（食品科学专业论文）细菌L乳酸发酵的研究.pdf

摘要 本文对从自然界筛选的产l 乳酸的同型乳酸发酵乳酸菌进行了n + 注入、 俐高糖、高酸驯化、选育及其鉴定，对目的菌株的发酵特性、培养基、发酵条 件优化和产物的离子交换树脂分离等方面进行了研究。 l 通过自然筛选，获得2 0 株产l 乳酸的乳酸菌，通过复筛及发酵试验， 确定了一株以同型乳酸发酵产l 乳酸量相对较高的乳酸菌l b 0 ，其l 一乳酸产量 为2 2g l 。采用低能n + 注入诱变菌株l b 0 ，在离子注入能量为5 0k e v 时，以 诱变剂量为1 2x1 0 捧i o n s s 进行注入得突变株l b l ，其l 哥l 酸产量达到了4 3 l 。 2 对突变菌株l b l 进行了耐高糖、高酸驯化和选育，得到菌株l b l 1 d ， 该菌株分别能在乳酸浓度为2 4g l 和葡萄糖浓度为1 5 0 9 l 的平板上生长。不 添加c a c 0 3 时，发酵液中l 哥l 酸可积累2 6 9 l ，添加c a c 0 3 发酵时其l 一乳酸 产量为5 4 9 l 。通过对菌株l b i 、1 的菌落、菌体形态特征的观察，发酵特性和 生理生化特征的研究，确定该菌株为能动乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s a g i l i sl b l ，1 d ) 。 3 对菌株l a c t o b a c i l l u sa g m sl b l 1 d 的发酵培养基进行了优化：通过单因 素试验，研究了不同碳、氮源种类、生长因子、无机盐对l 乳酸产量的影响， 并在单因素试验的基础上，利用响应面分析法优化了培养基中影响l 乳酸产量 的主要因素，得到了大米糖化液( x i ) 、玉米浆( x 2 ) 、番茄汁( x 3 ) 对l 乳酸 产量( y ) 的回归方程为：y 一0 0 3 x 1 2 0 1 3 x 2 2 - 0 0 2 x 3 2 + o 0 5 xj x 2 + 0 0 7 xj x 3 + 0 0 6 x 2 x 3 + 5 7 3 x 1 2 6 8 x 2 8 1 x 3 1 4 2 0 3 ，根据响应值典型分析求得了大米糖化液( x i ) 、玉 米浆( x 2 ) 、番茄汁( x 3 ) 的最佳浓度分别为：1 1 1 2 3g m 、1 3 9 m l l 、1 1 8 m l l 。 最终确定l a c t o b a c i l l u sa g i t i sl b l l d 的最佳发酵培养基：葡萄糖11 1 2 3g l 的 大米糖化液，玉米浆1 1 8 m l l ，酵母膏l o g ，番茄汁1 3 9 m l l ，乙酸钠0 5 9 ， m g s 0 4 7 h 2 0o 2 9 ，m n s 0 4 4 h 2 0o 0 1 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0 0 们g ，n a c lo 0 1 9 水1 0 0 0m l 。 4 对菌株l a c t o b a c i l l u sa g i l i sl b l 1 d 的培养条件进行了优化，确定了最佳 接种量为1 0 ；最佳发酵温度为3 7 c ；最佳中和剂为n h 4 0 h ；并就菌株 l a c t o b a c i l l u sa g m sl b l - 1 d 发酵中的不同控氧方式进行了研究，结果表明，采 取先通风后准厌氧培养强于一直静止培养或一直通风状态下的培养，并确定了 当通风培养1 4 h 后转入准厌氧培养为最佳控氧时间点，采用该培养方式，发酵 液中l 一乳酸产量达到1 0 3g l ，对糖的利用率为9 2 。 5 对发酵产物的离子交换树脂分离进行了研究，确定了最适合分离l 一乳酸 的离子交换树脂d 1 8 5 ，其交换容量和解吸率分别为7 5g l 和8 7 ，该树脂不 吸附葡萄糖和氨基氮，最佳再生碱为n h 3 h 2 0 ；对树脂d 1 8 5 的吸附，解吸工艺 条件的研究结果表明：当p h 值在9 左右，吸附流速选择控制为4 m l m i n 时 l - 乳酸收率为7 3 ：在解吸时，选择浓度为5 0 9 l 氨水以2 m l m i n 的速度进行 洗脱，得到的洗脱峰形最窄、峰值最高，l 乳酸收率为8 7 。 关键词：能动乳杆菌l 哥l 酸离子注入 a b s t r a c t t h ep a p c rf o c u s e do ns e l e c t i o n s a n d b r e e d i n g o ft h el a c t i ca c i db a c t e r i a d r o d u c i n gl 1 a c t i ca c i dw i t hh o m o l a c t i cf e r m e n t a t i o nf r o mt h en a t u r e f i r s t l y , t h i s l a c t i ca c i db a c t e r i aw a sm o d i f i e db yn + i m p l a n