（食品科学与工程专业论文）几种外源酶对低盐腊肉成熟过程中风味的影响研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文摘要 摘要 腊肉是我国的传统肉制品，通过对传统工艺的改良才能使之适应工业化生产的需要。在降低 盐含量、缩短生产周期的同时，保证腊肉良好的独特风味是非常必要的。鉴于酶在肉制品促进成 熟和风味形成过程中的重要作用，本文从外源酶着手，研究外源蛋白酶和脂酶对低盐腊肉成熟过 程中风味的影响。 本研究首先测定比较了几种市售腊肉和实验室自制的低盐腊肉的感官特性、理化特性和挥发 性风味成分的差异，结果表明腊肉中较为理想的理化指标为：盐分含量为3 左右，水分含量为 3 0 左右，水分活度a w 在0 8 4 左右。运用顶空固相微萃取结合g c m s 分离鉴定了9 种腊肉的 挥发性风味成分，分析结果表明，它们在种类上差异不大，但在含量上差异较大。结合感官评定 分析认为，腊肉的风味可能与样品中苯酚类、酯类和醛类物质的含量关系最大。 还分别研究了添加蛋白酶( 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶) 和脂酶( 胰脂酶、大豆腊氧合酶) 对促 进低盐腊肉在贮藏过程中蛋白质降解、脂肪水解和氧化以及风味的影响。结果表明，添加蛋白酶 的样品在贮藏过程中水溶性氮、非蛋白氮及游离氨基酸的含量明显高于空白组。感官评定的结果 表明，腊肉贮藏1 4 d 后，添加蛋白酶的腊肉样品的风味明显比空白组浓郁。g c m s 分离鉴定结 果的结果表明，添加了胰蛋白酶的腊肉样品中大多数挥发性风味化合物的含量明显高出未加酶的 样品，尤其是乙酯类、环烷烃及6 1 0 个碳的醛类物质的含量。添加胰脂酶和大豆脂氧合酶的腊肉 样品在贮藏过程中的酸价和t b a 值明显高于空白组。在贮藏2 0 d 后，添加3 0 u 和6 0 u 胰脂酶的 腊肉样品的脂香味和烟熏香味明显要浓于空白组，而在1 3 感和质地上与空白组没有明显差异；添 加大豆脂氧合酶的腊肉样品在风味和口感上与空白组没有明显差异，不过，贮藏3 2 d 、添加量为 2 1 u 的腊肉样品微有哈味。 关键词：腊肉，低盐腊肉，风味。外源酶 n 中国农业大学硕士学位论文 摘要 a b s t r a c t c h i n e s eb a c o ni sak i n do ft r a d i t i o n a lm e a tp r o d u c t i ti sn e c e s s a r yf o ri t sp r o c e s s i n gt e c h n i q u et o c h a n g et oa d a p ti n d u s t r i a l i z a t i o n ，s u c ha sl o wc o n t e n to f s a l ta n dl e s sp r o c e s s i n gt i m ew i t h o u tc h a n g ei n i t su n i q u ef l a v o r b e c a u s et h ei m p o r t a n te f f e c to fe n d o g e n o u se n z y m e so nm a t u r a t i o na n df l a v o r f o r m i n go fm e a tp r o d u c t s ，t h ee f f e c t so fe x o g e n o u sp r o t e a s e sa n dl i p a s e so nf l a v o ro fl o w s a l tc h i n e s e b a c o nw e r es t u d i e d t h ed i f f e r e n c e so fs e n s o r yp r o p e g i e s ，p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n dv o l a t i l ef l a v o rc o m p o n e t si n s o m ec o m m e r c i a lc h i n e s e b a c o n sa n dl o w s a l tc h i n e s eb a c o nw e r e c o m p a r e d t h e i d e a l p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fc h i n e s eb a c o nw e r e ：a b o u t3 o f s a l tc o n t e n ti s a b o u t3 0 o fw a t e r c o n t e n ta n da b o u to - 8 4o fa w v o l a t i l ec o m p o u n d sf r o mn i n ek i n d so fc h i n e s eb a c o nw e r ei s o l a t e db y s o l i d - p h a s em i c r o e x t r a c t i