（食品科学专业论文）缩短豆豉生产周期的研究.pdf

山东轻t 业学院顾十学位论文 摘要 豆豉是以整粒大豆或( 豆瓣) 为原料，经浸泡、蒸煮、制曲、发酵等工序加 工而成的，具有极高营养价值和医疗价值的豆类食品。豆豉的传统发酵时间都很 长，需要投入的费用很多。本论文通过研究大豆的预处理对豆豉生产周期的影响 以及在此基础上采用黑曲霉a s 3 3 5 0 、枯草芽孢杆菌a s l 3 8 9 和保加利亚乳杆菌等 人工接种多菌种制曲，来缩短制曲和发酵时间。并在后发酵时期利用产香酵母 c f 6 1 0 和保加利亚乳杆菌改善口味。 对大豆预处理的研究表明，最佳浸泡工艺参数为3 5 浸泡1 5 h ，含水量4 5 ， 氨基酸态氮含量为0 0 7 6 ；最佳蒸煮工艺参数为2 h 常压蒸煮，氨基酸态氮含量达 到0 0 9 8 。 对种曲制备条件的研究表明，黑曲霉和枯草芽孢杆菌种曲制备的条件：最佳 培养基配比( 麸皮：豆粕：水) 分别为6 5 ：3 5 ：1 0 0 和9 0 ：1 0 ：1 0 0 ；最佳接种量 分别为1 2 和1 o ；最佳培养温度均为3 0 ；最佳培养时间均为6 0h 。 采用枯草芽孢杆菌、黑曲霉和保加利亚乳杆菌人工接种多菌种制曲来缩短制 曲周期。枯草芽孢杆菌和黑曲霉人工接种双菌种制曲的最佳工艺参数：菌种配比 ( 枯草芽孢杆菌：黑曲霉) 为2 ：1 ，接种量8 ，制曲温度3 0 ，制曲时间7 2 h 。 枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌人工接种双菌种制曲的最佳工艺参数为：菌种配 比为枯草芽孢杆菌：保加利亚乳杆菌- 4 ：l ( g m l ) ；接种量1 0 ；培养时间4 8 h ； 培养温度2 5 。枯草芽孢杆菌、黑曲霉和保加利亚乳杆菌人工接种多菌种制曲的 最佳工艺条件为：接种量1 0 ，枯草芽孢杆菌、黑曲霉和乳酸菌的菌种配比为 3 ：2 ：l ，制曲温度为2 5 ，培养时间为4 8 h 。均比单纯的天然制曲周期短。 产香实验表明，产香酵母c f 6 1 0 和保加利亚乳杆菌混合菌在接种量为1 0 ， 接种比例为1 ：3 发酵时产香效果最好。 后发酵的最佳工艺参数：以枯草芽孢杆菌a s l 3 8 9 、黑曲霉a s 3 3 5 0 和乳酸菌 为发酵菌种，其接种比例为3 ：2 ：l ，发酵温度为4 5 ，以产香酵母c f 6 1 0 和保 加利亚乳杆菌为产香菌，接种比例为1 ：4 ，接种量为0 2 。此条件下发酵1 2 天 各项指标均达到要求。与天然的传统发酵相比，明显的缩短了发酵时间0 关键词：豆豉枯草芽孢杆菌黑曲霉保加利亚乳杆菌蛋白酶发酵 a b s t r c t a b s t r c t d o u c h ii sh i g hn u t r i t i o n a la n dm e d i c a lv a l u el e g u m i n o u sf o o d ，w h i c ht a k i n gt h e e n t i r eg r a i no fs o y b e a no r ( b e a np e t a l ) a sar a wm a t e r i a la n di t sw o r k i n gp r o c e d u r e i n c l u d i n g ：s o a k i n g ，s t e a mb o i l i n g ，t h es t a r t e r , f e r m e n t a t i o n i na d d i t i o n ，d o u c h i t r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o np e r i o di sv e r yl o n g ，w h i l en e e d i n gh i g he x p e n s ei n v e s t s b a s e d o nt h er e s e a r c ho ft h ei n f l u e n c eo nf e r m e n t e ds o y b e a np r o d u c t i v ep e r i o d ，w h i c hc a u s e d b ys o y b e a n sp r e t r e a t m e n t ，t h i sp a p e ru s ea s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0 ，b a c i l l u ss u b t i l 括 a s138 9 ，l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u sa n do t h e rm u l t i - s t r a i na r t i f i c i a li n o c u l a t i o ns t a r t e r , t o r e d u c et h ek o jia n df e r m e n t a t i o nt i m e ，a n du s ep r o d u c ef r a g r a n ty e a s tc f 610a n d b u l g a r i a nl a c t o b a c i l l u st oi m p r o v et h et a s t ei np o s t - f e r m e n t a t i o np e r i o d p r e t r e a t m e n to fs o y b e a ns t u d i e ss h o w ，b e s tt e c h n i c a lp a r a m e t e r sf o ri m m e r s i o n ： 3 5 。