（食品科学专业论文）产细菌素乳酸菌的筛选、细菌素的纯化及其特性研究.pdf

摘要 本实验从分离自内蒙古传统乳制品中的1 3 5 株乳酸菌中，通过纸片法初筛、牛津 杯法复筛，得到一株具有广谱高效抑菌活性的细菌素产生菌w i l l 2 2 1 。经常规生理 生化及分子生物学实验，鉴定该菌为戊糖乳杆菌( i , a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s ) 。同时，本 文对影响厶p e n t o s u sw h l 2 2 1 产细菌素抑菌活性的因素以及该细菌素的生物学特 性进行了分析，并对该细菌素的纯化进行了初步研究。主要研究结论如下： ( 1 ) 影响l p e n t o s u sw h l 2 2 1 产细菌素抑菌活性的因素：指示菌种类及其浓度、 培养基种类、培养时间及有机溶剂和其他抑菌物质的添加等因素均对细菌素抑菌结果 有影响。p e n t o s u sw i l l 2 2 1 在m r s 培养基中培养4 8 h 后的发酵上清液对菌体浓度 为2 0 x1 0 6 c f u m l 的蜡样芽孢杆菌具有最佳的抑菌效果。且t w e e n8 0 对该细菌素的 产生有一定的刺激作用。同时，三p e n t o s u sw i l l 2 2 1 产生的细菌素与其他抑菌物质 协同作用也可增强其抑菌效果。 ( 2 ) 细菌素生物学特性：l p e n t o s u sw h l 2 2 1 所产细菌素在p h2 0 时活性最高， 显示活性的p h 范围为2 0 6 0 ，且在此p h 范围内该细菌素对热有耐受性。用各种蛋 白酶处理后发现，它对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶不敏感，但对胰蛋白酶和凝乳蛋白酶敏 感。三p e n t o s u sw i l l 2 2 1 所产细菌素的抑菌谱广，不仅对乳酸菌和非乳酸菌属的革 兰氏阳性菌( 如蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌) 有抑制作用，对革兰 氏阴性菌( 如大肠杆菌、鼠伤沙门氏菌、弗志氏贺氏菌) 也有抑制作用。l p e n t o s u s w h l 2 2 1 所产细菌素的抑菌作用效果明显，在6 1 0 小时内可降低蜡样芽孢杆菌活细 胞2 3 个数量级，但不能杀死细菌。同时，它与产n i s i n 菌株l a c t sp c m 2 3 7 9 相比， 二者抑菌效果基本相同。 ( 3 ) 细菌素的纯化：采用发酵液超滤、s e p h a d e x g 2 5 柱层析纯化三p e n t o s u s w i l l 2 2 1 所产细菌素。发酵液经超滤分离后，分子量在3 k 以上5 k 以下的组分对蜡 样芽孢杆菌具有最为明显的抑菌效果：将其层析分离后，分离出三种组分，第二个峰 的组分具有最强的抑菌活性。结果表明，该细菌素的主要抑菌活性成分分子量介于 3 k - 5 k 之间，是一种小分子多肽类物质。层析分离出的第二个峰的组分有待于进一步 的研究。 关键词：戊糖乳杆菌；细菌素；抑菌特性；超滤；层析 s t u d yo ns c r e e n i n go fb a c t e r i o c i n p r o d u c i n gl a c t i c a c i d b a c t e r i a 、p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fb a c t e r i o c i n a b s t r a c t ab a c t e r i o c i np r o d u c i n gs t r a i nw h12 2 1w a ss c r e e n e df r o ms e v e r a l l a c t i ca c i db a c t e r i a w h i c hw e r ei s o l a t e df r o mt r a d i t i o n a lp r o d u c t si ni n n e rm o n g o l i ab ys c r i pm e t h o da n d c y l i n d e r - d i s hm e t h o d t h es u p e m a t a n to fw h 12 - 2 1h a ds t r o n gb a c t e r i o s t a f i ca c t i v i t y a g a i n s ts e v e r a lg r a m - p o s i t i v eb a c t e r i aa n dg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a t h es t r a i nw a si d e n t i f i e d a sl a c t o b a c i l l u sp e n t o s u sb yp h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lt e s t i n ga n dm o l e c u l a r - b i o l o g i c a l t e s t i n g f a c