o nm e t h o da n da n a l y z e db yg a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) ， t h er e s u l ni n d i c a t e dt h el i u l ed i f f e r e n c e si nk i n d s ，b u ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nc o n t e n t s t o g e t h e rw i t h t h es e n s o r ye v a l u a t i o n ，t h ef l a v o ro f c h i n e s eb a c o nh a dag r e a tr e l a t i o nw i t ht h ec o n t e n t so fp h e n o l s ， e s t e r sa n d a l d e h y d e s e x p e r i m e n t a ls t u d i e so nt h ee f f e c t so fa d d i t i o no fp r o t e a s e s ( t r y p s i n ，p a p a l n ) a n dl i p a s e s ( p a n c r e a t i c l i p a s e ，b e a nl i p o x y g e n a s e ) o np r o t e o l y s i s ，l i p o l y s i sa n df l a v o ro fl o w - s a l tc h i n e s eb a c o nd u r i n gs t o r a g e w e r ef o l l o w e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t , t h ec o n t e n t so fw a t e rs o l u b i l i t yn i t r o g e n ( w s n ) ，n o n - p r o t e i n n i t r o g e n 斛p n ) a n df r e ea m i n oa c i d s ( f a a ) i nc h i n e s eb a c o nw i t hp r o t e a s e sd u r i n gs t o r a g ew e r em u c h m o r e t h es e n s o r ye v a l u a t i o ns h o w e dt h ef l a v o rm u c hs 仃o n g e ri nt h ep r o t e a s e sa d d e ds a m p l e sa f t e r s t o r i n g1 4d a y s a n dg c m sa n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ec o n t e n t so f t h em o s tv o l a t i l ef l a v o rc o m p o n e n t s ， e s p e c i a l l yt h ec o n t e n t so f e t h y le s t e r s ，c y c l a n e sa n da i d e h y d e sw i t hc 6 - c 1 0 ，w e r em u c hm o r ei nc h i n e s e b a c o nb ya d d i n gt r y p s i n t h ea c i dv a l u e ( a v ) a n d2 - t h i o b a r b i t u r i ca c i d ( t b a 、n u m b e ri nc h i n e s eb a c o n w i t hl i p a s e sd u r i n gs t o r a g ew e r em u c hm o r e ，w i t ht h ef a tf l a v o ra n ds m o k i n gf l a v o rm u c hs 仃o n g e r , i n c h i n e s eb a c o nb ya d d i n g3 0 ua n d6 0 up a n c r e a t i cl i p a s ea f t e rs t o r i n g2 0d a y s ，b u tn os i g n i f i c a n c e d i f f e r e n c ei nt a s t ea n dt e x t u r e n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nf l a v o ra n dt a s t eb ya d d i n gb e a nl i p o x y g e n a s e w e r ef o u n d ，b u ts o u