c m a r i n a t e1 5h o u r s ，4 5 w a t e rc o n t e n t ，t h ec o n t e n ta m i n on i t r o g e ni s0 0 7 6 b e s tc o o k i n gp r o c e s sp a r a m e t e r s ：s t e a m2h o u r s ，t h ec o n t e n ta m i n on i t r o g e ni s0 0 9 8 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fk o jip r e p a r a t i o n ：a s p e r g i l l u sn i g e ra n db a c i l l u s s u b t i l i sw e r ed e t e r m i n e db ye x p e r i m e n t s ，m e d i ap r o p o r t i o nw a s6 5 ：35 ：10 0a n d 9 0 ：10 ：10 0r e s p e c t i v e l y , m i c r o b ei n o c u l u m ss i z ew a s1 2 a n d1 o r e s p e c t i v e l y , t h e c u l t i v a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 0 。c ，t h ec u t i v a t i o nt i m ew a s6 0 h m a k ek o j ib ym u l t i - s t r a i n so f a s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0 ，b a c i l l u ss u b t i l i s1 3 8 9 a n d l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u st os h o r t e nt h et i m eo fk o j i m a k i n g u s e sb a c i l l u ss u b t i l i s a s1 3 8 9a n da s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0t ot a k et h ek o j i m a k i n g ， t h ep r o p o r t i o no fb a c t e r i a2 ：1 ，v a c c i n a t i o no f8 ，at e m p e r a t u r eo f3 0d e g r e e sf o r k o ji - m a k i n g ，k e e p i n g f o r7 2 h t h eb e s t p a r a m e t e r s o fb a c i l l u ss u b t i l i sa n d s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u sk o l i - m a k i n ga r ea sf o l l o w s ：t h er a t eo ft h ev o l u m eo f b a c i l l u ss u b t i l i sa n ds t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u si s4 ：1 ( g m l ) t h eg r o s so ft h ev o l u m e o fb a c i l l u ss u b t i l i sa n dl a c t o b a c i l l u si s10 t h et i m eo fk o j i - m a k i n gi s4 8 h t h e t e m p r a t u r eo fk o ji - m a k i n gi s2 5 i n o c u l u m ss i z ew a s10 m i c r o b ei n o c u l a t i o n p r o p o r t i o no fb a c i l l u ss u b t i l i s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ：l a c t o b a c i l l u sw a s3 ：2 ：1 ，a n d t h ek o j ih a sb e e nm a d ea f t e r4 8 ha t2 5 c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a ln a t u r a lk o j i o b v i o u st h ek o jit i m ei ss h o r t e n e d h o n gp r o d u c t i o ns h o w ：p r o d u c ef r a g r a n ty e a s ta n dm i xf u n g u sp r o d u c ef r a g r a n t r e s u l tb e s tf e r m e n t t h ei n o c u l a t i n ga m o u n ti s10 i ti s1 ：3t oi n o c u l a t ew i t ht h e p r o p o r t i o n a n dt h e nt h eb e s tc r a f to ff e r m e n t i n g ：r e g a r dw i t h e r e db a c i l l u ss u b t i l i s ， a s p e r g i l l u sn i g e ra n dl a c t o b a c i l l u sa st h ef e r m e n t e db a c t e r i u m ，i ti si n o c u l a t e dw i t ht h e p r o p o r t i o na s3 ：2 ：1 ，f e r m e n t e dt e m p e r a t u r ei s4 5 。