（食品科学专业论文）通过糖基化反应改善花生分离蛋白和大豆分离蛋白乳化性.pdf

摘要 捅要 国内外的研究表明，通过糖基化反应能够有效地改善蛋白质的功能特性。本论文主 要研究糖基化反应对于花生分离蛋白和大豆分离蛋白乳化性的影响，试图推动对于花生 粕和大豆粕资源的进一步开发和利用，扩大花生蛋白和大豆蛋白的应用范围。论文具有 良好的学术意义和实际应用价值。 本论文首先对高温粕和低温粕中提取的分离蛋白的结构和性质进行了比较研究。采 用碱溶酸沉法从高温粕和低温粕中制备分离蛋白，分别测定它们的疏水性、氮溶解性、 乳化活性、乳化稳定性和分子量分布。结果发现，与低温粕中提取的分离蛋白相比，高 温粕中提取的分离蛋白的疏水性高，氮溶解性低，乳化活性和乳化稳定性好。电泳 ( s d s p a g e ) 和h p l c 液相结果显示，高温分离蛋白的分子量分布发生明显改变。 论文详细研究了糖基化反应对于花生分离蛋白和大豆分离蛋白乳化性的影响。将来 自于高温粕和低温粕的花生分离蛋白和大豆分离蛋白分别与葡萄糖、麦芽糖在不同反应 温度( 6 0 、8 0 c ) ，不同蛋白、糖比例的情况下进行糖基化反应，通过乳化活性、乳 化稳定性等指标反应糖基化反应对于分离蛋白性质的影响。研究结果显示，糖基化反应 可以显著提高分离蛋白的乳化活性，葡萄糖的反应性好于麦芽糖，反应在6 0 ，蛋白和 糖比例为1 ：2 时，能够得到更好的乳化效果。将各种变性蛋白质与常用大豆分离蛋白 以及酪蛋白酸钠的乳化性进行比较，结果显示，糖基化反应产物的乳化性好于几种工业 用的大豆蛋白，略低于酪蛋白酸纳的乳化性，这进一步证明改性后的花生蛋白和大豆蛋 白具有良好的应用前景。 在前面研究的基础之上，进一步讨论糖基化改性后蛋白结构变化与功能之间的关 系，结果显示，在一定范围内接枝度的增加会提高蛋白乳化性，但并不是接枝度越高乳 化性越好。蛋白的溶解性、疏水性和蛋白的乳化性之间存在相关性，在一定程度上，溶 解性的提高会有利于乳化性的改善，但是蛋白的乳化性质还受到疏水性和蛋白结构等多 种因素的影响。 关键词：花生分离蛋白，大豆分离蛋白，糖基化反应，乳化活性，乳化稳定性 a b s t r a c t a b s t r a c t i tw a sr e p o r t e dt h a tt h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fp r o t e i nc o u l db em o d i f i e db yg l y c a t i o n r e a c t i o n i no r d e rt of i n dan e wu s eo ft h ep e a n u t s o y b e a nc a k e s ，t h ee f f e c to fg l y c a t i o n r e a c t i o no nt h ee m u l s i f i c a t i o no fp e a n u tp r o t e i ni s o l a t e sa n ds o y b e a np r o t e i ni s o l a t e sw e r e s t u d i e di nt h i st h e s i s f i r s t ，t h ep r o p e r t i e so ft h ep r o t e i ni s o l a t e sf r o md i f f e r e n ts o u r c e sw e r er e s e a r c h e d p r o t e i ni s o l a t e sw e r ep r e p a r e df r o mp e a n u t s o y b e a nc a k e sb yr e s o l v i n ga n dp r e c i p i t a t i n gi n a l k a l i n ea n da c e t o u sd i s t i l l e dw a t e r t h eh y d r o p h o b i c i t y , n i t r o g e ns o l u b i l i t y , e m u l s i f y i n g a c t i v i t ya n de m u l s i o ns t a b i l i t yw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l to fa n a l y s i ss h o w e dt h a tp r o t e i n i s o l a t ef r o mh i g h t e m p e r a t u r ep r e t r e a t r n e n tp e a n u f f s o y b e a nc a k eh a dl o w e rn i t r o g e ns o l u b i l i t y , a n dh i g h e rh y d r o p h o b i c i t y , e m u l s i f y i n ga c t