rf l a v o ra p p e a r i n gi nc h i n e s eb a c o nb ya d d i n g2 1 ul i p o x y g e n a s ea n da f t e rs t o r i n g 3 2d a y s k e yw o r d s ：c h i n e s eb a c o n ，l o w - s a l tc h i n e s eb a c o n ，f l a v o r , e x o g e n o u se n z y m e s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究蚴：弓韶 b 搁：酬年占月引日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生虢 哆鹄 帆 姗6 年占月纠曰 导师签名 时间：o 冼0 6 年g 职日 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 腊肉是我国的一大传统肉制品，一直以来以其易加工、耐贮藏、风味独特而广受青睐。但是， 传统工艺生产过程中存在一些弊端抑制了其自身的进一步发展。概括起来主要存在三个方面的问 题【lj ：腌制配方不合理，食盐和亚硝酸盐添加量过高，对人体健康潜在危害较大；生产工艺落后， 生产周期长，生产过程中易受污染；保鲜技术单一，完全依赖高盐低水分的保藏方法，致使产品 质地干硬，口感偏成。而现有的腊肉工业生产工艺将腊肉加工规范化，且将生产周期从传统的3 个月左右缩短到l o 天内。由于腊肉的生产周期对于企业的经济效益有直接和重要的影响，利用 现代技术进一步加快腊肉成熟速度，缩短生产周期具有重要的意义。 针对现有的腊肉工业生产工艺存在的诸多问题，本实验宣就腊肉生产工艺的现代化改进做了 大量的工作口】_ 【”，开发了低盐腊肉的现代化生产工艺。但是，采用现代化腊肉生产工艺，在缩短 了生产周期的同时，也减弱了其浓郁风味。肉制品中的内源酶在其风味形成过程中具有非常重要 的作用，它们参与蛋白质降解和脂肪的水解及氧化。但由于酶系构成及作用过程非常复杂，有关 内源酶对肉制品中风味的改善作用的研究进展缓慢，故近年来也有很多研究从外源酶着手研究。 但是，国内外均未见酶对于腊肉风味形成所起的作用的相关报道。因此，研究酶对腊肉成熟过程 风味形成的影响可以丰富腊肉研究的基础理论，并进一步指导腊肉生产工艺的改进，为改善腊肉 品质提供理论指导。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 腊肉的研究进展 1 2 1 1 腊肉的起源、种类和产品特性 腊肉是我国的一大传统肉制品，它是原料肉用食盐、曲酒、酱油等辅料腌制后，经晾干或烘 烤等加工而成的具有浓郁风味的肉制品，因过去多在农历腊月加工故而得名。 腊肉的制作和烹饪方法在我国已有上千年的历史。腊肉加工始于唐朝，但早在汉代的盐铁 论中就已经将“腌”作为一种加工方法与炖、煮、酱并列其t 4 ；魏、晋、南北朝时代将腊味 作为江苏名品而记载与册。到了北宋和南宋，经济和文化的高度发展使得肉制品加工技术精益求 精，腊肉和金华火腿就是在此时形成了地方风味。南宋著名的诗人陆游的好友杨万里曾在吴春 卿响腊猪肉戏作古句中写到，“老夫畏热饭不能，先生馈肉香倾城”；“君家猪红腊前作，是 时雪后吴山脚”，腊肉在当时的受欢迎程度可见一斑。清朝，我国的传统肉制品的制作方法的种 类和技法达到了的高峰，在袁枚的隋园食单中，腊肉的制作方法和原理以及地方名品都被记 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 载于内吼 腊肉的主要产地是广东、四川、云南、湖南、黄河长江流域，我国东北几乎不生产腊肉。我 国南方腊月气温较低。肉品不易腐败，是生产腊肉的好季节。而我国东北地区，入秋之后气温明 显凉爽，空气干燥，对生产腊肉十分有利。目前较成体系的主要有广式腊肉、湖南腊肉和四川腊 肉。 腊肉色泽美丽、香味浓郁、肉质细嫩，不仅是馈赠亲友的珍贵礼品，还是出口的主要食品之 一，为创汇做出了贡献。腊肉制品的显著特点一是易于加工，二是具有独特风味，三是耐贮性， 有的货架期可达6 - 8 个月。腊肉属于典型的半干型高盐肉制品，水分活度在o 8 8 o 7 0 之间，p h 值5 9 6 1 ，水分含量2 5 3 0 ，食盐含量5 8 之间，总微生物的数量级小于1 0 6 c f u g i ”。 1 2 1 2 腊肉加工技术研究进展 上述提到的广式、湘式和川式腊肉在原料肉要求和加工工艺上都有一定差异。 广式腊肉以肋条肉为原料肉，切条腌制后进入三层式烘房烘烤，烘房内温度从下层8 0 c 至上 层5 0 4 c 不等，烘烤7 2 h 后不经烟熏冷凉后包装。腊肉成品色泽鲜明，肌肉呈鲜红色，脂肪透明。 湘式腊肉的腌制分为千腌和湿腌两个阶段，腌制后水洗晾干后送入熏房熏制。熏房温度由开 始的7 0 ( 2 逐渐下降到5 0 5 5 c ，烘烤3 4 h 左右后即为成品。湘式腊肉成品肉皮呈金黄色，脂肪似 腊，肌肉橙红，具有浓郁的烟熏香味。 川式腊肉要求原料肉为膘厚至少2 e m 以上的肋条或前后腿肉。与前两种腊肉不同的是，川式 腊肉将烘烤和烟熏结合，烘烤一段时间后进行烟熏，整个烘烤时间不超过5 0 h 。 