t a t i o na n dt h r o u g ht h ec u l t i v a t i o n o ft h em u t a n tu n d e rs u g a ra n dl a c t i ca c i dw i t hh i g hc o n c e n t r a t i o n ，t h ec o r r e s p o n d e n t s u g a r a n da c i d r e s i s t a n ts t r a i nw a ss c r e e n e da n dd e t e r m i n e d ，a n dt h e n t h e f e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c sa n dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so ft h es e l e c t e ds t r a i nw a s s t u d i e d f i n a l l y ，t h ep r o d u c ts e p a r a t i o nt h r o u g h t h e a n i o n - e x c h a n g er e s i n w a s i n v e s t i g a t e d t h e d e t a i l e dc o n t e n t sw e r ea sf o l l o w e d ： 1 t h r o u g ht h es c r e e n i n gi nt h en a t u r e ，2 0s t r a i n sp r o d u c i n gl l a c t i ca c i dw e r e o b t a i n e d a n dah o m o l a c t i cf e r m e n t a t i o ns t r a i nl b 0 ，w h i c hh a dah i g h e ry i e l do fl l a c t i ca c i da b o u t2 2 9 l ，w a sd e t e r m i n e db yt h es e c o n ds c r e e n i n ga n dt h ee x p e r i m e n t o ff e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s t h es t r a i nl b 0w a si n d u c e db yt h en + i m p l a n t a t i o n o fl o w e n e r g ya n dt h eb e s ti n d u c e m e n t d o s ew a sf o u n dt ob e1 2x10 l s i o n s su n d e r t h eb e s ti m p l a n t a t i o ne n e r g y5 0k e v a n dam u t a n ts t r a i nl b1w a so b t a i n e da c c o r d i n g l yb yt h es c r e e n i n g t h el l a c t i ca c i dy i e l do fs t r a i nl b 1w a s4 3g la n dt h e y i e l do fo r i g i n a ls t r a i nl b 0 w a s 2 2 班 2 as t r a i nl b1 1dw h i c ht o l e r a t e dh i g hc o n c e n t r a t i o no fl a c t i ca c i da n ds u g a r w a so b t a i n e db y t a m i n ga n dc u l t i v a t i n gi nt h ec i r c u m s t a n c ew i t hh i g hc o n c e n t r a t i o n o f s u g a ra n d l a c t i ca c i d 1 1 1 es t r a i n sc r i t i c a lg r o w t hc o n c e n t r a t i o no fl a c t i ca c i da n d s u g a rw e r e2 4g la n d15 0g lr e s p e c t i v e l y t h ey i e l dc o u l dr e a c h5 4 9 li fc a c 0 3 t , v a sa d d e da n d 2 6 r g li fn o t b e s i d e s t h es t r a i nw a sd e t e r m i n e dt ob el a c t o b a c i l l u s a g i l i sl