i v i t ya n de m u l s i o ns t a b i l i t yc o m p a r e d 、 ，i t l l l o w - t e m p e r a t u r ep r e t r e a t m e n tp r o t e i n i s o l a t e s t h e c h a n g eo fm o l e c u l a rw e i g h t w a s d e m o n s t r a t e db ys d s p a g ea n dh p l c t h e n ，t h ee f f e c t so fg l y c a t i o nr e a c t i o no nt h ee m u l s i f i c a t i o no fp e a n u t s o y b e a np r o t e i n i s o l a t e sw e r ed i s c u s s e di nd e t a i l t h ep r o t e i ni s o l a t e sr e a c t e dw i t hg l u c o s ea n dm a l t o s ei n d i f f e r e n th e a t i n gt e m p e r a t u r e s ，d i f f e r e n tr a t i oo fp r o t e i na n ds u g a r , a n de m u l s i o na c t i v i t y , e m u l s i o ns t a b i l i t yw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg l y c a t e dp r o t e i nh a sah i g h e r e m u l s i o na c t i v i t ya n de m u l s i o ns t a b i l i t yc o m p a r e dw i t hr a wp e a n u t s o y b e a np r o t e i n t h e r e a c t i v i t yo fg l u c o s ew a sh i g h e rt h a nm a l t o s e ab e t t e re m u l s i o nc a p a b i l i t i e sw e r eo b t a i n e d w h e nt h er a t i oo fp r o t e i na n ds u g a ri s1 ：2 ，t h et e m p e r a t u r ei s6 0 c t h ee m u l s i f i c a t i o no f g l y c a t e ds o y b e a n p e a n u ti s o l a t e sw e r ec o m p a r e dw i t ht h a to f s o m ec o m m e r c i a ls o y b e a n p r o t e i n sa n ds o d i u mc a s e i n a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee m u l s i f y i n ga c t i v i t ya n de m u l s i o n s t a b i l i t yo fg l y c a t e dp r o t e i nw a sh i g h e rt h a nt h a to f c o m m e r c i a ls o y b e a np r o t e i n sa n dl o w e r t h a nt h a to fs o d i u mc a s e i n a t e o nt h eb a s i so fw o r kb e f o r e ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np r o t e i nf u n c t i o n a lp r o p e r t i e sa n d s t r u c t u r e sw e r es t u d i e d t h ee m u l s i o na c t i v i t yi n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fa t t a c h i n g d e g r e e ，b u ti tw a sn o tt h eh i g h e rt h eb e t t e r t h e r ew a sa l s oar e l a t i o n s h i pb e t w e e ne m u l s i o n c a p a b i l i t i e sa n ds o l u b i l i t y , h y d r o p h o b i c