t o r st h a ta f f e c t 三p e n t o s u # w h12 2 - 1p r o d u c i n gb a c t e r i o c i na n dt h eb i o l o g i c a l f e a t u r e so fb a c t e r i o c i nw e r ea n a l y z e d a n dp u r i f i c a t i o no fb a c t e r i o c i nw a ss t u d i e d t h e r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) f a c t o r st h a ta f f e c t e d 三p e n t o s u sw i l l 2 - 2 - 1p r o d u c i n gb a c t e r i o c i ni n v o l v e d i n d i c a t o ra n di t sd e n s i t y ，c a t e g o r yo fm e d i u m ，c u l t u r et i m e ，a d d i t i o no fo r g a n i cs o l v e n ta n d o t h e ra n t i b i o t i cs u b s t a n c e s t h es u p e r n a t a n to fl p e n t o s u sw h 12 2 1i nm r sf o r4 8 hh a d g o o db a c t e r i o s t a s i se f f e c to nb a c i l l u sc e r e u st h a ti t sv i a b l ec e l ln u m b e r sw e r e2 0x 10 6 c f u m l a d d i n gt w e e n8 0 o ro t h e ra n t i b i o t i cs u b s t a n c e sc o u l dp r e f e r a b l ye n h a n c e b a c t e r i o s t a t i ce f f e c to ft h eb a c t e r i o c i n ( 2 ) t h eb i o l o g i c a lf e a t u r e so fb a c t e r i o c i nw e r ea sf o l l o w s ，b a c t e r i o c i np r o d u c e db y 工p e n t o s u sw i l l2 - 2 一1w a ss t e a d ya n ds t i l la c t i v ei na c i do rw e a ka c i d ，i t so p t i m u mp hw a s 2 0 ，a n dh a dg o o dt h e r m a ls t a b i l i t yb e t w e e np h2 0a n dp h6 0 t h eb a c t e f i o c i nw a s s e n s i t i v et o t r y p s i na n dc h y m o s i nb u ti n s e n s i t i v et op e p s i na n dp a p a i n b a c t e r i o s t a t i c s p e c t m mo ft h eb a c t e r i o c i nw a sv e r yw i d e ，i tc o u l di n h i b i tn o to n l yl a c t i ca c i db a c t e r i ab u t a l s og r a m - p o s i t i v eb a c t e r i ap c e r e u s 、s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 、l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ) a n d g r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ( e s c h e r i c h i ac o l i 、s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 、s h i g e l l a f l e x n e n ) t h em e c h a n i s mo fb a c t e r i o c i nw a sb a c t e r i o s t a s i sr a t h e rt h a ns t e r i l i z a t i o n , a ss h o w nb ya o b v i o u sd e c r e a s ea b o u t2 - 3o r d e r so fm a g n i t u d ei nt h ev i a b l ec e l ln u m b e r so fb c e r e u so