我国许多致力于传统肉制品生产的工作者和研究肉制品的专家学者，对我国腊肉制品的生产 现状和未来发展方向做了大量研究工作，主要包括以下几个方面： ( 1 ) 原料肉的多样化 除用五花肉为原料外，还有以纯精瘦肉、后臀尖为原料的腊肉以及腊羊肉、腊牛肉、腊鸡、 腊鸭和各种动物内脏的腊制品应运而生o j 。 ( 2 ) 腌制剂的改良 我国传统腌腊肉制品腌制剂配料简单，除使用食盐和亚硝酸盐外，一般不使用其它添加剂。 因此对于腌腊肉更多的研究方向投入到对传统配方和加工设备的科学改造上。 减少食盐、亚硝酸盐用量，寻求发色剂的替代品是研究热点之一。腊肉属于高盐低水分肉制 品，产品干硬，从口味和口感上都不适于现代消费者的需求，针对这一点可利用栅栏技术( h u r d l e t e c h n o l o g y ) i l ”，在不影响产品传统风味和货架期的前提下，调整含盐量和水分活度。冯彩平等 开发的低盐腊肉将腊肉的含盐量从8 降到了3 左右。耿欣等【”i 用麦芽酚、红曲色素、抗坏血 酸、葡萄糖和亚硝基血红蛋白等部分或全部代替亚硝酸盐，控制亚硝酸盐的使用，同时积极地开 发硝酸盐替代品。另外在腌腊肉制品的抗氧化护色方面研究甚多，对茶多酚、生育酚、迷迭香 提取物、芝麻酚等天然的酚类化合物均有研究i ”。 此外，应用节能、安全、高效、经济的新型防腐剂成为研究的另一热点。有机酸及其盐类防 腐剂已广泛应用于腌肉制品的保鲜。乳酸盐能在一定程度上抑制食品腐败菌和致病菌的成长，另 外，山梨酸钾、苯甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸盐和磷酸盐等用于肉类食品的保鲜也有不少报道。 ( 3 ) 传统工艺的改进 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 目前腊肉加工的环境和设备还很简陋，而且加工周期长，生产成本高。国内的许多肉品学者 为了改变这种局面，一直致力于工艺的改进，缩短加工周期。在保持中式肉制品传统特色的基础 上，广泛借鉴西式肉制品的腌制( 注射腌制液) 、滚揉、保水、乳化、低温杀菌等先进加工技术， 使中式肉制品加工工艺更加科学合理，产品质量更能适应现代要求【1 6 】。研究表明，采用盐水注射 和滚揉技术相结合的腌制方法，不仅显著的缩短腌制时间，提高生产效率，而且可以准确控制腌制 液的用量，使其分布更加均匀j 。 ( 4 ) 烟熏工艺的改良 通过烟熏赋予了产品诱人的色泽，提高了抗氧化能力，抑制了微生物的繁殖，并增加了腊肉 制品的浓郁风味。传统的直接烟熏法【1 8 】，操作主要靠经验，产品质量较难控制，而且3 ，4 一苯并 芘含量较高，危害人体健康。近年来采用烟熏香味液浸制或喷涂熏制腊肉的方法已被广泛接受【1 “ 。 1 2 2 腊肉主体风味物质的研究进展 食品的风味是食品中许多不同种类、不同数量的风味物质对人体感官的综合效果，也即食物 的客观性质作用与人的嗅觉和味觉等感官器官所产生的综合知觉1 2 i i ”】。随着生活水平的改善，人 们对食品风味的要求也越来越高，风味已成为衡量肉品质的一个重要指标。它与质地、营养、安 全性等一起，成为影响人们对畜禽肉取舍的决定因素田j 。 风味不是一种化合物的结果，熟肉的风味特征是无数不同组成物质在数量上微妙平衡的结 果。由于风味物质成分的复杂性以及含量过微，所以尽管人们对肉品风味物质做了很多研究，实 际上人们对它的了解还比较有限。随着科研手段和仪器的改进，尤其是核磁共振、高分辨色谱质 谱、气相色谱，质谱联用、高效液相色谱的出现，使得肉品风味的研究得以迅速发展【2 4 】。 1 2 2 1 肉类风味的形成机理及其影响因素 大量研究表明，肉类的复杂风味体系都是由具有滋味和香味活性的成分组成的。尽管肉类食 晶的滋味活性成分一般都是非挥发性的，但是它们的香味活性成分实际上都是挥发性的 2 5 , 2 6 j 。肉 香前体通过三条途径形成肉香：( 1 ) 肉中的脂质自动氧化、水解、脱水及脱羧，生成芳香醛、 酮、内酯类化合物；( 2 ) 肉中的糖、氨基酸的分解氧化反应，或糖与氨基酸之间的反应，生成 挥发和不挥发性成分；( 3 ) 以上产物之间也可反应产生香气成分。 脂质在特征肉香的生成上十分重要。脂质降解生成大量的脂肪酸，而不饱和脂肪酸的热氧化 是肉中挥发性风味物质形成的重要反应之一。初产物为无气味的过氧化物，然后降解形成醛、酮、 烃、呋喃、醇和羧酸等各种挥发性香气物，后两者可发生酯化反应形成各种酯，羟基酸也可自身 环化形成内酯。脂类在氧化反应中的活泼性与其饱和度相关；多不饱和脂肪酸更易产生诱入香味 和“蒸煮味”。有研究发现，在干腌火腿中已鉴定出2 6 0 种挥发性成分2 7 。”，大部分来自于脂质 的自动氧化，6 个碳原予以上的醛来自于游离脂肪酸的氧化，醇及酮来自于b 酮酸的脱羧作用， 酯来自于各种醇和羧酸的酯化，游离脂肪酸来自于三酯酰甘油及磷脂的水解。m o t t r a m 等【2 9 1 证实 磷脂通过与美拉德反应产物相互作用，改变其挥发性产物的构成从而影响肉品风味。 肌肉中的蛋白质发生如下反应：蛋白质一多肽一游离氨基酸一挥发性羰基化合物。肽和氨基 3 酸的降解产生大量产物包括：氨、二氧化碳、氨基酸、醛、硫化氢和苯型化合物。一些氨基酸继 续反应如半胱氨酸、胱氨酸加热形成噻唑及其衍生物，半胱氨酸形成噻吩。