b l - 1 db yt h es t u d yo fl b l 1 dc o l o n i a l c e l lm o r p h o l o g y , p h y s i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n df e r m e n t a t i o ns p e c i a l i t ye t c 3 t h eo p t i m i z a t i o no ff e m m n t a t i o nm e d i aa b o u tt h es t r a i nl a c t o b a c i l l u sa g i l 拈 l b1 - 1dw a sr e s e a r c h e d d i f f e r e n ts o r t so fc a r b o na n dn i t r o g e nr e s o u r c e s g r o w t h f a c t o r ，m e t a li o n so fi n o r g a n i cs a l tw e r es t u d i e di nt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t t h r e ei n g r e d i e n t ( r i c es a c c h a f i f i n gl i q u i d ，c o r ns y r u p ，t o m a t o j u i c e ) r a t i oo fm e d i a w a s o p t i m i z e dt h r o u g hr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ( c e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n ) t h e f u n c t i o nr e l a t i o n s h i pb e t w e e nm a i nf a c t o r sa n dr e s p o n s ev a l u e ( l 1 a c t i ca c i dy i e l d l w a se s t a b l i s h e d ，a n dt h er e g r e s s i o ne q u a t i o nw a so b t a i n e d t h er e g r e s s i o ne q u a t i o n w a s ：y o 0 3 x 1 2 0 ，1 3 x 2 2 - 0 0 2 x s 2 + o 0 5 x l x 2 + 0 0 7 x l x s + 0 0 6 x 2 x 3 甭7 3 x 1 - 2 6 8 x 2 。8 。1 x s 1 4 2 0 3 t h r o u g ha n a l y z i n gt h er e g r e s s i o ne q u a t i o n ，t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n so f t h e f a c t o r sw e r eo b t a i n e d ：r i c e s a c c h a r i f y i n gl i q u i d l1 3 2 3 9 l ，c o r n s y r u p1 3 9 m l l ， t o m a t o j u i c e 1 1 8 m l l a n dt h e o p t i m a l m e d i aw a sa sf o l l o w e d ：t h er i c e s a c c h a r i f i n gl i q u i d 1 1 1 2 3 g l ，c o r n s y r u p1 1 8 m l l ，t o m a t oj u i c e1 3 9 m l l s o d i u ma c e t a t e o 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 9 ，m n s 0 4 4 h 2 0o ，0 1 9 ，f e s 0 4 7 h 2 0 o 0 1 9 ，n a c lo 0 1 9 w a t e r1 0 0 0m l 4 t h ec u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i n l a c t o b a c i l l u sa g i l i sl b1 一idw a s s t u d i e da n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w e d ：t h ei n o c u l a t i o ns i z e t0 ，t h e f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e3 