v e ra p e r i o do f6 10 h a n dc o m p a r e dt oan i s i np r o d u c i n gs t r a i nl 1 a c t i sp c m 2 3 7 9 ，a n t i m i c r o b i a l e f f e c to fb a c t e r i o c i np r o d u c e dl p e n t o s u sw i ll2 2 1w a sb a s i c a l l ye q u a lt oi t ( 3 ) p u r i f i c a t i o no fb a c t e r i o c i nw a sa sf o l l o w s t h eb a c t e r i o c i nw a sp u r i f i e db y u l t r a f i l t r a t i o na n ds e p h a d e xg - 2 5c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y a f t e rt h eb r o t hw a su l t r a f i l t r a t e d ， s o m es u b s t a n c e sw h i c ht h em o l e c u l a rw e i g h tw a s3 k d a 一5 k d ah a dap o w e r f u lb a c t e r i o s t a t i c e f f e c tt ob c e r e u s ；t h e nb ys e p h a d e xg - 2 5c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ，t h r e ek i n d so f c o m p o s i t i o n w e r eo b t a i n e d ，c o m p o s i t i o no ft h es e c o n ds u m m i th a dt h e s t r o n g e s t b a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t y t h er e s u l t si n d i c a t e d ，t h eb a c t e r i o s t a t i ca c t i v i t yc o m p o s i t i o nw o u l db e ak i n do fs m a l lm o l e c u l a rp o l y p e p t i d e ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fw h i c hw a sb e t w e e n3 k d a a n d5 k d a c o m p o s i t i o no ft h es e c o n ds u m m i tw i l lb es 矗击e d 胁e l k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u ap e n t o s u s ；b a c t e r i o c i n ；a n t i b a c t e r i a lc h a r a c t e r i z a t i o n ； u l t r a f i l t r a t i o ；c h r o m a t o g r a p h y d ir e c t e db y ：p r o f m e n g h e b l l i g e ( p h d ) a p p lic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：f a n gf a n g ( f o o d m i c r o o r g a n i s m ) ( r ：o o d s c i e n c ea n d e n g i n e e r i n g c o l l e g e ，i n n e r m o n g o l i a a g r i c u l t u r a l u n i v e r s i t y , h u h h o t 0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的- 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：专葛日期：塑兰至! 璺1 皇区 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本入完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，印：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业高校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 弓笏 篓 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引吾 1 1 乳酸菌 乳酸菌是一类革兰氏染色呈阳性的杆菌或球菌、不形成芽孢、不运动、过氧化氢 酶试验呈阴性、对葡萄糖发酵能产生5 0 以上乳酸，而且在缺少氧气的环境中生长良 好的兼性厌氧性细菌的总称n 2 3 1 。