经许多实验证明，半 胱氨酸和胱氨酸是形成肉香气的必需氨基酸，丝氨酸和苏氨酸是形成毗嗪的特征氢基酸1 3 。而且 香气的形成基于肽的降解而形成的一系列氨基酸，加热一种氨基酸不会产生香味化台物川j 。 美拉德反应是在加热条件下由氨基酸中的氨基和还原糖中的羰基发生羟氨缩合反应所引发 的。一般认为，糖、氨基酸发生美拉德反应和氧化反应形成呋喃衍生物的内酯、醛、酮、二羰基 化合物等是产生肉类香味的主要反应之一。另外肉类风味中的一些很重要的杂环化台物，如吡嗪 类等也是由美拉德反应所致。在肉的风味物质形成的过程中，还有一个与美拉德反应密切相关的 反应，即斯特雷克尔氨基酸反应【”训。研究发现，当美拉德反应生成一些含有羰基的戊糖和丁糖 降解产物即一些二羰基化合物可以促进斯特雷克尔氨基酸反应产生醛，而半胱氨酸的斯特雷克尔 氨基酸反应还会产生硫化氢和氨。肉制品中挥发性物质中大量的杂环化合物的形成正是这些化台 物提供了反应物。 硫胺素是一种含硫、氮的双环化合物，当受热时可产生多种含硫和含氮挥发性香味物质【j “。 据认为硫胺素降解的第一步是噻唑环中c n 及c - s 键的断裂形成羟甲基硫基酮，这是一个非常 关键的巯基酮中间产物，由此可得到一系列的含硫杂环化合物。这其中的一些化合物存在于肉香 气挥发成分中， 影响肉品风味的因素包括宰前因素和宰后因素，前者顾名思义就是屠宰前影响风味的因子，包 括畜种、繁殖、年龄、遗传因素和饲料等，这里不作赘述。后者包括p h 、温度和水分活度等o ”4 1 。 p h 对肉制品风味的影响主要表现在对各种风味物质降解或者聚合反应上。如硫胺素在碱性环 境中更加迅速。在p h 4 0 5 6 范围内，随p h 的下降，总挥发物增加，特别是呋喃醇及其氧化产物 在低p h 下大量生成，而噻唑等杂环化合物在较高p h 下产量较多。p h 对脂肪氧化产物烃、酮、醛 等的形成影响不大。但饱和醛、烯醛及二烯醛在挥发物中浓度随p h 增加而下降，其原因可能是高 p h 促进它们与氨基酸的缩合反应。 温度的增加有利于美拉德反应和脂类氧化。较高的温度不仅加速各种反应的速度，而且加速 肉中游离氨基酸和其它风味物前体的释放速度。有人比较了温度对鸡胸肉中两种美拉德反应产物 和两种脂类氧化产物增加速度的影响，2 ，3 丁二酮、二甲基二硫化物、壬醛以及2 庚酮在7 0 c 以前均明显增加，但是在7 09 c 以后，两种美拉德反应产物有一定减少，而脂肪氧化产物增加明显 减慢。 水分活度是样品水分存在形式的热力学表示方法。生肉中本身含有大量水分，而肉香前体物 质多数是水溶性的，因此水是肉制品香味形成的重要介质。根据资料报道，煮肉和干加热产生的 风味物质和量都有显著差异。有人加热l - 谷氨酸钠、l 抗坏血酸、硫胺素盐酸盐和胱氨酸的 混合物时，发现不同水分活度对风味物质的种类和数量有很大的影响，当水分活度大于0 4 时，主 要产生煮肉香味，反之则主要产生烤肉香味。硫胺素在水和丙二醇中的热解产物，发现水反应相 碳酰化合物、呋喃、噻唑、噻吩等产物显著高于丙二醇反应相，且噻吩为水反应相所独有。 1 2 2 2 腊肉风味的形成及研究 在现有的关于腊肉风味的研究多集中在其烟熏香味上。对于腊肉的特有风味来说，加工过程 4 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 中的烟雾起了关键性的作用。烟熏制品主要是通过木材加热分解产生的气味物质挥发后，通过烟 雾与食物接触，一方面烟雾传热使肉本身的风味前体物质生香；另一方面，烟雾的各种挥发性成 分通过扩散、渗透、吸附进入肉中，使肉产生烟熏味。熏烟的成分常因燃烧温度、燃烧室的条件、 形成化台物的氧化变化以及其他许多因素的变化而有差异。一般认为熏烟中最重要的成分为酚、 酸、醇、羰基化合物和烃类等。烟熏在腊肉加工中所起的作用主要为：呈味作用、变色作用、抗 氧化作用和杀菌作用【3 7 】。 腊肉的风味除了肉类受热时产生的香气外，还取决于肉制品表面所吸附的成分，这与熏烟成 分及熏制方法均有关系。国外的科学家们将烟熏食品的烟的成分区分为几大类，每一类都被认为 是烟熏食品中某种基本功能的来源，其中酸性化合物主要是对风味和表皮的形成有贡献，酚类化 合物能产生风味并提供保存能力，羰基化合物可以与蛋白质和其它氮源反应，给食品提供烟熏的 色泽，因此，熏烟沉积量对于腊肉风味物质的含量有着重要意义。 在木材发烟过程中，纤维素的热降解给产品带来了脂肪酸和醛，这是形成烟熏色泽的重要途 径，半纤维素的分解产物是呋喃及其衍生物和一系列脂肪族羧酸。醛和氨类化合物的羰氨反应是 引起烟熏主要色泽的主要反应，反应途径是经过羟基乙醛中间体的方式，在糖一氨基酸化合物中 形成一种吡嗪聚合物，从而赋予腊肉制品良好的色泽p8 ”1 。 酚类物质是腊肉特有的风味物质的重要组成成分，它主要通过木质素生成，其生成途径如图 l - 1 所示。 木质素 | r 阿魏酸 j 4 一甲基愈创术目* 一乙烯基愈创木酚- - 乙酰香兰酮 、 4 一乙基愈创术酚香草酚 l 香草酸 上 愈创木酚 图1 1 酚类物质的形成途径 f i 9 1 - 1t h e f o r ma p p r o a c ho f p h e n o ls u b s t a n c e s 在液态烟熏剂中大量发现的，对食品的风味有贡献的酚为：丁子香酚、异丁子香酚、愈创木 酚、苯酚和甲酚。 