7 ，t h en e u t r a l i z e rn h 4 0 h d i f f e r e n tf e r m e n t a t i o n m o d e l sd e a l i n gw i t ho x y g e nc o n t r o lw e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h er e s u l ts h o w e d t h e y i e l d w a sh i g h e ri nt h em o d e lo fq u a s i a n a e r o b i c c u l t i v a t i o na f t e ra e r a t e d c u l t i v a t i o nt h a nt h a to fs t a t i o n a r yc u l t i v a t i o no ra e r a t i o nc u l t i v a t i o n ，a n dt h eb e s t t i m ef o r m a k i n g t h e q u a s i a n a e r o b i c c u l t i v a t i o nw a s a f t e r14h o u r sa e r a t e d c u i t i v a t i o i l t h e y i e l d a n dt h eu s a g ep e r c e n t a g eo fs u g a rw a s1 0 3 la n d9 2 r e s p e c t i v e l y 5 l 1 a c t i ca c i ds e p a r a t i o nw i t hi o ne x c h a n g er e s i nw a ss t u d i e d ，a n dt h em o s t s u i t a b i ei o ne x c h a n g er e s i nd 1 8 5w a ss e l e c t e d ，a n di t se x c h a n g ec a p a c i t ya n d 也e d e s o r p t i o nr a t i ow a s7 5 9 la n d8 7 r e s p e c t i v e l y g l u c o s ea n d a m i n o n i t r o g e nw e r e n o ta b s o r b e db vt h er e s i na n dt h em o s ts u i t a b l er e p r o d u c t i v ea l k a l iw a sn h 3 i 2 0 t h ep r o c e s so f t h ea b s o r p t i o n d e s o r p t i o nc o n d i t i o no f t h ed 1 8 5w a ss t u d i e da n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a tw h e np h w a s9o rs oa n dt h ea b s o r p t i o nv e l o c i t yw a s4 m l m i n ， t h ey i e l do fl 1 a c t i ca c i dw a sn m c hb e t t e ra n dr e a c h e d7 3 d u r i n gt h ed e s o r p t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fn h 3 h 2 05 0 la n dt h ev e l o c i t yo fd e s o r p t i o n2 m l m i nw e r e d e t e r m i n e d u r i d e rt h i sc o n d i t i o n 也ee l u t i o np e a ks h a p ew a sm o s tn a r r o wa n dt h e d e a kv a l u ew a sh i g h e s t ，t h ey i e l do f l - l a c t i ca c i dw a s8 7 k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sa g i l 虹l - l a c t i ca c i di o n i m p l a n t a t i o n 茎望登鍪查兰堡主堂望笙兰 1 前言 1 1 乳酸的性质 乳酸( l a c t i ca c i d ) ，学名2 - 羟基丙( 2 h y d r o x y - p r o p i o n i c ) ，其分子式为： c 2 h 5 0 c o o h ，乳酸分子中有一个不对称碳原子，故具有旋光性，l - 乳酸为右旋， d 乳酸为左旋，d l 一乳酸为外消旋，但l 乳酸盐或酯却是左旋【1 捌，乳酸相对分子 质量为9 0 0 8 ，相对密度在( 2 5 ) 约为1 2 0 6 ，结构式如图1 - 1 所示。 