主要包括乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、肉食杆菌属 ( c a r n o b a c t e r i u m ) 、链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 、肠球菌属( e n t e r o c o c c u s ) 、乳球菌属 ( l a c t o c o c c u s ) 、明串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 、片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 和气球菌属 ( a e r o c o c c u s ) 等n 1 ，在食品、医药、农业等重要领域都具有很高的应用价值。钔。 乳酸菌在自然界中分布广泛，是人和动物肠道正常菌群中的优势菌，不仅具有 许多对人和动物健康有益的生理功能，如延缓衰老、抗肿瘤、降血脂、降胆固醇、增 强免疫力等，而且还能够产生有机酸( 如乳酸、丁酸和醋酸等) 、过氧化氢、二氧化 碳、细菌素等多种天然抑菌物质口1 ，这些抑菌物质不仅对食品的风味和组织状态有很 好的保持效果，还可以抑制腐败菌和病原菌的生长，从而防止腐败，延长食品的保质 期晦们。尤其是乳酸菌产生的代谢产物细菌素，以其对动物无毒性，易被人体消化道中 的蛋白酶降解，不会在体内蓄积引起不良反应等特性，目前被人们公认为是一类具有 潜在开发能力的天然生物性食品防腐剂阻“。 1 2 乳酸菌产生的抑菌物质 1 2 1酸性物质 乳酸菌可以产生对食品中微生物具有抑制作用的酸性物质，主要是乳酸菌的代谢 终产物及中间产物，包括乳酸、乙酸等1 。产生的乳酸等有机酸能显著降低环境p h 值和e h ( 氧化还原电位) 值，使环境保持酸性，对致病菌有拮抗作用。 一般细菌生长的最适p h 值为6 0 7 0 ，若低于该值，细菌的生长速率将大大降低 或不生长甚至死亡，这在腐败性微生物上尤为可见。乳酸菌产生的酸性物质对食品中 微生物的抑制作用已在许多实验中得到证实，这种抑菌作用取决于3 个相互影响的因 素：介质的p h 值、酸的离解程度、酸的种类口副。 1 2 2 过氧化氢( h ：0 ：) 乳酸菌具有黄素蛋白氧化酶活性，在有氧条件下可产生过氧化氢。乳酸菌产生的 过氧化氢能够激活过氧化氢酶一硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶 阳性细菌，如假单胞菌属、大肠杆菌属和沙门氏茵属等。由于乳酸菌不含过氧化氢酶， 产生的过氧化氢可以在食物环境中不断的积蓄，从而对其他微生物产生抑制作用。但 是这种过氧化氢的产生和积蓄有赖于食物介质中氧的浓度、食物的形态和温度等，一 般以在较低温度、具有较高氧浓度的液态或半液态的食物环境为佳n ”。 d a h i y a 和s p e c h n 2 1 研究了乳酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌的抗菌活性，证实发酵 2 产细菌素乳酸菌的筛选、细菌素的纯化及其特性研究 滤液中所含有的h 2 0 2 对金黄色葡萄球菌具有抑制效果。p r i c e 和l e e n 分离鉴定的几 株植物乳杆菌菌株，其滤液中所含有的h 2 0 2 对假单胞杆菌、芽孢杆菌和变形杆菌均有 抑制效果，且假单胞菌对植物乳杆菌滤液最为敏感。 1 2 3 二氧化碳( c 0 ：) 异型发酵的乳酸菌可发酵己糖产生c 0 2 以抑制霉菌和一些革兰氏阴性菌的生长。 但对一些酵母菌和乳杆菌则无效。c 0 2 的抑菌作用机制现在还不甚清楚，但普遍认为 是通过两种途径而实现的【1 ：一是c 0 2 吸附在食物成分上，造成厌氧环境以抑制需氧 微生物，如一些酵母菌的生长；另一是环境中c 0 2 浓度的增加可引起细胞内p h 值和 酶活性的下降以及细胞膜传递功能的减弱。 1 2 4 双乙酰( 丁二酮) 双乙酰是乳球菌、明串珠菌、链球菌、片球菌及乳杆菌中某些菌株发酵产生的食 品风味物质，具有一定的抑菌效果。与非乳酸菌属的革兰氏阳性茵相比，革兰氏阴性 菌和酵母菌对双乙酰更加敏感，且双乙酰是唯一一类能有效抑制革兰氏阴性菌、酵母 菌和霉菌的抑菌化合物n 盯。双乙酰的抗菌作用，特别是在活细胞内的确切抗菌模式目 前还不很清楚。 研究人员对双乙酰抑制、减少或杀死致病菌和食品腐败菌的效果进行了研究。当 将大肠杆菌、鼠伤沙门氏菌n 町和金黄色葡萄球菌n7 1 接种到低质量浓度( 1 0 0 m g l ) 和 高质量浓度( 1 0 0 0 m g l ) 的双乙酰营养琼脂中，3 7 分别培养2 4 h ，k u l s h r e s t h a 等 发现n w ，低质量浓度双乙酰并没有降低处理组菌株的生长率；而高质量浓度双乙酰在 2 h 内能导致9 9 的菌体失活。f a r a h n 町研究表明：当金黄色葡萄球菌接种到肉汤 培养基中3 7 培养，在1 2 h 到2 4 h 的生长期间，质量浓度在5 0 2 5 0 m g l 范围内 的双乙酰可以抑制其生长；尽管金黄色葡萄球菌以后均能恢复生长，但用双乙酰处 理过的样品细胞终质量浓度始终比未处理的样品细胞终质量浓度要低；在含有双乙 酰培养基中生长的金黄色葡萄球菌产生的外毒素比对照低。 