1 2 23 肉品风味分析方法的研究 研究肉制品的芳香风味中挥发性物质时，所受的影响因素很多。不仅加工会影响挥发性化合 物组成，不同的分离和取样方法也会影响其研究结果，常用的分析方法m4 1 1 有：水蒸汽蒸馏一有 机溶剂抽提法( s i m u l t a n e o u sd i s t i l l a t i o n - - - e x t r a c t i o nm e t h o d 。简称s d e ) 、吹扫捕集法( p u r g ea n d 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 t r a pm e t h o d ，简称p t ) 、固相微萃取法( s o l i d - p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，简称s p m e ) 。其中s d e 法和p t 法应用较早，使用也很广泛，国内外已普遍用于各种肉制品芳香成分分析中挥发性风味 物质的提取过程。而s p m e 法是一种分析检测食品风味物质的新方法，正越来越受到食品研究 工作者及其他分析从业人员的普遍关注并正在推广应用【j “4 2 1 国外的科研工作者对肉制品中的挥发性风味成分进行了大量的研究，但由于腊肉属于中国的 传统肉制品，故关于腊肉中的挥发性风味成分的报道很少见，只有余爱农l l “”1 分别用水蒸气蒸馏 法和氮吹扫蒸馏法( n i t r o g e np u r g e - a n d - s t e a mn p s d ) 结合气相色谱，质谱法分离并分析鉴定了烟 熏腊肉中的挥发性风味成分及其相对含量，他指出，烟熏腊猪肉的关键香味成分是：愈刨木酚、 苯酚、5 甲基2 甲氧基苯酚、2 甲基苯酚、4 乙基愈创木酚、2 ，4 - 二甲基苯酚、丁子香酚等。此 外，竺尚武等1 4 ”用水蒸气蒸馏法提取、乙醚萃取后通过气，质分离鉴定了金华火腿中的4 8 种挥发 性风味化合物；俞龙浩1 4 “用同时蒸馏提取法对广式香肠挥发性风味成份进行了研究，检出了7 8 种化台物。 国外学者对于肉制品中挥发性风味成分的主要研究对象是火腿。s a b i o e 等1 4 ”对欧洲著名的 六种火腿中的挥发性风味成分进行了研究发现，这六种火腿的挥发性成份存在着较大的差异，这 种差异主要同原料腿的品种和来源以及加工工艺存在较大的相关性。j o r g e 等1 4 ”通过对不同腌制 时间的i b e r i a n 火腿中挥发性化合物的对比研究发现，腌制时间较长时，火腿中2 甲基正丁醛、 3 甲基正丁醛等含甲基的醛类物质的含量明显较高，它们与腌制风味成正相关。h i n r i c h s e n 和 p e d e r s o n 4 ”、b a r b i e r i 等l ”1 、b o l z o n i 等【删以及b u s c a i l h o n 等【5 1 1 采用动态顶空技术分析干腌火腿的 挥发性化合物，而g a r c i a 等1 和b e r d a g i l e 等印1 则通过减压蒸馏方法来研究火腿中的挥发性成分。 研究发现，与动态顶空技术相比，采用减压蒸馏技术发现更多的羧酸、内酯和脂肪族碳氢化合物。 1 2 3 酶对腌腊肉制品风昧影响的研究进展 1 2 3 1 内源酶在腌腊肉制品风味影响的研究进展 有研究者 5 4 , 5 5 | 研究了酶对肉类风味形成的作用，认为风味化合物或其前驱物是动物器官中通 过细胞内的生物途径产生的一种代谢物，并提出细菌的蛋白酶类、脂肪类和其它酶类在形成肉的 风味前驱物质中起了重要作用，它参与了蛋白质的降解和脂肪的水解及氧化。 ( 1 ) 蛋白质降解 生肉在屠宰后成熟过程中，组织蛋白酶和钙激活蛋白酶的活性增强，在这两种酶的作用下肌 肉中的蛋白质发生如下反应：蛋白质一多肽一游离氨基酸一挥发性羰基化台物。反应中产生的小 肽、游离氨基酸和挥发性羰基化合物是肉品重要的风味物质。 国外学者在肉制品加工及贮藏过程中蛋白质降解、蛋白酶活性及风味形成这三者的相关性方 面进行了大量的研究。f t o l d r a 等1 5 6 , 5 7 1 详细的研究了s e r r a n o 火腿加工过程中内源蛋白酶活性的变 化情况，并解释它们在蛋白质降解中所起的作用：由于腌制过程中水分的损失，钙激活蛋白酶对 蛋自质降解的作用相当有限。组织蛋白酶d 极不稳定，在成熟的前期就消失了，所以它对蛋白质 降解的作用也很小。但组织蛋白酶b 和l 在蛋白质降解过程中起了重要作用。 m o l l y 等”8 j 研究了干发酵香肠在成熟期内微生物酶和内源酶对蛋白质降解的影响，研究发现， 6 在蛋白质降解的初期，主要是组织蛋白酶，尤其是组织蛋白酶d 的作用结果，而在随后的阶段， 主要是微生物酶起主导作用。 m a r t i n 等研究了两种工艺( 现代工艺和传统工艺) 生产的i b e r i a n 火腿成熟过程中的蛋白 质降解情况，通过分析测定工艺过程中股二头肌中食盐和非蛋白氮的含量来研究确定工艺过程中 不同温度对蛋白质水解的影响。通过毛细管电泳和高效液相色谱研究i b e r i a n 火腿工艺过程中肽类 物质的形成以及对风味物质的贡献。 j a c i n t a m a u 等 6 0 , 6 1 1 人通过测定p h 、氯化钠、非蛋白氮和酶活性等的变化趋势，研究了生鲜 腿的p h 、氯化钠含量对西班牙干腌火腿工艺过程中组织蛋白酶活性及其产品风味的影响。