c 。o h h _ c 哪h i 。 c h 3 驴弋一卜一乳酸 c o p h i o h c h c h ， l 1 + ) 一乳酸 图1 1 乳酸分子结构 乳酸通常是乳酸和丙交p i l ( c 6 h 1 0 0 ，) 的混合物，无色透明或浅黄色糖浆的粘状液 体，纯净的乳酸是白色的晶状固体，乳酸易与水互溶，不容易结晶析出，乳酸浓 度达6 0 以上，已有很高的吸湿性，所以商品乳酸通常为6 0 溶液，药典级乳酸 含量为8 5 0 卜一9 0 0 ，食品级乳酸含量为8 0 以上，在6 7 1 3 3 p a 的真空条件下 反复分馏可得到高纯度的乳酸，进而获得单斜晶体的结晶乳酸。由于l - 乳酸分子 内含有羟基和羧基，所以有自动酯化的能力，乳酸越浓这种趋势越强。充分脱水 能聚合成聚乳酸，聚合l - 乳酸水解后总酸为1 2 5 ，因此，在表示乳酸浓度时， 往往用游离酸和总酸来表示。聚合乳酸中，聚合体的一般形式如图1 2 所示。 n c h 3 c h o h c o o h h o r c h - - c 0 0 r h + ( n 一1 ) h 2 0 图1 - 2 乳酸聚合体 1 2l 哥l 酸的用途及国内外研究概况 乳酸是一种古老而重要的有机酸。乳酸、乳酸盐及其衍生物广泛用于食品、 医药、饲料、化工等领域。目前国内外生产的乳酸基本上是d l 乳酸，氆于乳酸 的应用大部分集中在食品和医药行业上，人体内只有l 乳酸脱氢酶，d 乳酸不能 被入体吸收，过量摄入d 哥l 酸或d l - 乳酸会导致血液中富含d 。乳酸，从而引起疲 劳、代谢紊乱甚至酸中毒，因此，世界卫生组织提倡使用l ，乳酸作为食品添加剂 和内服药，取代目前使用的d l 一乳酸f 1 , 3 ，4 j 。 由于乳酸的酸性稳定，有助于食品的风味，在食品工业中被广泛用作酸味 剂、防腐剂和还原剂，可用于清凉饮料、糖果和糕点的生产，也可用于鱼、肉、 蔬菜的加工和保藏，与食品工业中常用的柠檬酸、磷酸、苹果酸等相比，具有很 强的竞争力。在啤酒酿造中，美国禁止使用磷酸等无机酸调节p h ，全部使用乳 l 前言 酸。日前世界上四分之一的乳酸被用来生产硬脂酰乳酯酸。硬脂酰乳酯酸钙( c s l ) 和硬酯酰乳酯钠( s s l ) 是最常用且最重要的一种食品乳化剂，广泛应用于焙烤食 品、糖果及乳化香精中。 乳酸，特别是l - 乳酸，对人、畜无害，而且具有很强的杀菌作用，其杀菌能 力几倍于柠檬酸、酒石酸、琥珀酸，可直接作为手术室、病房、实验室、车间等 场所的消毒剂。 l 乳酸、l 晋l 酸钠与葡萄糖、氨基酸等物质进行复合，配制成输液，可治疗 酸中毒及高钾血症；i 广乳酸铁、l 哥l 酸钠、l 乳酸钙是补充金属元素的良好载 体；l ，乳酸钙还可以增强抗氧化性，防止水果和蔬菜的褪色等。在医药中，l 一乳 酸钙可保持骨骼密度和强度，减少毛细血管的通透性，保持正常的神经肌肉的兴 奋性，加强大脑皮层抑制过程。l 哥l 酸钙主要用于治疗骨质疏松症、手足抽搐、 抽筋、低血钙、过敏症、痉挛和镁中毒等病症。 l 一乳酸经过聚合可生成直链或环状的聚乳酸，聚乳酸系无毒的高分子化合 物，具有生物相容性，在人体内被分解成l - 乳酸，可被人体代谢，不引起生物变 态反应，在医学中可作为缓释胶囊剂，克服现用药物药效低，瞬时浓度高等弊 病；以生物降解纤维，用于手术缝合线、筋腱、骨骼损伤的修复材料：生物植 片、胶囊壁材等；在农业中，聚乳酸在自然条件下缓慢分解，能制成可降解塑料 以代替非降解塑料，用来解决白色污染问题( 如生产绿色包装材料、农用薄膜) 6 j 。 在农药方面，可作为主要原料合成高能低毒苯氧丙酸类除草剂，替代进口产品。 此外，乳酸还可用于烟草加工中，能保持烟草的湿度，提高烟草的质量。用在皮 革制造中，能使皮革柔软、细密，从而制成高级皮革。在纺织纤维处理中，添加 一定的乳酸，可使纤维易着色、增加色泽，使触感柔软。在化妆品工业中，乳酸 也占有一席之地，乳酸是各种化妆品的主要组成成分或原料的主要来源。 目前，世界乳酸的年总生产能力为1 0 万吨左右，全球乳酸年消费为1 0 万 吨，世界年需求增长率为1 5 【6 。荷兰普拉克( e u r t a c ) 公司作为荷兰c s m 的子 公司是世界上最大的乳酸生产企业，年产能力为4 万吨，普拉克公司除了在欧洲 设r 一外，还在巴西和美国分别建立了l - 乳酸生产厂。最近普拉克公司同美国嘉吉 公司合资在美国本圭建立了年产3 4 万吨的l - 乳酸生产厂。其他较大的生产企业 还有美国的m o n s a n t o 公司、a d m 公司、a e s 、嘉吉公司和西班牙a y a s o 公司 等，与此同时，嘉吉公司又同美国陶氏化学公司成立了聚乳酸生产风险合资体， 并宣称一旦聚乳酸的成本能同聚苯乙烯材料相当时，则可将l 哥l 酸的生产扩大到 年产1 2 万吨。日本武藏野公司年生产能力为8 于吨，系亚洲最大的生产公司。 