1 2 5 乳酸菌素 1 2 5 1 乳酸菌素的定义 细菌素是一类在细菌代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的蛋 白质或多肽n 耵。由乳酸菌产生的细菌素又叫乳酸菌素洲。它可以广泛地抑制革兰氏阳 性菌，尤其是抑制一些腐败菌和病原菌，且与螯合剂结合可以将其活性谱拓宽到革兰 氏阴性菌他。很多乳酸菌都能够产生细菌素，目前报道的有4 0 余种乳酸菌素，它们 分别由乳球菌属、片球菌属、明串珠菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、链球 菌属和肉食杆菌属的菌株所产生嘲。 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 1 2 5 2 乳酸菌素的分类 对于乳酸菌素的分类，目前主要有2 种分类方法： 一是基于分子量、热敏感性和是否含修饰性氨基酸，将乳酸菌素大致分为4 类： 羊毛硫细菌素( l a n t i b i o t i e s ) ，是一类含有1 9 5 0 个氨基酸分子的肽类，并具有诸如 羊毛硫氨酸( l a n t h i o n i n e ) 、p 甲基羊毛硫氨酸( 1 3 - m e t h y l l a n t h i o n i n e ) 、脱氢酪氨酸 ( d e h y d r o b u t y r i n e ) 、脱氢丁氨酸( d h b ) 和脱氢丙氨酸( d h a ) 等非编码氨基酸1 。这 一类中最有名的细菌素是n i s i n 。小分子热稳定肽类细菌素( s m a l lh e a t s t a b l e p e p t i d e ，s h s p ) ，是一类分子量小于1 0 k u ，疏水的具有膜活性的肽。如l a c t o c o c c i na ， b ，m ，g ；l e u c o c i n a u a l l 8 7 汹1 ；大分子热不稳定蛋白类细菌素( l a r g eh e a t l a b i l e p r o t e i n ，l h l p ) ，是一类大分子蛋白( 通常大于3 0 k u ) ，1 0 0 、3 0 m i n 加热失活。如 h e l v e t i c i n 1 ，l a e t i c i na ，b ；c a s e c i n8 0 ，a c i d o p h i l u c i na 口刀；复合型细菌素，除蛋 白质外，还含有碳水化合物或类脂基团乜引。如p l a n t a r i c i ns 、l e u c o n o c i ns 。其中第 类因不含有羊毛硫氨酸基团，又被称为非羊毛硫细菌素( n o n 1 a n t i b i o t i c s b a c t e r i o c i n ) 绷。 二是根据乳酸菌的种属不同而将其所产的细菌素分为6 类：乳球菌属细菌素， 包括双球菌素( d i p l o e o c c i n ) 、乳球菌素( l a c t o c o c c i n ) 、乳链球菌素( l a c t i c i n ) 、乳链 菌肽( n i s i n ) ；片球菌属细菌素，有p e d i o c i na c h ，p a 1 ，a 及由片球菌属的乳酸 片球菌p c 僻a c i d i l a t 七ip c ) 和啤酒片球菌f b b 6 3 c e r e v i s i a ef b b 6 3 ) 产生的2 种未命 名的细菌素；明串珠菌属细菌素，有明串珠菌素m e s e n t e r o c i n5 ，l e u c o c i na ， l e u c o n o c i ns ；肉食杆菌属细菌素，有c a m o b a c t e r i o c i na 1 ，a 2 ，a 3 ，u 1 4 9 ，b 1 ， b 2 ；乳杆菌属细菌素，包括p l a n t a r i c i n a ，b ，c ，b n ；s a k a c i n a ，m ，p ；l a c t o c i n s ，2 7 ，b ；b r e v i c i n ，l a c t a c i nf ，c a s c i c i n8 0 ，c u r v a c i na ，h e l v e n t i c i nj ，v - 18 2 9 ： b a v a r a c i nm n ；f e r m m t i c i n 等近2 0 种；其他乳酸菌细菌素，嗜热链球菌代谢产生 的物质具有抗烟曲霉、寄生曲霉和根霉等真核生物的能力；c a s a u s 等报道屎肠球菌 t 1 3 6 ( e n t e r o c o c c u s f a e c i u mt 1 3 6 ) 可同时产生肠菌素a ，b ( e n t e r o c i n a ，b ) 。 1 2 5 3 乳酸菌素抑菌作用机理 ( d l a n t i b i o t i c s 类 l a n t i b i o t i c s 类细菌素是一类在核糖体上合成的，分子中含稀有的羊毛硫氨基酸、 甲基羊毛硫氨基酸的细菌素。该细菌素组中研究最为深入的是n i s i n 。