i t y k e yw o r d s ：p e a n u tp r o t e i ni s o l a t e ，s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e ，g l y c a t i o nr e a c t i o n ，e m u l s i f y i n g a c t i v i t y ，e m u l s i o ns t a b i l i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 删 日期： 关于论文使用授权的说明 越私悃 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据夕孝 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名塑闲i - l 导师签名：一呈一驺查一日 期： i 第一章绪论 第一章绪论 1 1 立题背景扣意义 从现代营养学和国际食品业的发展潮流看，植物蛋白将成为2 1 世纪促进人类健康的 主流食品。在我国，人民的温饱问题虽然已经得到解决，但我国居民的优质蛋白质摄入 与发达国家差距较大，这严重制约了我国居民人口身体素质的提高【1 1 。因此，开发植物 蛋白系列食品符合我国国情和长期发展战略。 花生蛋白和大豆蛋白在世界植物蛋白资源中占据重要位置，其中花生蛋白占蛋白总 量的1 1 。我国花生产量居世界首位，根据2 0 0 6 年美国农业部统计的数据【2 j ，我国2 0 0 6 年花生总产量1 4 7 0 万吨，占世界总产量的4 3 8 。 2 0 0 6 年我国的花生产量达到了1 4 6 1 万吨，其中，做榨油用占5 0 左右，做食用占3 0 左右，外贸出口占8 左右【3 】。在榨油过程中，常采用高温压榨和低温浸出两种方法，分 别得到的是高温花生粕和低温花生粕。2 0 0 6 年花生粕的产量达到了2 4 5 万吨。就我国目 前的状况来看，对于花生饼粕的利用大部分作为饲料、肥料，这对于花生粕资源无疑是 一种浪费，如何深度利用这些丰富的蛋白质资源，发挥其良好的优势，成为摆在科研工 作者面前迫切需要解决的问题。 相对于花生蛋白而言，我国的大豆粕的利用状况相对稍好，国内目前也能够生产大 豆浓缩蛋白和大豆分离蛋白，这些大豆蛋白多用在肉制品加工生产中【4 】。由于技术和设 备原因，这类大豆分离蛋白产品主要体现出凝胶特性，而能体现大豆分离蛋白乳化性、 持水性、溶解性和发泡性的产品还不多。因此，大豆分离蛋白在食品加工中的应用就受 到很大限制，如何提高大豆蛋白的功能性质，拓宽大豆蛋白在食品中的应用，发挥其良 好的优势，成为摆在科研工作者面前迫切需要解决的问题。 花生蛋白和大豆蛋白属于具备两亲结构的高分子蛋白，具有独特的表面活性、溶解 性、乳化性和起泡性。但在食品的复杂体系中，花生蛋白和大豆蛋白的各种功能性质往 往不稳定，因为蛋白质遇热及有机溶剂等因素，功能性质往往会受到影响，严重制约了 其在食品中的应用。如何改变花生蛋白和大豆蛋白的功能特性，使它能够在食品中大范 围应用，成为一个研究的重要方面。所以，若想加宽花生蛋白和大豆蛋白在食品行业中 的应用，就必须对花生蛋白和大豆蛋白进行改性，使其功能特性达到工业化生产的要求。 本课题主要探讨不同来源花生粕中花生分离蛋白的结构和功能性质差别，利用糖基 化反应改善花生分离蛋白和大豆分离蛋白的乳化性，为促进花生粕和大豆粕的应用，并 为植物蛋白结构改良和性质提高提供一种思路。 本课题来源于十一五“8 6 3 ”项目“植物源蛋白质性质的生物技术改良” ( 2 0 0 6 a a l 0 2 3 2 5 ) 以及益海嘉里集团食品技术研究所“植物蛋白质性质研究”项目支 持。 江南大学硕士学位论文 1 2 国内外研究进展 蛋白质的改性实质是蛋白质基团的修饰，通过改变蛋白质的功能基团、键合作用、 空间结构和聚合形式，从而对其加工功能特性产生重大影响，获得原来所不具备的独特 功能。任何功能性的变化都是蛋白质结构改变的结果，植物蛋白的功能特性与植物蛋白 的分子量分布、氨基酸组成、亚基的大小和组成、亲水和疏水性有密切关系【5 j 。所以， 一切能改变蛋白质氨基酸组成、分子大小和形态结构的因素必将影响其功能特性。 1 2 1 花生蛋白和大豆蛋白基本性质 花生蛋白质中约含有1 0 的水溶性蛋白质( 即清蛋白) ，其余9 0 约为碱溶性蛋白， 它是由花生球蛋白和伴花生球蛋白组成【6 】。清蛋白与其他类别蛋白质相比，对热稳定性 较差，容易发生热变性和凝固现象。在6 0 。c 时，清蛋白即可变性且变性速度较快，超过 其他类蛋白质。球蛋白是花生蛋白质的主要组成成分，受热时也容易发生变性作用和凝 固现象，但比清蛋白难得多。 花生蛋白质的等电点是4 5 左右，花生蛋白质溶于水、1 0 氯化钠、1 0 氯化钾溶液， 在p h 7 5 的稀氢氧化钠溶液中溶解度亦很大【7 】。利用不同饱和度的硫酸铵溶液，可使花生 球蛋白和伴花生球蛋白分开。 花生蛋白的营养价值与动物蛋白质接近，蛋白质含量比牛奶、猪肉、鸡蛋都高，且 胆固醇含量低。其营养价值在植物蛋白质中仅次于大豆蛋白，如表1 1 所剥8 。 