我国很早就进行乳酸发酵生产，1 9 4 4 年重庆振元化学药品厂，曾以德氏乳酸 杆菌d e l b r u e c k i i ) 发酵生产乳酸钙1 1 。8 0 年代，我国无锡、上海、天津、河南等 地曾对乳酸菌的乳酸发酵进行过研究，以大米、玉米、薯干等淀粉质为原料，采 用真菌酶制剂代替传统糠曲进行工业化生产乳酸及乳酸钙，缩短了发酵周期、提 丕堡型垫查堂堕主堂堡丝苎 一 高了产率。目前国内正在生产厂家有山西乐达生化有限公司、上海华盈高科技( 集 团) 有限公司、河南郸城金丹乳酸厂、湖北孝感光水乳酸厂、江苏盐城生物化工有 限公司等f 4 】，年产量为2 万吨左右。但大部分都为d l 混合型乳酸，l 一乳酸只占 1 0 左右 ”。据最新网上消息嘲，辽宁朝阳天缘有机酸公司采用短程蒸馏法生产药 用l 一乳酸项目年产2 0 0 0 吨l 乳酸( 列入国家火炬计划) 生产装置已建成投产，山西 古交市投资1 3 0 0 0 万元l 乳酸生产项目，年产1 万吨，一期工程5 0 0 0 吨正在建 设之中。 1 3 乳酸的生产方法 1 3 1 化学合成法 化学合成工业乳酸，以乙醛和氢氰酸为原料，将乙醛与氢氰酸作用生成乳 腈，然后用硫酸水解，用甲醇酯化，得到乳酸甲酯，精馏提纯后再用浓硫酸或浓 盐酸水解生成乳酸。1 8 6 3 年w i l c e n u s 最早研究成功，美国m o n s a n t o 公司最先用 于工业化生产，m o n s a n t o 公司目前的年产量已超过1 万吨 6 。 采用化学合成法生产的乳酸含5 0 的l - 乳酸和5 0 的d 一乳酸，即无旋光性 的d l 乳酸j 。 1 , 3 2 发酵法 目前，发酵法生产的乳酸约占总乳酸产量的一半以上，它是以玉米、小麦、 大米、红薯等淀粉为原料，将淀粉转化为糖接入菌种进行发酵。发酵法最早见于 18 4 1 年b o u t r o n 和f r e m y 的记载中，其生产方法是将麦芽或酸乳放入淀粉或牛乳 中使其自然发酵，然后用碳酸钙逐渐中和产生的乳酸。实际工业生产始于t 8 81 年 美国阿伏利公司( c h a r l e se a v e 哟。1 8 9 4 年乳酸首先用于皮革和纺织品工业上，当 时美国年产量仅为5 吨( 以纯品计) 。大规模工业化生产l 乳酸是从9 0 年代初期 开始，对l 一乳酸的研究则早在二十世纪三十年代就已经进行，大部分都采用霉菌 为菌种。1 9 3 6 年，w a r d i l l 分离获得优良l 乳酸生产菌株，对糖的转化率为6 2 一 6 7 ，并于1 9 3 8 年，采用旋转发酵罐通风液体培养转化率达7 0 一7 5 。19 9 5 年 b e m h a u e r 1 1 采用米根霉为葡萄糖为碳源，l 哥l 酸转化率达8 0 ，淀粉为碳源转化 率为4 5 - - 4 8 。1 9 8 2 年，千烟一郎等【1 ，2 】采用卡拉胶、海藻酸钠固定化粪链球菌 ( s t r e p t o c c o c c u sf a e c a l i s ) 、嗜热链球菌5 ( s t r e p t o c c o c c u ss t e a r t h e m o p h i l u s ) ，l 乳酸浓度 达4 6 ，5 酚。1 9 8 5 年，中山大柄等f 2 盈采用嗜热脂肪芽胞杆菌( b a c i l l u s s t e a r t h e m o p h i t u s ) 年h 凝结芽胞杆菌( b a c i l l u sc o a g u l a n s ) 生产l _ 乳酸，转化率达 9 2 4 。1 9 9 2 年，曹本昌等分离筛选干酪乳杆菌鼠李糖亚种江删d 6 卯f ? ? 淞c a s e i s u b s pr h a m n o s 旧菌株进行l 一乳酸发酵。1 9 9 7 年，金其荣等1 1 捌分离选育出l 一乳酸 达9 9 6 米根霉突变株，适用于米粉、玉米粉等多种原料。 1 _ 3 3 酶法生产 1 3 3 1 1 ，2 氯丙酸酶法转化 日本东京大学的本崎等人”研究了用酶法生产乳酸，他们分别从恶臭假单孢 前言 菌( p s e u d o m o n a s1 a d a ) 1 1 3 细胞中提取纯化l 一2 - 卤代酸脱卤酶( 简称为。酶) 和d l 2 卤代酸脱卤酶( 简称为d l - 酶) ，作用于底物d l 一2 氯丙酸，制得l - 乳酸或d 一乳 酸。但用此酶法生产l - 孚t , 酸工艺较为复杂，还未用于工业生产。 1 3 3 2 丙酮酸酶法转化 h u m m e l 等嘲从d 晋l 酸脱氢酶活力最高的混乱乳杆菌d s m 2 0 1 9 6 菌体中得到 d 哥l 酸脱氢酶，以无旋光性的丙酮酸为底物得到d 哥l 酸。 1 4 乳酸的合成机理 1 4 1 同型乳酸发酵 同型乳酸发酵是微生物以葡萄糖为底物通过e m p 途径降解为丙酮酸，丙酮酸 在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸，其发酵途径如图l 一3 所示。 c 6 h 1 2 0 6 竺2 c h 3 c o c 0 2 ( a d p + p o n j ) 乳酸脱氢酶 呻2 c h 3 c h o h c o o h + 2 a t p n a d h + h 图1 - 3 同型乳酸发酵途径 在同型乳酸发酵过程中，微生物利用1 m o l 葡萄糖可以生成2 m o l 乳酸，理论转 化率为1 0 0 。