，土壤中的微生物在拟除虫菊酯农药的降解中起到了关键作用 6 3 1 。埃及 m a g d o u b 等 6 4 3 1 9 8 9 年和印度m i s r a 等【6 5 1 1 9 9 6 年都研究出乳酸菌对牛奶中的氰戊菊酯 有降解能力，接种乳酸菌到受氰戊菊酯污染的牛奶中培养一段时间后，可以降低 农药残留，从而减少经济损失。 2 0 世纪8 0 年代末，中国学者也开始了对菊酯类农药的微生物降解的研究。苏 大水于1 9 8 9 年发现，甲氰菊酯在土壤中的降解与土壤中的微生物有关【6 6 1 。从降解 微生物类群来看，目前筛选获得的拟除虫菊酯类降解菌大多是细菌类，少量为真 菌和放线菌类。主要有假单胞菌p s e u d o m o n a ss p p 、芽孢杆菌b a c i l l us p p 和产碱菌 属a l c a l i g e n e ss p p 等6 7 石8 1 。如荧光假单胞菌( p s e u d ( ) m o n a sf h l o r e s c e i l s ) 能降解氯菊 酯、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟胺氰菊酯和氯氰菊酯 6 9 - 7 0 】，产气肠 杆菌( e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) 对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯都有降解效能7 1 1 。 1 4 2 微生物降解机制 拟除虫菊酯农药微生物降解的作用机制主要是通过其分泌酶的生物化学过程 来完成，从本质上讲就是酶促降解，即微生物产生的酶特异地切断羧酸酯键，使 原农药分子生成2 个较小的羧酸和醇，再进一步氧化、脱氢，生成毒性更小或无毒 的化合物【7 2 们】。陈少华等 7 4 1 在微生物降解溴氰菊酯的研究中表明，在降解菌p 0 1 的作用下，溴氰菊酯首先通过酯键断裂产生中间产物a 羟基3 苯氧基苯乙腈；a 羟基3 苯氧基苯乙腈在环境中不稳定，很快氧化生成3 苯氧基苯甲醛；3 苯氧基苯 甲醛能被降解菌p 。o l 进一步氧化分解生成2 羟基_ 4 _ 甲氧基二苯甲酮和邻苯二甲酸 单酯。p a i n g a n k a r 等【7 5 】根据g c m s 检测到4 种主要产物和2 种次要产物，推测丙烯菊 8 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 酯q 生a c i d o m o n a ss p 作用下水解为丙烯醇与菊酸，丙烯醇随后被氧化，菊酸脱氢后 发生成环反应。许育新等7 6 1 研究表明，氯氰菊酯的微生物降解主要是水解作用， 初步提取并证实氯氰菊酯降解酶是一种酯酶。 1 4 3 微生物降解的影响因素 影响微生物降解的因素有很多，如金属离子、通气量、碳源、湿度、微生物 自身特性、氧化剂和还原剂的添加等 7 7 - 7 9 。目前研究较多的因素主要有温度、p h 和农药浓度等。这些因素将决定微生物能否在环境中充分发挥降解效应，实现高 效的对目标农药进行降解。 1 4 3 1p h 的影响 微生物降解污染物时，往往有一个最适酸碱度，当p h 偏离了这个范围时，降 解率会有所下降。王玲玲等 8 0 】研究了过碳酸钠对甲氰菊酯和高效氯氰菊酯降解的 影响，结果表明随着过碳酸钠量的增加和温度的升高，农药的降解率增加，且在 碱性条件下，农药的降解速率常数最大。李玉清 8 1 】在微生物降解丙烯菊酯的研究 中表明，在3 5 。c 恒温振荡培养菌株7 2 h 后，当p h 为6 5 8 0 时，丙烯菊酯的去除量较 大。z h a n g 等 8 2 】利用响应曲面法对筛选获得的2 株高效氯氰菊酯降解菌s e r r a t i as p j c l 和j c l 3 的降解条件进行优化，发现2 株降解菌在偏碱性条件下降解效果较好。 张丽萍等【8 3 1 研究表明，基础盐培养基初始p h 值对l q 3 菌株降解氯氰菊酯有较大影 响，偏酸性条件不利于l q 3 菌株对氯氰菊酯的降解，降解最适p h 为7 8 。 1 4 3 2 温度的影响 微生物或其产生的酶系都有一个较适宜的降解农药的温度。张松柏等晔】在研 究中发现，当菌株l f 1 在2 5 3 5 c 之间，具有良好的氯氰菊酯降解能力，在3 5 。c 时 降解效果最好。温度过高或过低都会显著影响菌株的降解能力，当温度低于2 0 或高于4 5 时，菌株几乎丧失降解能力。李玉清 8 l 】在p h = 7 0 的条件下，对菌株振 荡培养7 2 h ，测其对丙烯菊酯的降解率，发现在2 5 4 5 的条件下降解率较高。张丽 萍等 8 3 1 研究表明，在2 5 3 0 。