表1 - 1 花生蛋白的营养价值 t a b 1t h en u t r i t i o no fp e a n u tp r o t e i n 花生蛋白中含有大量人体必需氨基酸，谷氨酸和天门冬氨酸含量较高，赖氨酸含量 比大米、面粉、玉米高，其有效利用率高达9 8 t 9 1 。在人体必需氨基酸中，花生蛋白除 蛋氨酸含量较低外，赖氨酸、色氨酸和苏氨酸含量接近世界粮农组织( f a o ) 规定标准， 苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸含量超过f a o 规定标准。因此，除蛋氨酸需稍加 补充外，其余可基本满足人体需要。另外花生蛋白质中棉籽糖和水苏糖含量较低，因而 食用花生及其蛋白制品不会产生腹胀嗝气的现象博j 。 2 第一章绪论 表1 2 花生蛋白氨基酸组成( ) t a b 1 2t h ea m i n oa c i dc o m p o n e n to fp e a n u tp r o t e i n ( ) 大豆蛋白也是一种重要的植物蛋白产品，资源丰富，品质优良，蛋白质含量占干基 的4 0 以上，其蛋白质含量接近动物蛋白，蛋白质组成中人体必需的8 种氨基酸较为平 衡，尤以赖氨酸最高，同时还含有大量对人体健康有益的必需脂肪酸、磷脂和丰富的钙、 磷等矿物质且不含胆固醇，具有较高的营养价值【l 们。随着研究以及食品工业的发展，国 内外大豆蛋白已经开发出了很多制品，如浓缩大豆蛋白、分离大豆蛋白、组织化大豆蛋 白等，这些大豆蛋白制品蛋白质普遍含量5 0 以上，其中大豆分离蛋白的蛋白质含量更 高达9 0 左右，而且具有许多功能特性，如乳化性、持水性、持油性、起泡性等，在肉 类制品、饮料、冰淇淋、焙烤食品及各种保健食品中具有一定的应用。 国内大豆蛋白资源达到4 0 0 多万吨，绝大部分用于饲料、酿造、水解蛋白等附加值 相对比较低的场合，而附加值略高的食品蛋白类配料功能产品，目前仅仅生产浓缩蛋白 和分离蛋白，主要用于肉制品工业，产能不超过6 万吨。其中的大豆分离蛋白产品主要 是应用于肉制品的凝胶型，缺少应用于乳制品、面制品的乳化、分散等类型。 大豆蛋白尽管具有价格便宜，也具有一定的功能性质，但是各种性质例如乳化性、 胶凝性、起泡性等与动物源如酪蛋白、肌纤维蛋白、蛋清蛋白等相比，功能性质仍然有 相当大的差距【1 2 1 。从蛋白质的成分来看，大豆蛋白主要由1 1 s ( 大豆球蛋白) 和7 s ( b 伴 大豆球蛋白) 构成。其中，1 1 s 含量可达大豆总蛋白含量的4 3 ，且具有较高半胱氨酸含 量，因而在功能特性上不同于7 s 组分，如具有优良的凝胶性、起泡性和泡沫稳定性。 目前工业上生产的大豆分离蛋白是i i s 和7 s 球蛋白的混合物，1 1 s 和7 s 各自的功能特 性得不到充分利用，功能性质不突出，并且当原料中1 1 s 和7 s 球蛋白的比例发生变化 时，产品的性能就会出现不稳定，制约了大豆分离蛋白在食品加工中的广泛应用。 由于大豆具有良好的价格优势以及潜在的功能特征，对于大豆蛋白结构改造以及进一步 提高功能性质的研究一直是国内外研究的热点。 目前蛋白改造的方法主要有：物理改性( 热处理、超高静压处理等) ，化学改性( 糖基 化、磷酸化、乙酰化、琥珀酰化等) ，酶法改性和生物工程改性。其中，糖基化反应是 食品加工和保藏的一种常见反应，通过糖基化反应制备蛋白和糖的衍生物，发现蛋白的 3 江南大学硕士学位论文 糖基化衍生物有很好的乳化性、泡沫性和稳定性陋15 1 。因此，利用糖基化反应来改善 蛋白的功能特性越来越受到人们的关注。 1 2 2 通过糖基化反应对蛋白质进行改造的方法 m a i l l a r d 反应是氨基化合物和还原糖之间的反应，他是法国著名科学家l cm a i l l a r d 于1 9 1 2 年发现的。m a i l l a r d 反应广泛存在于食品加工和食品储藏过程中，是食品香味产 生的重要来源之一【l 刚。 m a i l l a r d 反应也称糖基化反应，它是醛、酮、还原糖以及脂肪氧化生成的羰基化合 物与胺类、氨基酸、肽、蛋白质甚至氨水中的氨基之间的反应。该反应包括缩合、降解、 裂解、聚合等一系列的反应【r 7 1 。糖基化反应的第一步是氨基糖的缩合反应，形成的氨基 糖经阿马杜里和海因氏重排得到中间产物，可产生糖醛类和还原酮类或脱氢还原酮类， 这些酮类可经环化和裂解形成各种化合物。其中，酮类和氨基酸的反应n s t r e c k e r 降解 反应，生成的醛类和氨基酮是杂环化合物的重要来源。醛类的自身缩合以及缩合物与氨 基酸的作用成为醛亚胺或酮亚胺，最后产生含氮的高分子共聚物( 类黑素) 。 糖基化改性是化学改性的一种类型【l 8 1 ， 是蛋白质的氨基酸与多羟基化合物， 如 单糖或低聚糖在弱碱性环境中发生美拉德反应，生成糖基化蛋白。糖基化蛋白在功能特 性上比原蛋白有很大的改变。 研究表明，早期的糖基化反应产物在乳化性19 1 、起泡性【2 0 】、溶解性【2 1 1 、热稳定性【2 2 】 等特性上都有不同程度的提高。后期的糖基化反应产物在抗氧化2 3 1 、抗癌症【冽等特性上 有较明显的改善。 1 2 3 制备糖基化蛋白的条件 上个世纪九十年代初日本、欧美的几个研究小组开始研究糖蛋白质共价复合物。 