但由于发酵过程中微生物有其他生理活动存在，实际转化率不可能 达1 0 0 ，一般认为转化率在8 0 以上者，即视为同型发酵。 1 4 2 异型乳酸发酵 异型乳酸发酵是某些乳酸细菌利用h m p 途径，分解葡萄糖为5 磷酸核酮 糖，再经差向异构酶作用变成5 磷酸木酮糖，然后经磷酸酮解酶催化裂解反应， 生成3 一磷酸甘油醛和乙酰磷酸。磷酸酮解酶是异型乳酸酵的关键酶。乙酰磷酸迸 一步还原为乙醇，同时放出磷酸。而5 。磷酸甘油醛经e m p 途径转化为乳酸，同 时产生两分子a t p ，扣除发酵时激活葡萄糖消耗的1 分子a t p ，因此，由葡萄糖 进行异型乳酸发酵，其产能水平比同型乳酸发酵低一半。异型乳酸发酵产物除乳 酸外还有乙醇、二氧化碳和a t p ，其发酵途径如图i - 4 所示。 乙醇一乙酰磷酸 ，c o ，t 葡萄糖+ 6 磷酸葡萄糖5 一磷酸木酮糖二二一 磷酸酮解酶 上 乳酸i 一丙酮酸+ 一3 一磷酸甘油醛 图卜4 异型乳酸发酵途径 其总反应式为： c 6 h l z 0 6 + a d p + p i c h s c h o h c o o h + c h 3 c h z o h + c 0 2 + a t p 墨堡型些盔兰坠堂竺兰兰一 此过程l m o l 已糖生成l m o l 乙酸、l m o l 二氧化碳和l m o l 乳酸。乳酸对糖的 转化率只有5 0 。 1 4 3 双歧发酵途径 双歧发酵是两歧双歧杆菌f 疗如幻嘶r m 州6 脚) 发酵葡萄糖产生乳酸的条 途径。此途径中有两种酮解酶参与反应，即6 一磷酸果糖磷酸酮解酶和5 - 磷酸木酮 糖磷酸酮解酶，分别催化6 一磷酸果糖和5 - 磷酸木酮糖的裂解反应，产生乙酰磷 酸、4 一磷酸赤藓糖和3 一磷酸甘油醛、乙酰磷酸。其发酵途径如图1 - 5 所示。 r 、乙酰磷酸斗乙醇 7 ，6 坷酸果糖4 一磷酸赤藓糖 葡萄糖，可乙酰磷酸斗乙醇 1 6 一磷酸果糖 方式i i 方式i i i 方式； 而在残糖方面，方式最低，方式最高。该结果表明，在前期通风状态下，菌 体耗糖快于静止培养状态，在产酸能力方面先通风后准厌氧培养强于一直静止培 养或一直通风状态下的培养。此现象可解释为，乳酸菌属于兼性厌氧微生物，因 此并不代表整个生命周期不需要任何氧( 如菌体在繁殖阶段可能需要氧) 。同时，l 乳酸的合成是在无氧状态下完成的，由丙酮酸到l 一乳酸的转变前提是使菌体处于 缺氧状态。因此在菌体达到一定量以后，使菌体处于缺氧状态，是提高l 乳酸产 量的有效保证。 3 7 4 2 控氧时间点的确定 由上述试验可知，发酵方式i 的l 哥l 酸产量明显高于其他方式，为了确定最 佳的控氧时间点，设计了如下试验：以发酵方式i 进行发酵，只是取在不同的时 间点转入准厌氧培养，时间点分别为1 0 h 、1 l h 、1 2 h 、1 3 h 、1 4 h 、1 5 h ，最终l 乳 酸产量如图3 2 8 所示。 蒜 删 鳐 上s s 8 0 ：肌 i o“1 21 3 1 4 1 5 不同的控氧时间点( h ) 图3 2 8 不同时间点的控氧对l 一乳酸产量的影 响 4 7 卸鲫四。 一1等删址斑辞i 3 结果与讨论 由图3 2 8 可以看出，在1 8 0 r m i n 振荡条件下培养1 4 h 后转入准厌氧培养是最 佳的控氧时间点。 3 7 5 补料对l 乳酸发酵的影响 3 7 5 1 不同时期李t , d n 葡萄糖对l 乳酸发酵的影响 按照2 2 8 5 1 所述方法进行发酵并同时做一次性添加底物的对照试验，其结 果如图3 2 9 所示。 1 09 08 07 06 0 5 04 1 22 43 64 8 6 07 2 图3 - 2 9 补料对l 一乳酸发酵的影晌 1 0 0 e 卜补料发酵 9 0 8 0 毫 - - e - - 一次性添加底物 嚣运一补料发酵 5 0 薰* 一一次性添加底物 4 0 3 0 2 0 发酵时间( h ) 由图3 2 9 可以看出，不同时期的补料发酵在各个阶段的l 一乳酸合成速率大于 一次性投料发酵，且最终l 乳酸产量也高于一次性添加底物发酵( 总糖量添加相 同) 。在整个补料发酵过程中，菌体密度高于一次性投料发酵，在发酵的中后期， 菌体衰亡速度也慢于一次性投料发酵，表明菌株l a c t o b a c i l l u sa g i l i sl b l 1 d 在补 料发酵中表现出很好的发酵特性。 3 7 5 2 补料发酵中不同初始糖浓度对。乳酸产量的影响 3 高 v 日唧 k 崩 畸 1 22 4 3 64 8 6 0 彼酵时间( h ) i n 3 3 0 补料发酵中不同初始糖浓度对l - 乳酸产量的影响 按照2 2 8 ，5 2 所述方法，考察菌株l a c t o b a c i l l u sa g i l i sl b i 1 d 在补料发酵 中，不同初始糖浓度对l 一乳酸产量的影响，结果如图3 - 3 0 所示。由图3 - 3 0 可以 一euooov蚓do 5 ； 巧 帖 佰 天津科技大学硕士学位论文 看出，不同的初始糖浓度，l 一乳酸产率表现出一定的差异。