加盐 量增加，蛋白质的降解作用降低，作者认为这可能是氯化钠含量的增加能抑制组织蛋白酶的活性， 从而抑制蛋白质的降解。 m f 1 0 r e s 等“】对西班牙s e r r a n o 火腿中游离氨基酸的含量与火腿风味的关系进行了研究，研 究发现，谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的 含量与火腿加工时间的长短有很强的相关性，随着加工时间的延长，游离氨基酸的含量增加，火 腿的风味浓郁。此外，赖氨酸和酪氨酸能改善p a r m a 火腿的成熟味。 ( 2 ) 脂肪水解及氧化 腊肉的风味与脂类在加工成熟中的变化有重要关系，腊肉中脂肪含量高达3 0 4 0 ，其在加 工过程中，晾干或烘烤都经历了适宜脂酶作用的温度0 0 - 6 0 c ) ，而且时间也相对比较长，有利于 脂质酶解反应的发生。 m a r i a l 6 3 1 研究发现在干腌火腿的肌肉组织中，存在着许多脂酶，这些脂酶一直保持很高的活 性，而且有的脂酶非常稳定，在干腌火腿的成熟过程中，它们能够使脂质不断降解和氧化。活体 组织中含有很少的游离脂肪酸，甚至几乎没有游离脂肪酸，但是，在脂酶的作用下，原料肉在加 工中不断游离出脂肪酸，其中主要是三酯酰甘油和磷脂水解释放出游离脂肪酸【j 。而游离脂肪酸 是形成肉制品风味的重要前体物质。 g a m b o t t i 等【6 ”分析了干腌火腿加工中皮下脂肪组织中的腊类变化情况，指出脂肪的剧烈水解 发生在火腿成熟期的前6 个月，主要是在脂蛋白酶和激素敏感脂酶的作用下发生的，且剧烈的脂 解可以促进脂肪的氧化。在火腿成熟的后期，游离脂肪酸中的亚油酸和硬脂酸的含量急剧下降， 棕榈酸的含量有所增加。 v e s t e r g a a r d 等i 叫研究了p a r m a 火腿加工中肌肉组成的变化，腊解活性( 酸性和中性脂酶的活 性) 和游离脂肪酸产量三者问的关系，研究发现，产品中游离腊肪酸的含量与鲜火腿中酸性和中 性脂酶的活性呈显著的相关性，并证明适度的脱水作用和盐浓度有利于脂酶活性的增加和游离脂 肪酸产量的增加，从而加强火腿的风味。 m o t i l v a 等研究了s e r r a n o 干腌火腿加工中脂酶、酯酶活性的变化以及与脂肪水解的关系。研 究发现：在加工的开始阶段，中性和碱性脂酶较为活跃，这一阶段发生剧烈的腊解，产生大量的 游离脂肪酸。而整个加工过程中，酯酶显示极其稳定，但挥发性脂肪酸的量极少，这说明酯酶对 脂解及风味形成的作用很小。腌制后期的盐浓度和温度影响中性和碱性脂酶的活性，随着温度的 升高和水分活度的降低，中性和碱性腊酶逐渐失去活性，而溶酶体酸性脂酶的活性增强。 m o l l y 等【67 】分析了b e l g i a n 干发酵香肠中内源脂酶和微生物酶在脂解过程中所起的作用。研 7 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 究表明，加入抗菌素对干发酵香肠中游离脂肪酸的含量没有显著影响，脂肪中羰基化合物的产生 不依赖于微生物的作用。 综上所述，导致肉中的蛋白质降解及脂肪水解和氧化的酶类主要是内源的组织蛋白酶( 尤其 是组织蛋白酶b 和l ) 、酸性和中性脂酶等，而内源酶的活性与肉中的p h 值、水分含量及温度等 有很大的关系。故在今后的研究中，可试图通过改变内源酶活性以影响蛋白质及脂肪的水解来改 善腌腊肉制品的风味。 1 2 3 2 外源酶在腌腊肉制品风味影响的研究进展 前已述及，内源酶在肉制品的风味形成过程中起到重要的作用，但由于酶系构成较复杂、其 影响因素较多也难于控制；因此，近年来国外研究者对通过添加外源酶来加速肉制品的成熟、缩 短生产周期上进行了大量的研究，但主要研究对象是千发酵香肠。 z a p e l e n a 等岬】通过添加不同的蛋白酶( 中性蛋白酶、碱性蛋白酶和h t 真菌蛋白酶) 到两种 干发酵香肠中，研究其对蛋白质降解、风味形成及质构的影响作用。研究发现，不同蛋白酶对蛋 白质降解的促进作用不同，添加过量的蛋白酶会造成香肠质构上的软化，而选择合适的添加量则 能加速香肠的成熟。 d i a z 等1 6 9 】通过将不同剂量链霉蛋白酶e 、天冬氨酰蛋白酶和木瓜蛋白酶添加到干发酵香肠中 研究蛋白酶对其蛋白酶降解的影响作用，研究发现，未添加和添加蛋白酶的千发酵香肠在成熟过 程中总游离氨基酸的变化趋势相同，而从电泳图来看，添加了蛋白酶、尤其是木瓜蛋白酶的干发 酵香肠中重链肌球蛋白和肌浆蛋白的降解明显强于未添加的。 z a l a c a i n 等 7 0 l 向发酵香肠中添加来自于r h i z o m u c o r m i e h e i 的脂酶，研究发现，添加这种脂酶 对干发酵香肠的p h 、水分活度及微生物的生长情况没有明显的影响，油酸、亚油酸、棕榈酸和 硬腊酸的含量明显增高，酸价也增高，但是对风味的影响不大。 f e m a n d e z 等1 7 i ，”1 研究了添加胰脂酶对干发酵香肠脂肪降解、微生物指标和感官质量的影响。 研究发现，添加胰脂酶对发酵香肠的p h 值、含水量和水分活度没有明显影响，但对三酰甘油尤 其是二酰甘油酯的降解和游离脂肪酸的积累有明显的促进作用。肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸的含量 均有明显的增加。研究还发现，添加6 0 和9 0 个酶活单位的胰脂酶对干发酵香肠的风味形成有促 进作用，也可减少成熟时间。 此外，a n s o r e n a 等【7 目将脂酶p a l a t a s e m 和蛋白酶p r o t e a s e p 同时添加到发酵香肠中，研究其 对蛋白质降解和脂肪水解的促进作用，发现部分游离氨基酸( 谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸等) 和游离脂肪酸( 油酸、亚油酸和棕榈酸) 的含量增加，但风昧没有太太变化。g o s s l i n e 等 ”4 j 将一种乳酸菌提取物加到发酵香肠中，对其风味有明显的改善，短时间内可得到高质量的产品。 综上所述，选择合适的外源蛋白酶及脂酶能一定程度的加速干发酵香肠的成熟，缩短生产周 期，且对风味有一定的影响作用。不过添加过量的外源酶会造成香肠质构及风味上的缺陷。 8 1 3 研究内容 本研究在对市售腊肉的普样调查的基础上，以实验室开发的低盐腊肉为研究对象，通过添加 不同的外源酶及其不同添加量，分析腊肉在贮藏期间蛋白质降解、脂肪水解及氧化和风味形成情 况。具体包括以下四个方面的内容： ( 1 ) 通过对市售腊肉产品的普样调查，比较不同样品的理化特性和挥发性风味成分的差异，研究 腊肉样品的感官品质、挥发性风味成分与理化特性三者之间的关系。 ( 2 ) 从外源蛋白酶( 选用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶) 着手，通过测定腊肉在贮藏过程中蛋白质降解 情况、游离氨基酸含量及蛋白酶酶活的变化情况，研究蛋白酶促反应在促进低盐腊肉风味和 质地形成过程中起的重要作用。 ( 3 ) 从外源脂酶( 胰脂酶和大豆脂氧合酶) 着手，通过测定腊肉在贮藏过程中脂肪水解及氧化一隋 况、游离脂肪酸的组成及风味的变化情况，研究脂酶对促进低盐腊肉的脂解及风味的快速形 成过程中起的重要作用。 ( 4 ) 在研究添加单一的蛋白酶或脂酶对低盐腊肉风味的影响的基础上，选择作用较好的一种蛋白 酶和脂酶，尝试将蛋白酶和脂酶以适宜的添加量复合添加到低盐腊肉中去，研究其对腊肉的 风味的影响作用。 9 第二章市售腊肉的理化特性和风昧分析 在肉类产品的整体可接受性中，风味是十分重要的感官性质，具有风味的挥发性化合物的优 势效应对食品的感官特性产生巨大的影响。影响肉制品的风味的因素很多，原料肉的性质和加工 工艺无疑是影响风味的两大重要因素。为了了解市售腊肉和低盐腊肉的一些基本情况，本章通过 不同样品的理化特性、感官评定和挥发性风味成分差异的比较，研究腊肉样品的感官品质、挥发 性风味成分与理化特性三者之间的关系。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料与试剂 从市场上选取有代表性的腊肉样品，包括湖南腊肉、四川腊肉、广式腊肉及湖北腊肉，样品 具体情况如下； 1 ) 以里脊肉为原料，经烟熏的精装腊肉( 产地：四川，购于超市发蓝润店) 2 ) 以后腿肉为原料，经烟熏的散装腊肉( 产地：四川，购于美廉美超市) 3 ) 以后腿肉为原料，经烟熏的精装腊肉( 产地：湖南，购于美廉美超市) 4 ) 以后腿肉为原料，经烟熏的散装腊肉( 产地：湖南，购于超市发学院路店) 5 ) 以后腿肉为原料，经烟熏的散装腊肉( 产地：江苏，购于中关村家乐福) 6 ) 以后腿肉为原料，经烟熏的精装腊肉( 产地：江苏，由厂家直接邮购) 7 ) 以五花肉为原料，未经烟熏的精装腊肉( 产地：广东，购于盛兴学院店) 8 ) 以后腿肉为原料，未经烟熏的散装腊肉( 产地：湖北，农家提供) 9 ) 以后腿肉为原料，经烟熏的低盐腊肉( 实验室自制) 亚铁氰化钾、硝酸银、硫酸铁铵、氰酸钾、乙酸锌、冰醋酸、硫酸钾、硝酸钾、硫酸铵、氯 化铵、氯化钠。试验试剂均为分析纯。 2 1 2 主要仪器及设备 d s 一1 高速组织捣碎机 d h g 9 0 7 6 a 型电热恒温鼓风干燥箱 f a j a 电子天平 p h 2 1 1 型酸度计 h h s y 2 1 - n i 电热恒温水浴锅 t d l - 5 0 0 0 b 低速冷冻多管离心机 g l 2 0 g - 1 i 高速冷冻离心机 1 0 上海标本模型厂 上海精宏仪器设备有限公司 上海市天平仪器厂 其林贝尔仪器制造公司 北京市长风仪器仪表公司 上海安亭科学仪器厂 上海安亭科学仪器厂 中国农业大学硕士学位论文 第二章市售腊肉的理化特性和风昧分析 u v 2 1 0 1 p c 紫外可见分光光度计 康卫氏皿 h z q x l 振荡培养箱 b 6 0 真空滚揉机 b y x x 5 0 烟熏箱 a g i l e n t6 8 9 0 - a g i l e n t 5 9 7 3 型气谱，质谱联用仪 s p m e 固相微萃取器 2 1 3 实验方法 上海尤尼科仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 哈尔滨市东联电子开发技术有限公司 杭州艾博科技工程有限公司 杭州艾博科技工程有限公司 2 1 3 1 样品理化指标的测定 p h 值的测定：称取绞碎的腊肉样品1 0g