糖蛋白共价复合物的制备主要有两种途径【2 5 1 ，一种是干热法制备多糖蛋白共价复合物， 一种是湿热法制备单糖或双糖蛋白质共价复合物。 通过干热法制备多糖一蛋白共价复合物的条件很苛刻，要求蛋白质多糖的共价复合 物都是通过控制的自发的糖基化反应来实现【26 | 。反应是在低于蛋白质的变性温度条件下 进行的。并且，反应时还需控制反应体系的水分活度，使得在较低的水分活度下进行键 合。通过湿热法制备单糖或双糖蛋白共价复合物，条件相对简单，反应时间大大减少， 但由于单糖的性质不如多糖那么突出，对蛋白功能性质的改变要小很多。 多糖的糖基化反应速度很慢，酪蛋白是所有被研究的蛋白质中反应速度最快的，达 到理想的反应程度大约需要2 4 h ，其它蛋白质实现适度的糖基化反应通常需要2 3 周，折 叠状态或是刚性蛋白与多糖反应需要的时间则更长匹7 1 。 蛋白质一多糖共价复合物的制备包括以下几个步骤【2 s j ：( 1 ) 将蛋白质和多糖按一定的 比例溶解在选定p h 值的缓冲溶液里；( 2 ) 分散均匀后进行冷冻干燥；( 3 ) 冷冻干燥好的样 品在一定的温度( 一般5 0 , - - 一6 0 c ) 和相对湿度( 一般用饱和k b r 维持在7 9 相对湿度) 下反 应。由于反应条件苛刻，无须特殊的处理以终止反应，一般来说，降低温度就足以抑制 这种自发的糖基化反应的进行。 4 第一章绪论 蛋白质- 单糖或双糖共价复合物的制备包括以下几个步骤：( 1 ) 将蛋白质和单糖按一 定的比例溶解在选定p h 值的缓冲溶液里；( 2 ) 分散均匀后进行加热，加热温度控制在蛋 白变性温度以下( 3 ) 冷水冷却终止反应的进行。 反应的温度、相对湿度、p h 、糖和蛋白的比例等因素都能够直接影响反应的进程和 反应后蛋白的功能特性，因此，反应过程中要控制好条件，摸索最佳的实验方案。 1 2 4 通过糖基化反应改善蛋白质的溶解性 溶解性是蛋白质可应用性的一个很重要的指标，它影响着蛋白质的凝胶作用、乳化 作用和起泡作用等【2 9 1 。加热处理时，大多数蛋白质的溶解度是显著地和不可逆地降低。 p h 对球蛋白影响较大，在p h 4 2 。4 6 时，球蛋白几乎不溶解。共存盐类对溶解度也有影响， 如有氯化钠和氯化钙存在时，即使在等电点范围内，p h 4 2 4 6 也能溶解。另一方面，一 些盐类( 如石膏粉) 能降低蛋白溶解度，可作沉淀剂。 在食品生产过程中，通常是酸性条件，还要经过加热处理，因此对蛋白的溶解性和 热稳定性提出了更高的要求。如何使蛋白能在酸性条件和加热过程中仍然保持很高的溶 解性，成为蛋白改性研究的重点。 研究发现，多糖与蛋白质通过糖基化反应形成的共价复合物，由于多糖链的引入， 多羟基的亲水特性可使得整个分子的溶解性能显著提高。实验表明，在6 0 。c ，7 9 的相 对湿度条件下，随着反应时间的延长，部分水解的面筋蛋白麦芽糊精复合物的溶解度 逐渐增加，而且反应3 周后的复合物在p h 2 1 2 的范围内始终保持良好的溶解性【3 。这种 性质是大豆分离蛋白与麦芽糊精的简单混合物所不具备的。 大豆蛋白淀粉共价复合物也表现出同样的特性。周家华等人的研究发现，大豆蛋 白淀粉共价复合物，在广泛的p h 范围内，溶解性都有较大的提高【3 1 1 。在p h 6 时，其它 功能特性，如乳化性质、起泡性、起泡稳定性和热稳定性都有较大的提高，这有助于扩 大大豆蛋白在食品中的应用。并且，在糖基化反应过程中还发现，糖基的分子量越大， 反应的速度越慢，反应进行的程度越低。分子量太小，反应速度快，反应量大，但是总 体物化性质改善不大，相反，过量的反应消耗掉宝贵的人体必需氨基酸一赖氨酸。因此， 反应过程中，要控制好反应的进行程度。 s a e k i 等人将鱼肌原纤维蛋白与葡萄糖在4 0 的条件下反应1 2 d x 时1 3 2 | ，只有当1 7 的 赖氨酸参加到反应时，它的溶解性才得到显著改善。如果采用3 5 的反应温度，达到相 同的反应程度则需要更长的反应时剐3 3 】。还发现核糖的反应性要明显高于葡萄糖，达到 相同的反应程度核糖只需要2 小时。s a t o 等人还将鱼肌原纤维蛋白与海藻低聚糖反应，发 现只有低于1 0 的赖氨酸参加反应时，它的溶解性才得到改善1 3 4 1 。 g r o u b e t 将b 酪蛋白与各种不同分子量的还原糖【35 | ，在6 0 。c 的条件下反应，乳糖、葡 萄糖和半乳糖与酪蛋白反应后的接枝度分别从2 0 到3 0 ，核糖和树胶醛糖与酪蛋白反 应后的接枝度分别从4 0 到7 0 。糖基化产物在p h 4 5 6 0 的溶解性都得到不同程度的改 善。 5 江南大学硕十学位论文 1 2 5 通过糖基化反应改善蛋白质的乳化性 蛋白质是具有两亲结构的有乳化能力的生物大分子，作为一种符合要求的天然食品 添加剂有着广泛的应用领域。但一般来说，由于大分子吸附的特点，蛋白质的表面活性 远远低于小分子乳化剂，即乳化能力远远低于小分子乳化剂，而且蛋白质的乳化性能对 体系环境变化非常敏感。提高蛋白质的乳化能力、乳化稳定性以及适用范围一直是食品 科学领域的一个研究重点。 大量的实验结果说明，蛋白质一糖共价复合物以共价键结合，体系温度、离子强度 的改变对这种结合没有太大的影响，复合物能在高离子强度、较高及较低p h 值、高温条 件下保持较高的稳定性，并具有理想的乳化稳定性1 3 引。 