其中以初糖浓度为 5 0 9 几的发酵效果最好，这有可能是添加浓度为5 0 9 l 初始糖恰好与不同阶段补添 葡萄糖的量( 补加1 8 ) 能较好的适合于菌株l a c t o b a c i l l u s 昭f 胁l b l 1 d 对葡萄糖 的利用要求，由此表现出较高的l 一乳酸产量。因此，以初始糖浓度为5 0 9 l 时进 行发酵，当发酵分别进行了2 4 、3 6 、4 8 、6 0h 后补加1 8 的葡萄糖时，能取得较 好的发酵结果。 3 8 离子交换树脂分离l 乳酸 3 8 1 离子交换树脂的选择 将阴离子树脂再生、用纯乳酸上柱，测定交换容量、解吸率。结果如表3 1 7 所示。 表3 1 7 离子交换树脂的选择 旦堑l l 一一 ! ! _ _ - - _ _ _ _ - - _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ i - 一 t ， 表3 _ 1 8 发酵液中其它成分对d 1 8 5 树脂交换容量的影响 成分 离心过滤后的发酵液( g 仰 流出液( g 几)交换容量( g 凡) _ = 一 l 一乳酸9 5 6 7 4 葡萄糖8 7 8 o 1 6 氨基氮物质0 5 6 0 5 0 0 5 4 9 一 率一竹酡弭辨记盯一跎矾舛m记韶鼯 吸一 解一 一一钙拍铝掰笪铝玛钳弛拍引的勰 删一一一一踟藿|渊嗍嗍薹|姗嗍鼢魄麟 3 结果与讨论 从表3 1 7 可以看出，树脂d 1 8 5 的交换容量与解吸率较高，均在7 0 以上， 吸附性与解i 吸性都比其它树脂强，因此选用离子树脂d 1 8 5 作为l 哥l 酸的提取分 离用树脂。 3 8 2d 1 8 5 树脂对发酵液中其它成分的吸附特性 发酵液5 0 m l 经过离心沉淀后，分离出菌体等不溶性颗粒性物质，再过d 1 8 5 离子交换树脂( 湿体积为6 0 r a l ) ，考察其对发酵液中的l 一乳酸、葡萄糖、氨基氮物 质的吸附陛。由表3 一1 8 可知，发酵液通过交换柱交换后，d 1 8 5 对发酵液中l 雩l 酸的交换容量与纯乳酸交换相比，没有显著的变化，而对葡萄糖、氨基氮物质基 本上没有交换量，以此表明d 1 8 5 对发酵液中的主要杂质吸附小，发酵液中的其 它成分不影响树脂的交换容量。 3 8 3 不同碱对乳酸回收率的影响 分别用n a o h 、n h 3 1 - 1 2 0 再生d 1 8 5 树脂，1 0 9 乳酸上柱，测定其乳酸收 率，结果如表3 - 1 9 。 表3 一1 9 不同再生碱对乳酸收率的影响 由表3 1 9 可知不同再生碱对l - - 孚l 酸收率没有太太影响：以 n - 1 3 - h 2 0 作为 再生碱可充分利用洗脱废液中的n h 4 + 作为肥料，消除乳酸工业中副产物c a s 0 4 对 环境造成的污染并降低了成本，因此，以后试验中洗脱液选用n h 3 h 2 0 。 3 8 4d 1 8 5 树脂最优吸附解吸工艺条件的确定 3 8 4 1 不同吸附流速对i 广乳酸收率的影响 离子交换速度取决于离子扩散速度，而扩散速度又与流速有关，但是流速过 大，又会使树脂的工作交换容量下降，选择不同的进样流速来考察其对l - - 孚l 酸收 率的影响，结果如图3 3 1 所示。 善 懈 掣 磐 2468 1 0 进样流速( m l , m i n ) 图3 - 3 1 不同吸附流速对l 一乳酸收率的影响 从图3 - 3 1 可以看出，上柱吸附原液随吸附流速的加快，l - 乳酸的收率递减。 筠阳弱帖柏 因此，吸附流速应以慢速为好，但过慢会延长生产周期，从而提高操作成本。从 图中可以看出，吸附流速为2 - - 4 m l m i n 时，l - 乳酸的收率较为接近，综合考 虑，吸附流速选择4 m l m m 。 3 , 8 4 2p h 值对吸附效果的影响 d 1 8 5 树脂属于弱碱性交换树脂，只有在碱性环境中才能发挥应有的交换作 用。故控制终发酵液的不同p h 值来考察其对吸附效果的影响，结果如图3 - 3 2 所 示。 享 v 褂 嘴 裂 7891 01 1 p h 值 图3 3 2p h 值对吸附效果的影响 从图3 3 2 中可以看出，p h 值在9 左右泄露率 泄露率= ( 收集流出液浓度x 流 出液体积) ( 吸附原液浓度吸附原液体积) l o o 最低，亦即吸附量最大，吸附效果 最好，p h 值在7 _ 呻之间，其泄露率递减，当p h 值大于9 时，树脂的吸附率又 开始降低，这是由弱碱性离子交换树脂的本身性质所决定的。只有当整个进样处 于碱性环境，才能使发酵液中的乳酸根离子很好的电离解析出来跟树脂中的功能 基团发生离子交换，理论上讲，乳酸根离子浓度越高，越有利于离子的交换，发 酵液中的p h 值越大，越有利于吸附，但是考虑到d 1 8 5 树脂本身是弱碱性，其在 强碱性环境中，不利于功能基团的稳定，不能使树脂上的离子基团发挥有效的交 换作用，从而使整个吸附性能降低旧”】。 3 8 ，4 3 不同氨水流速对l 乳酸收率的影响 3 b v 倒 避 斑 赢 i 1 02 03 04 05 0 8 07 0b 09 0 i 0 0 氨水