c 的培养条件下，l q 3 菌株对氯氰菊酯的降解效果较好， 培养5 d 后降解率可达到6 0 7 0 ，而在2 0 。c 和4 0 。c 时降解率仅为3 0 左右。丁海涛 等【8 5 1 又证明了菌株q w 5 属中温型生活环境的细菌，在3 0 。c 左右生长较好。 9 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 1 4 3 3 农药浓度 农药的浓度是影响微生物降解效率的一个重要因素，浓度过高会抑制降解菌 的降解作用，而浓度过低又难以维持微生物的正常生长，从而使微生物降解无法 顺利进行。目前报道的微生物降解农药的研究中，大多数在农药浓度超 ：过_ 2 5 0 m g l _ , 时，就表现出明显的受抑制作用8 6 1 。z h a n g 等m 从生物学和遗传学的角度研究了氯 氰菊酯的浓度对微生物的影响，结果表明氯氰菊酯可以促进细菌的生长，抑制真 菌的生长，对样品中革兰氏阳性细菌比率的降低以及革兰氏阴性细菌比率的增加 也有明显的作用，后续实验还发现一些细菌能够增强农药毒性，降低微生物的降 解能力。 1 5 课题的提出和研究内容 1 5 1 课题的提出 在过去的几十年，拟除虫菊酯类农药凭借其高效、低毒、低抗性、广谱性等众 多独特的优点，跻身成为现代使用农药中最主要的成员，约占世界杀虫剂市场3 0 的份额。随着对有机磷杀虫剂使用的限制，拟除虫菊酯类杀虫剂的用量会越来越 大，同时，其毒性研究也受到了环境研究者们的广泛关注。 2 0 0 6 年，我国现用的农药中超过4 0 都具有手性结构，对环境中非靶标生物 的危害很大( 干扰内分泌、致癌、致畸、致突变) 。拟除虫菊酯类农药一般包含1 3 个手性中心，是一类具有2 4 对对映异构体的手性农药。众所周知，手性是一切生 命的基础，由于生物体对手性物质具有精确的识别能力，不同对映体的生物活性 存在着极大的差异。通过对映体的分离，可以降低：污染物对环境中非靶标生物所 产生的危害。目前对拟除虫菊酯类农药对映体选择性毒性的研究主要集中在急性 毒性、慢性毒性及内分泌干扰等方面，而从基因层面上联合探讨其对免疫系统和 内分泌系统的毒性研究还比较少。 斑马鱼作为o e c d 标准化的评价外源化合物毒性的实验动物，已被广泛应用 于不同的毒理标准测试中。斑马鱼不仅具有容易饲：养、发育快、发育特征明显等 优势，还有着和哺乳类动物相似的免疫系统，而且比较完整的斑马鱼基因序列也 为基因表达分析提供了极大的方便。 1 0 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 拟除虫菊酯类农药虽然对哺乳类及鸟类的毒性较低，但对鱼类等水生生物的 毒性却很大。在对拟除虫菊酯类农药的去除方法中，微生物降解法具有成本低、 效率高、无二次污染、生态恢复性好等独特优势，受到众多学者的亲睐。 胺菊酯是拟除虫菊酯的一种，属于强力合成杀虫剂，对蚊、蝇等卫生害虫具 有快速击倒效果，但致死性能差，有复苏现象，因此多与其它杀虫效果好的药剂 混配使用。该药为世界卫生组织推荐用于公共卫生的主要杀虫剂之一，目前国内 外对其水生毒性的研究还比较少。 因此，本文以胺菊酯为模型化合物，研究了其对斑马鱼胚胎的发育毒性，并 在制备对映体小样的基础上，分析了其对斑马鱼胚胎的对映体选择性毒性，并筛 选出一株能够有效降解胺菊酯的菌种。 1 5 2 研究内容 根据本课题的研究目的和实验室技术条件，确定的研究内容如下： ( 1 ) 胺菊酯对斑马鱼发育毒性研究 以斑马鱼为模式生物，将其胚胎暴露在胺菊酯中7 2 h ，观察其孵化情况和形态 学畸形。 ( 2 ) 胺菊酯的手性分离 利用h p l c $ | j 备获取少量对映体纯样品，目的是建立对映体的定性和定量分析 方法，为后续研究服务。 ( 3 ) 反式胺菊酯的对映体选择性毒性 研究反式胺菊酯对斑马鱼胚胎的急性毒性对映体选择性，并通过反式胺菊酯 及其对映体对斑马鱼胚胎中免疫基因和内分泌基因表达量的影响，来探讨其对免 疫系统及内分泌系统的毒性。 ( 4 ) 胺菊酯的微生物降解 采取降解菌的分离和纯化降解效果检测条件优化菌种鉴定的 实验方案，最终分离出有良好降解效果的菌种。 胺菊酯的水生毒性及微生物降解 第二章胺菊酯对斑马鱼发育毒性研究 1 9 6 8 年，胺菊酯在e p a 首次登记使用，该机构估计，胺菊酯每年的使用量达 1 5 0 0 0 3 0 0 0 0 磅。为了长期有效的防治害虫，胺菊酯常与其他有效成分联合使用。尽 管e p a 曾认为水生生物不太可能会暴露在胺菊酯中，但已有研究证实胺菊酯会对水生 生物产生比较大的毒性。胺菊酯会影响神经细胞钠离子通道的门控过程，从而使得神 经系统极度亢奋而导致瘫痪或死亡( e p a ) 8 8