实验还证明，复合物的乳化性能不仅远远高于原来的蛋白质，而且高于小分子乳化 剂。k a t o 发现卵清蛋白葡聚糖共价复合物能在高离子强度和高温条件下仍具有理想的乳 化活性和乳化稳定性【3 7 j 。并且，合成的复合物的乳化性能高于小分子乳化剂。在高温情 况下仍能保持很好的稳定性，这样就保证了乳化体系在杀菌和其它高温处理过程中不被 破坏。 大豆分离蛋白葡萄糖通过糖基化反应，也极大地改善了蛋白的乳化性【3 引。随着干 热保存时间的延长，糖基化大豆分离蛋白的乳化活性先上升后降低。糖基化大豆分离蛋 白在p h 3 9 范围内乳化活性较高，约是大豆分离蛋白的两倍。糖基化大豆分离蛋白在酸 性和高盐浓度体系中皆显示很好的乳化特性。 n a k a m u r a 3 9 】等人合成的溶菌酶葡聚糖的共价复合物也具有很好的乳化特性，并且 提高了溶菌酶的抗菌范围。同时还发现，蛋白质多糖共价复合物的乳化性能与多糖的 链长以及蛋白质分子上结合的多糖分子数有关。具有理想乳化性能的蛋白质多糖复合 物，应有足够的多糖结合以提高复合物的溶解度和提供空间位阻，同时应保持复合物中 蛋白质分子侧链具有一定的疏水性，以便复合物能快速且紧密地吸附在油水界面上。 n d i f t i s 等【4 0 】人合成的大豆蛋白羧甲基纤维素的共价复合物，也极大地改善了大豆 蛋白的乳化性。并且发现多糖链长会影响复合物的热稳定性。当蛋白分子上共价结合的 多糖链长超过一定的范围，蛋白质受热展开时，长链多糖的位阻效应就会阻止展开的蛋 白分子聚集，从而使得复合物在高温下保持较好的乳化性能。多糖链太短，位阻效应就 不明显，也就不能有效地提高复合物的热稳定性。大豆分离蛋白葡聚糖共价复合物也 表现出很好的乳化特性【4 1 1 ，还发现蛋白质多糖共价复合物中两种大分子以共价键结合， 体系温度、p h 值、离子强度的改变对这种结合没有太大的影响。因此，复合物能在高离 子强度、较高及较低p h 值、高温条件下保持较高的稳定性，并具有理想的乳化活性和乳 化稳定性，这就为蛋白在食品中的应用提供了必要条件。 蛋白与单糖的反应性比多糖更强，但性状的改善往往很小。k a t o 等人是最早研究蛋 白与还原性糖反应的【4 2 - 4 4 ，m o r e n o 将酪蛋白与乳糖在4 0 c 条件下反应，乳化性得到明显 改善。并且，反应5 至1 j 9 天的产物乳化性要好于反应2 天的产物乳化性，这表明乳化性的 改善可能与接枝度的大小有关【4 引。 6 第一章绪论 1 3 课题的研究内容 1 3 1 课题的目的 2 0 0 6 年我国的花生粕产量达到了2 4 5 万吨，大豆粕产量超过4 0 0 万吨，而蛋白类功能 产品，产能不超过6 万吨。上述油j l 旨 d i a 工副产品大部分作为饲料、肥料以及酿造用原料， 这对于花生粕和大豆粕资源无疑是一种浪费。 目前的研究工作中，对于花生蛋白的研究比较少，特别是高温粕中的蛋白质的性质、 功能以及应用研究迄今尚未发现文献报道。探讨不同来源的花生粕中的蛋白质的性质， 对于深度开发和利用这些丰富的蛋白质资源，增加花生粕的利用价值，提高花生蛋白的 应用范围，无疑具有良好的学术价值和应用意义。 同时，现有的研究也显示，大豆蛋白尽管具有价格便宜，也具有一定的功能性质， 但是各种性质例如乳化性、胶凝性、起泡性等与动物源如酪蛋白、肌纤维蛋白、蛋清蛋 白等相比，功能性质仍然有相当大的差距【4 酬。由于大豆具有良好的价格优势以及潜在的 功能特征，对于大豆蛋白结构改造以及进一步提高功能性质的研究一直是国内外研究的 热点。 本课题研究不同前期加工包括高温粕和低温粕中的分离蛋白的提取、结构以及性 质，旨在为高温粕的应用提供基础数据。并针对花生蛋白和大豆蛋白加工性质不够良好 的特点，采用糖基化反应对花生蛋白和大豆蛋白进行结构改造和性质改良，为花生蛋白 和大豆蛋白的进一步利用探讨新的途径。课题对于深度开发和利用花生粕和大豆粕资 源，扩大花生蛋白和大豆蛋白的应用范围，具有重要的学术意义和实际应用价值。 1 3 2 课题的研究内容 1 分别从高温粕和低温粕中提取花生分离蛋白和大豆分离蛋白，比较低温粕、高温 粕，以及分离蛋白的成分组成和功能性质的差异。 2 通过糖基化反应对花生分离蛋白和大豆分离蛋白的乳化性进行改造。分别采用不 同的还原糖，不同的反应时间，不同的反应温度，不同的蛋白和还原糖比例，来探讨糖 基化反应对乳化性的影响。 3 通过测定糖基化反应后部分结构特征的变动，包括接枝度的变化，疏水性的变化， 溶解性的变化，分子量的变化，初步探讨糖基化反应与其产物功能特性之间的关系。 7 江南大学硕士学位论文 第二章从高温粕和低温粕中提取的花生分离蛋白和大豆分离蛋 白的性质比较 2 1 引言 目前国内的花生油多采用热榨工艺，高温粕大多用作饲料，造成大量蛋白资源的浪 引4 7 】。大豆油的生产多采用低温浸出和高温浸出，低温浸出得到的低温粕价钱相对较高， 市场需求量大，高温浸出得到的高温粕往往用作饲料，没有得到充分的利用，造成了大 量的蛋白浪费，研究显示，高温粕也具有良好的功能性质，需要进一步开发和利用【4 8 1 。 