n i s i n 是由乳酸 乳球菌乳酸亚种分泌的一种线型多肽，对革兰氏阳性菌有较广的抑制作用，并可使芽 孢杆菌和梭状芽孢杆菌的芽孢对热敏感，其抑菌作用最初被认为是一种表面活性剂 作用；也有人认为n i s i n 的作用是由于其中的2 个脱水氨基酸( 脱水丙氨酸和脱水丁氨 酸) 与细菌细胞中的酶的巯基发生反应；另外还有人认为n i s i n 也可以引起敏感细胞或 人工脂质体的质子驱动力、膜电位和p h 值梯度等主要组分下降，导致细胞死亡】。 4产细菌素乳酸菌的筛选、细菌素的纯化及其特性研究 目前认为除了以上3 种原因外，还存在孔道形成( b a r r e l s t a v e ) 机制m 1 ，即n i s i n 对 细胞作用的初级靶是细胞质膜，在一定膜电位的存在下，依赖能量使细胞质膜形成短 暂的孔洞或通道，增加了整个细胞和脂质体中膜的通透性，导致离子和小分子化合物 等低分子量物质流出，细胞膜去极化及a t p 泄露，细胞外水分子流入，导致细胞裂 解嘲。因其作用需膜电位的存在，故又称能量依赖型细菌素。 非l a n t i b i o t i c s 类 非l a n t i b i o t i c s 类细菌素的作用机制也是在细胞膜上形成一个亲水孔道，但此亲水 孔道是经膜上特定的受体蛋白介导的，与膜电位无关m 一。与l a n f i b i o t i c s 类细菌素 比较，此类细菌素主要是破坏膜功能的稳定性( 如能量传导) ，而不破坏膜结构的完 整性。此类细菌素又被称为非能量依赖型细菌素。 1 3 乳酸菌素的研究现状 1 3 1国外研究现状 1 9 2 5 年，g r a t i a 发现大肠杆菌产生的c o l i c i n e ，是最早关于细菌素的文献记载。 以后几十年国外学者开始了乳酸菌细菌素的研究，主要集中在对n i s i n 的研究。1 9 2 8 年，l r o g e r s 和w h i t t e r 发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制乳酸杆菌的生长阳一； 1 9 3 3 年，w h i t e h e a d 分离出这种物质，并证明它是一种多肽；1 9 4 7 年，m a t t i c k 和h i r s c h 认识到链球菌血清学n 群中的一些菌株产生蛋白质性质的抑制物，并证明该物质可抑 制许多g + 菌，并将其命名为“n i s i n ”嗍；1 9 5 1 年，h i r s e h a 发现乳酸链球菌( 后命名 为乳酸乳球) 可被用作食品防腐剂，成功的控制了由产气梭状芽孢杆菌引起的奶酪腐 败曙：1 9 5 2 年，c l i n t o c k 等人把产n i s i n 的乳酸乳球菌菌株直接加到酸奶中来控制由 产气梭状芽孢杆菌引起的膨胀腐败，效果显著瞪刳；1 9 5 3 年，第一种商业化的n i s i n 产 品n 1 s a p l i n 在英国面市；1 9 6 9 年，联合国粮食及农业组织( f a o ) 世界卫生组织 ( w h o ) 联合食品添加剂专家委员会确认n i s i n 可作为食品添加剂1 ；1 9 7 1 年，g r o s s 和 m o r e l l 阐明t n i s i n 分子的全结构嘲1 ；1 9 8 8 年，b u c h m a n 等克隆了编码n i s i n 前体的 结构基因并测定了d n a 序列嘲；1 9 9 1 年，m u l d e r s 等发现n i s i n 有两个天然变异体即 n i s i n a 和n i s i n z 。 近几年国外学者对乳酸菌细菌素的研究主要集中在高产细菌素菌株的筛选、提取 新的乳酸菌细菌素、细菌素的纯化方法、细菌素蛋白质结构和编码基因等方面的研究 上。如j u r g e nv e r l u y t e n 等口力( 2 0 0 4 ) 从发酵香肠中分离的l a c t o b a c i l l u sc u r v a t u s l t h l1 7 4 中提取了细菌素c u r v a c i na ；c a v a n r e e n e n 等侧( 2 0 0 6 ) 研究了分离自 啤酒中的一株植物乳杆菌所产生细菌素p l a n t a r i c i n 4 2 3 的基因分析，分析了位于质粒 上细菌素的编码基因，并表达出该细菌素的免疫蛋白；i m k e w i e d e m a n n 等删( 2 0 0 6 ) 由植物乳杆菌l l 描1 所产生的p l a n t a r i c i n c 与n i s i n 的作用模式进行了比较研究，认 为脂质在细菌素的抑菌活性上起着关键作用，并且防护细菌素产生菌的胞壁形成孔 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 洞；h e os 等旧1 ( 2 0 0 7 ) 采用阳离子交换色谱法从乳酸片球菌提取液中分离纯化出一 种细菌素，该细菌素通过破坏致病菌的细胞壁释放内含物使菌体自溶，从而达到杀菌 的目的；h a nk s 等( 2 0 0 7 ) 对嗜酸乳杆菌产生的细菌素a c i d o c i n l b 的抑菌机制 进行了研究，认为作为质子直线加速器的质粒引起了细菌素a c i d o c i n l b 及宿主免疫 系统的产生，同时它能转换成嗜酸乳杆菌a t c c 4 3 1 2 1 的感受态细胞。 另外研究者通过有机溶剂法、菌体吸附法、其他吸附法、膜分离法、盐析法、泡 沫分离法、免疫亲和层析和免疫磁珠分离等方法来分离纯化某些菌株所产的细菌素。 如c h e s e m a n 和b e r r i d g e ( 1 9 5 7 ) 利用正丙醇和氯化钠的组合物从发酵液中回收细 菌素；y a n g 等哺( 1 9 9 2 ) 利用了p h 依赖的菌体吸附法提取细菌素，他们发现细菌 素对产生菌细胞的最大吸附出现在p h 6 5 ；c h e i g hci 等魄1 ( 2 0 0 4 ) 采用离子交换 层析来进一步纯化n i s i n z 。最终的纯化倍数为3 1 倍，收率为9 0 ；d a o u d il 等旧1 ( 2 0 0 1 ) 利用分子截流量为1 0 0 0 道尔顿的中空纤维膜对离心处理除过菌体的发酵液进 行了超滤，最终浓缩率达到5 ，收率达到7 4 2 ，纯化程度为1 3 ；而通过饱和 硫酸铵盐析得到的细菌素粗制品的收率达到6 0 ，纯化程度为2 0 ；h i g h m l ( 1 9 5 1 ) 利用泡沫技术回收细菌素，最终收集到容器中的泡沫含有9 0 的细菌素。近几年，一 些利用新枝术进行的提纯工艺也发展起来，如s u a r e z a m 等【蚓( 1 9 9 7 ) 采用免疫亲 和层析法分离纯化细菌素，其可以一步提纯细菌素；g u 6 n o l 6 e 等( 2 0 0 0 ) 则是采 用免疫磁珠分离法分离纯化细菌素。 1 3 2 国内研究现状 国外对乳酸菌素的研究比较早，报道的文献资料很多。而国内对细菌素研究少、 起步晚，近年来主要进行了一些产细菌素乳酸菌菌株的筛选、细菌素纯化及理化性质 等工作。其中对n i s i n 的研究最为深入。 植物性来源的乳酸菌细菌素 张艾青等m ( 2 0 0 7 ) 筛选出1 株分离自醪糟的具有较强抑菌作用的产广谱细菌素 植物乳杆菌p 1 5 8 ，它对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞杆菌、 枯草芽孢杆菌均有抑制作用；韩雪等彻( 2 0 0 6 ) 从东北发酵酸菜中筛选到一株产细菌 素的乳酸片球菌，利用改变p h 的方法分离纯化了细菌素，该细菌素对植物乳杆菌、 绿脓杆菌、单胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌 均有抑制作用，并具有耐热、耐盐的特性；王蔚森等( 2 0 0 6 ) 从自制青贮饲料中筛 选到两株乳酸菌x l 、c 1 5 ，进行细菌素的提取以及用s d s p a g e 进行初步鉴定， 发现有明显的电泳条带；刘双凤等嘲( 2 0 0 7 ) 从自然发酵辣椒中分离出三株具有广谱 高效抑菌作用的乳酸菌，并对抑菌成分进行了研究，发现起抑菌作用的物质是细菌素。 动物性来源的乳酸菌细菌素 杨颖等( 2 0 0 6 ) 从健康成年人的口腔中筛选出一株产细菌素的植物乳杆菌 6 产细菌素乳酸菌的筛选、细菌素的纯化及其特性研究 h o 6 9 ，它对变形链球菌等革兰氏阳性菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌具有抑制作用。 细菌素经初步提取，推测其分子量在1 0 k d a 以下：周雨霞等m 1 ( 2 0 0 6 ) 采用平板挖 井扩散法从内蒙古传统乳制品中筛选到一株产细菌素的乳酸乳球菌c b 2 0 2 ，其发酵 上清液对乳酸菌和非乳酸菌属的g + 显示出抑菌活性，但对g 。菌无抑菌作用；吕燕 妮等阳1 ( 2 0 0 5 ) 从云南宣威火腿中分离筛选出一株具有广谱抑菌活性的产细菌素的戊 糖乳杆菌菌株，该细菌素是一种具有良好热、酸稳定性的蛋白活性物质；其抑菌效果 明显，在3 5 h 内可减少敏感菌细胞数1 0 2 1 0 3 个；优化产细菌素的条件后，得到细 菌素产量是初始培养基培养的8 倍，达到6 4 0 i u m l ：采用阳离子交换树脂纯化细 菌素，比活力可达1 2 5 9 8 4 i u m g ，是原发酵液的1 7 倍；曾志刚等( 2 0 0 2 ) 从香 肠中分离得到一株产细菌素的乳酸片球菌，其发酵液经硫酸铵沉淀，c m s e p h a d e x 5 0 阳离子交换柱层析后，得到的细菌素样品通过s d s p a g e 证明是一条带，分子量约 2 0 8 3 k u ，该细菌素对热及酸碱稳定，易被酶降解而失去活性，对许多革兰氏阳性菌有 较强的抑制作用，而对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌没有作用。 n i s i n 目前关于乳酸菌细菌素的研究主要集中在n i s i n 的作用机制、遗传学研究、影 响n i s i n 活力因素等方面，在n i s i n 高产菌株的发酵条件的探索、结构基因扩增、 基因定位和构建克隆菌株等工作领域均取得了一定的进展。如还连栋等n ”1 对n i s i n 结构基因的p c r 扩增、基因定位、克隆株的构建、生物合成的遗传控制、基因表达 调控、产生菌的定向筛选及发酵产物的鉴定及其杀菌作用机制等方面进行了不断的研 究；庄绪亮等眦1 ( 1 9 9 8 ) 对n i s i n 特殊结构的成因进行了研究，发现特殊结构中的硫醚 桥与它的热稳定性有关，而分子结构中的d h a s 与它的活性有关i 吴琼等嘲( 2 0 0 0 ) 对 n i s i n 的发酵条件进行研究，得出了产细菌素的最佳培养条件；郭本恒泓1 ( 2 0 0 0 ) 对 n s i n 的化学组成、稳定性、毒性、溶解性及影响活性因素等方面进行了详细的研究， 发现存在有两种天然的n i s i n 分子，即n i s i n a 和n i s i n z 。 