本文主要对高温粕和低温粕中提取的分离蛋白的结构和性质进行了比较研究，为高 温粕的进一步利用提供依据。 2 2 实验材料与设备 2 2 1 主要材料与试剂 高温花生粕：莱阳鲁花集团赠送；低温花生粕：湖南金意饲料油脂公司赠送；高温 大豆粕：益海粮油赠送；低温大豆粕：大连温达赠送；其余试剂从国药集团化学试剂有 限公司购买，除了硫酸钾为化学纯外，其余均为分析纯。 2 2 2 主要仪器 d e l t a3 2 0 型酸度计，梅特勒托利多仪器上海有限公司；h h 4 数显恒温水浴锅， 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；机械搅拌器，广州仪科实验仪器有限公司；t d l 5 低 速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；t g l 1 6 b 高速离心机，上海安亭科学仪器厂； j z 7 1 1 4 型粉碎机，上海朝阳微电机厂；p o w e r p a cb a s i c ，美国b i o r a d 公司；a b 2 0 4 - n 型分析天平，梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司；磁力搅拌器，广州仪科实验仪器 有限公司；l g j 1 0 型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；u v - 2 8 0 0 h 型紫外可见分光 光度计，尤尼柯( 上海) 仪器有限公司；高速乳化均质机，广州仪科实验仪器有限公司。 2 3 试验方法 2 3 1 分离蛋白的提取 采用一次碱溶酸沉法从低温粕中提取分离蛋白：参考n d i f t i s a 9 】等人的实验方法， 将低温粕用6 0 的温水浸泡( 料液比1 ：2 0 ) ，匀浆处理，用p i l l 0 的稀碱溶液浸提2 小时( 6 0 ) ，再离心1 0 分钟( 3 0 0 0r m i n ) 去除不溶物。调节上清液到p h 4 5 ，离心 l o 分钟( 3 0 0 0r m i n ) 取沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，得到低温分离蛋白。 采用两次碱溶酸沉法从高温粕中提取分离蛋白：第一次碱溶酸沉的操作方法和从低 温粕中提取分离蛋白的方法相同。第二次碱溶酸沉方法是，将得到的沉淀物复溶( 料液 比1 ：8 ) ，调节到p i l l 0 ，再离心1 0 分钟( 3 0 0 0r m i n ) ，去除不溶物，调节上清液到p h 4 5 ， 8 第二章从高温粕和低温粕中提取的花生分离蛋白和火豆分离蛋白的性质比较 离心1 0 分钟( 3 0 0 0r m i n ) ，取沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，得到高温分离蛋白。 提取率= 分离蛋白中的蛋白含量原料中的蛋白总含量x 1 0 0 2 3 2 组成成分的测定 蛋白质含量测定采用微量凯氏定氮法。 脂肪含量测定采用g b t5 0 0 9 6 2 0 0 3 3 食品中脂肪的测定方法。 灰分含量测定采用g b t1 4 7 7 0 1 9 9 3 5 食品中灰分的测定方法。 水分含量的测定采用恒温干燥法。 2 3 3 羰基含量的测定 参考d p a r k 等人测定羰基含量的方法【5 0 1 ，在2 0 m l 的聚乙烯离心管中，o 3 5 m l 蛋白 质溶液与l m l 的含有1 0 m m o l l2 ，4 二硝基苯肼的2m o l lh c l 混合，在3 0 条件下水 浴保温2 小时。另取0 3 5 m l 蛋白质溶液与l m l 的不含有1 0 m m o l l 2 ，4 二硝基苯肼的 2 m o l lh c l 混合，在3 0 条件下水浴保温2 d , 时，作为空白对照。然后在每个离心管中 加入0 4 5 m l4 0 的三氯乙酸( t c a ) ，剧烈震荡，摇均匀后静置2 0 分钟，离心5 分钟( 3 0 0 0 r m i n ) 。弃去上清液，用1 5 m l 的乙醇乙酸乙酯溶液( 1 ：1 ，v ) 洗涤沉淀3 次，蛋白 质悬浮于1 0 m l 6 m o l l 盐酸胍溶液中，在3 7 条件下水浴保温2 0 分钟，每5 分钟剧烈振 摇一次。以空白为对照在3 6 7 n m 处作校正，以2 2 0 0 0m _ 1 c m _ 1 消光系数计算每毫克蛋白 质羰基衍生物的摩尔数。 2 3 4s d s - p a g e 凝胶电泳 借鉴w l e r t i t t i k u l 等人的实验方法【5 ，通过s d s p a g e 凝胶电泳的方法测定不同 反应时间的反应液在分子量分布上的差异。电泳仪为p o w e r p a cb a s i c ，采用5 的浓缩 胶和1 0 的分离胶，样品溶解液中含有b 巯基乙醇，浓缩胶电流控制在1 0 m a ，分离胶 电流控制在2 0 m a 。分离完成后，用0 2 的考马斯亮兰染色液染色两小时，最后用含 4 0 甲醇和1 0 醋酸的脱色液脱色1 0 小时。 