7 随着生物化学、分子生物学及免疫学技术的发展与进步，对乳酸茵细菌素的研究 越来越偏向于分子生物学方面，研究重点可能集中在以下几方面：通过基因重组技 术构建高产、广谱抗性菌株，以期获得抗菌效果更好的天然防腐剂：细菌素的免疫 机制、作用机理以及结构和功能之间关系的研究；利用基因工程技术对产细菌素菌 株进行改良，使之适应不同环境不同作物的生物防治：根据已知的细菌素结构设计 全新的氨基酸系列，人工合成新型的细菌素，或对现有的细菌素进行改造，扩大细菌 素的应用范围；通过蛋白质工程构建新的细菌素，改进细菌素的稳定性和抑菌谱等 特性，以适于工业化生产和实际应用。 1 4 乳酸菌素的应用 1 4 1 在食品方面的应用 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 到目前为止，细菌素中只有n i s i n 被公认为安全，批准应用于食品工业。n i s i n 作 为安全、无毒、天然的食品防腐剂已被全世界5 0 多个国家和地区广泛应用在乳制品、 罐头制品、啤酒及果汁饮料、肉制品的生产中。除n i s i n 外，其他乳酸菌细菌素已 开始有所应用，但对其性质研究还不够深入，有待于进一步研究。 1 4 1 1 在乳制品中的应用 细菌素n i s i n 己成功应用于硬质干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐装浓缩 牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶、酸奶、乳制甜点等制品中。它能有效抑制肉毒 梭菌的生长和毒素的产生，延长产品的保质期并使其在常温下保存侧。经实验研究表 明，加入3 0 - - 5 0 i u m l 的n i s i n 可以使鲜奶货架期延长一倍；在经巴氏处理的干酪 中加入5 0 0 1 0 0 0 i u m l 的n i s i n 能阻止梭菌的生长和毒素的形成，同时还能降低 食盐和磷酸盐的用量；采用5 0 0 i u m l 的n i s i n 和耐酸c m c 、复合稳定剂a 或b ，可 延长酸奶的保质期4 - 8 d ，且不影响酸奶的感官和品质口刀。 1 4 1 2 在酸性罐头食品中的应用 在酸性条件下，n i s i n 的稳定性、溶解度、活性均提高，因而它可成功地应用于 高酸性食品( p h 5 k d a ) 及超滤液( m 5k d a ) ，然 后超滤液再经3 k d a 超滤柱超滤再得浓缩液( 3 k d a m 5k d a ) 及超滤液( m 3 k d a ) 。进水压力o 1 5m p a ，流量1 0 l , h 。所得超滤液、浓缩液分别做抑菌实验， 测量抑菌圈直径。 2 2 8 3 超滤液的凝胶柱分离 2 2 8 3 1 s e p h a d e x g 2 5 的前处理 取3 0 9s e p h a d e x g - 2 5 干胶n a 3 0 0 m l 蒸馏水，采用浮选法去除细小颗粒，在沸水 浴中加热2 小时，使其充分溶胀。用p i - 1 4 0 ，0 0 0 2 m o 儿的乙酸一乙酸钠缓冲液平衡。 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 7 真空抽气后装柱( 柱规格为l c m 9 0 e m ) 。 2 2 8 3 2 装柱 将凝胶上面过多的溶液倾出，关闭层析柱出水口，并向柱管内进入约1 3 柱容 积的洗脱液，然后在搅拌下将浓浆状的凝胶连续地倾入柱内，使之自然沉降，待凝胶 沉降约2 - 3 c m 后打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的凝胶 上升到离柱的顶端约2 c m 处时停止装排，关闭出水口。接着再用2 3 倍体积的洗脱 液使柱床稳定，然后在凝胶的表面上放一片滤纸，以防止加样时凝胶被冲起，并始终 保持凝胶上端有1 - 2 c m 液体。柱装好后，将柱管朝向光照方向用眼睛观察，看是否 均匀，有无“纹路”或气泡以检验其均一性。若层析柱不均一，必须重新装柱，检 查后即可上样。 ， 2 2 8 3 3 样品的前处理 将经3 k d a 超滤柱超滤获得的分子量在3 k d a m 5 k d a 浓缩液，通过旋转蒸 发仪进行浓缩，取浓缩液于4 冰箱，备用。 2 2 8 3 4 加样 关闭出水口，打开柱上端的螺丝帽，吸出层析柱中多余的液体直至与胶面相切。 上柱前仔细检查柱床表面是否平整，如果发现有凹凸不平的情况，用细玻璃棒轻轻 搅动表面，使凝胶重新自然沉降至表面平整。沿管壁将l m l 样品溶液小心加到凝胶 床面上，避免将床面凝胶冲起，打开出水口，使样品溶液流入柱内，当样品溶液流至 与胶面相切时，关闭出水口。用同样的方法操作，用l m l 洗脱液冲洗管壁2 次。 最后加入3 - 4 m l 洗脱液于凝胶上，旋紧上面螺丝帽，柱进水口连通装有洗脱液的恒 压瓶，柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池的进液口相连，比色池出液口再与部分收集 器相连，即可进行洗脱