2 3 5 氮溶解度指数测定 参考k g o v i n d a r a j u 等人测定氮溶解度指数的实验方法【5 2 】，称取0 5 克分离蛋白样 品，溶解在4 0 m l 蒸馏水中，调节到p h 8 0 ，搅拌1 小时使样品溶解，将溶液转移到5 0 m l 容量瓶中，稀释至刻度。静置2 分钟后，将上层液倒入离心管中离心1 5 分钟( 4 0 0 0r m i n ) 。 取上清液1 0 m l ，采用凯氏定氮法测定氮含量。 可溶性氮含量= 上清液中氮的含量样品中总的氮含量。 2 3 6 乳化性的测定 借鉴j u a nc 等人的实验方法【5 3 1 ，分别称取高温分离蛋白和低温分离蛋白，溶解到 2 0 0m l 蒸馏水中，定容到2 5 0m l ，配成蛋白浓度1 的溶液。取1 0m l 蛋白溶液与2m l 大豆油混合，放入4 0m l 离心管中。在机械乳化机下乳化2 分钟( 1 3 5 0 0 r m i n ) ，将乳 9 江南大学硕士学位论文 化液迅速倒入2 5m l 小烧杯中。取样点固定在离烧杯底部o 5 厘米处，取5 0 1 x l 的乳化 液与1 0m l ，o 1 的s d s 混合，在5 0 0 n m 处测定，用o 1 的s d s 做空白对照。 乳化活性：e a i = 2 x 2 3 0 3 xa 0 x n c x ( 1 ) 10 4 乳化稳定性：e s i = ( a t a 0 ) x1o o n ：稀释倍数，c ：乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质浓度( m l ) ， m ：乳化液中油的体积分数( l l ) 。 2 3 7 疏水性的测定 参考k a t o 等【3 7 】人采n a n s ( 1 苯胺基8 萘磺酸) 荧光探针法测定疏水性。将蛋白样品 溶解于0 o l m o l l ，p h 7 0 磷酸缓冲液中，分别配成浓度为0 0 2 m g m l ，0 0 4 m g m l ， 0 0 6 m g m l ，0 0 8 m g m l ，0 1 m g m l 的蛋白溶液。取样品液5m l ，加入5 0 9 l ，8 0 m m o l l 的a n s ，震荡，静置3 分钟。设定激发波长l e x = 3 3 8 n m ( 狭缝校正5 n m ) ，发射波长沁m = 4 9 6 ( 狭缝校正5 n m ) ，测荧光强度。以荧光强度对蛋白质浓度作曲线，曲线的斜率即为蛋白 质分子的表面疏水性指数。 2 3 8 起泡性和泡沫稳定性的测定 参考t c r o g u e n n e c 的方法【5 4 】，1 的分离蛋白溶液1 0 0m l 置于5 0 0m l 量筒中，使 用高速乳化均质机以1 7 5 0 0r m i n 的速度均质4 0 秒，接连3 次共计2 分钟，记录均质后 液面高度记为v o ，静置3 0 分钟后记录液面高度，记为v 3 0 m i n 。 起泡性( f o a m i n gc a p a c i t y ) 公式如下：f c ( ) = ( v o - - 1 0 0 ) 1 0 0 1 0 0 ； 泡沫稳定性( f o a m i n gs t a b i l i t y ) 公式如下：f s ( ) = ( v o 一1 0 0 ) ( v 3 0 m i n1 0 0 ) x 1 0 0 。 2 3 9h p l c 液相试验 利用高效液相色谱( s h i m a d a z u 2 0 a t ) 进行分子量分布试验，采用s h o d e xp r o t e i n k w - 8 0 2 5 凝胶柱，流动相是5 0 m m 磷酸缓冲盐和0 0 3 m 氯化钠( p h 7 o ) 的混合溶液，流 速为1 0 m l m i n ，柱温为2 5 。 2 3 1 0 自由氨基含量的测定 参考w l e r t i t t i k u l 5 1 】等人的实验方法，将1 2 5 肛l 的反应液与2 0 m l 的0 2 1 m 磷酸缓 冲液混合，p h 8 2 ，加1 0 m l0 0 1 的t n b s 。充分混合后，放到5 0 c 的水浴加热3 0 分 钟( 避光) ，用2 0 m l 的o 1 m 亚硫酸钠终止反应。混合物在适温下放置1 5 分钟。空白 是在相同操作下用蒸馏水代替反应液。采用紫外可见分光光度计在4 2 0 n m 下测定吸光 值。自由氨基含量根据l 亮氨酸含量的标准曲线来确定。 2 3 1 1 数据统计分析 本实验所有数据均为三次平行，二次重复。数据均以平均值4 - 标准偏差( s d ) 表示。 1 0 第二章从高温粕和低温粕中提取的花生分离蛋白和大豆分离蛋白的性质比较 2 4 结果与分析 2 4 1 高温粕和低温粕中的基本成分比较 本试验测定的数据可以看出，如表2 1 。原始高温花生粕的蛋白含量大约在4 0 左右， 低于低温花生粕中的蛋白含量。总体来看，高温花生粕和低温花生粕中的蛋白质含量较 高，与大豆粕中的蛋白含量相当( 大约在4 0 左右) ，说明对花生粕进一步研究，提高 其应用价值有一定现实意义。 表2 - 1 高温粕和低温粕的成分比较 t a b 2 - 1t h ec o m p a r i s o no fe o m p o n e n to fl o w