c ，r e g a r dp r o d u c i n gf r a g r a n ty e a s t i i 山东轻t 业学院硕十学位论文 a n dl a c t o b a c i l l u sa sa n dp r o d u c et h ef r a g r a n tf u n g u s ，i ti s1 ：4t oi n o c u l a t ew i t ht h e p r o p o r t i o n t h ei n o c u l a t i n ga m o u n ti so 2 e v e r yi n d e xm e e t st h eq u a l i f i c a t i o nt o f e r m e n tf o r12d a y su n d e rt h i sc o n d i t i o n c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a ln a t u r a l f e r m e n t a t i o n ，i nt h i se x p e r i m e n tf e r m e n t a t i o nt i m ei ss h o r t e n e d k e yw o r d s ：d o u - c h i b a c i l l u ss u b t i l i s a s p e r g i l l u sn i g e r d e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s p r o t e i n a s e f e r m e n t a t i o n i i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 弓| 用能人的成果，均已做出明确标注或褥到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位审请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中l 乍了明确的说明 并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为出东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名： 日期：年月日 日期：年月目 山东轻工业学院硕i ：学位论文 第1 章绪论 我国豆豉种类繁多，根据制曲时参与的微生物的主要种类，有霉菌型豆豉和细 菌型豆豉两大类【l 】。常用的生产方式分为传统的自然发酵工艺和人工接种发酵工 艺。霉菌型豆豉参与制曲的主要微生物是霉菌，天然制曲周期一般为1 5 - 2 0 天， 发酵时间为1 年左右。细菌型豆豉参与制曲的主要微生物是枯草芽孢杆菌，天然 制曲时间一般为6 7 天，发酵时间为3 0 天左右。采用天然生产时间过长，受季 节气温的限制不能常年生产，严重影响了企业的厂房利用，资金周转，市场供应 和规模扩大，增加了厂家生产成本【2 】。采用多菌种人工接种开放状态下共同制曲， 利用它们产生的各种酶，在适宜的条件下使原料中的成分发生一系列复杂的生物 化学变化，将大豆中的蛋白质降解为易被人体吸收的多肽、氨基酸等，能缩短豆 豉的生产周期。 1 1 豆豉简介 我国主要生产毛霉、曲霉型豆豉及少量细菌型豆豉( 俗称水豆豉) 。国外以 丹贝( t e m p e ，印度尼西亚根霉型豆豉) 和纳豆( n a t t o ，日本细菌型豆豉) 著名。 豆豉因其特有的醇香、酯香和鲜味成为独具特色的调味品和家常菜肴【3 】。 近年来，食品的功能比营养和风味更令人注目，人们对具有预防或治疗某些 疾病的食品较感兴趣【4 5 】。近十余年国内外学者对大豆发酵食品中功能性成分已进 行不同程度研究，如对丹贝和纳豆的研究成果显著、引人注目 6 7 8 9 1 0 】。但对我国 传统大豆发酵食品豆豉中生理活性物质研究则刚刚起步，有待深入i 随着现代分 离分析技术发展，人们将会越来越关注豆豉中多种生理活性物质的分离鉴定及其 保健功能研究。 1 2 豆豉的营养价值 豆豉不仅营养价值高，而且自古入药，我国中医学历代医书中都有豆豉治疗 疾病的记载，汉代张仲景的伤寒论中即有“桅子豉汤”，方中用桅子、豆豉煎汤 治疗外感风寒、小思饮食等症；李时珍的本草纲目中则有“豆豉具有补胃增食、 消食化滞、发汗解表、除烦喘等疗效”的记载。豆豉传入日本后，日本科学家则对 豆豉的保健作用进行研究，提出常服豆豉有助于消化、提高抗病能力、减缓衰老、 消除疾劳等多种作用。而以黄豆为主料，以青蒿、桑叶等为辅料的传统发酵产品 淡豆豉，分别被中华人民共和国药典( 1 9 8 5 年) 和中国医学科学院编著的食品 成分表( 1 9 8 1 年) 收录，被认为是食疗保健药品【1 1 】。 大豆蛋白质含有人体不能合成而必须从食物摄取的各种必需氨基酸，除蛋氨 酸外，大豆蛋白中含量均较多、较平衡，特别是赖氨酸含量高；大豆脂肪含不饱 和脂肪酸占8 0 以上。大豆脂肪中含有人体所必需的亚油酸平均5 0 8 ，亚麻酸平 均为6 8 ；尤其是大豆不含胆固醇；大豆中还有1 8 3 2 的磷脂，具有多种保 第l 章绪论 健功能。豆豉在发酵过程中微生物中的蛋白酶使原料大豆的蛋白质部分水解，故 发酵成熟时，可使水溶性氮的含量提高，并使大豆的硬度下降。大豆中含有的胰 蛋白酶抑制剂可以抑n d , 肠中胰蛋白酶的活力。大豆含有5 的纤维素，这些纤维 素使蛋白质不易与消化酶接触，整粒大豆食用时，其蛋白质消化率仅为6 0 左右。 在豆豉的加工过程中破坏了胰蛋白酶抑制物；纤维酶使纤维素水解生成单糖，蛋 白酶容易与蛋白质接触水解产生一系列的中间产物，如多肽、氨基酸等，这些低 分子量的蛋白食入后，可以不再经过消化直接为肠粘膜吸收，这对消化力减退和 患有消化功能障碍的病人是十分有利的。豆豉与原料熟化豆相比，其维生素b l 、 b 2 的含量有明显提高；维生素a 、e 的含量基本不变。大豆的矿物质含量丰富，但 是大都以植酸盐的形式存在，植酸盐足肌醇磷酸脂的钾、钙、镁复盐。大豆中7 0 8 0 的磷不易为人体利用，约有6 0 被排出体外；钙与植酸结合形成不溶性钙，约 有7 0 - - 8 0 不被人体吸收残留在粪便中；铁与植酸结合形成不溶性铁，使大豆中 铁的吸收率仅为7 ；植酸还能与锌结合形成不溶性盐而使利用率下降。在豆豉加 工过程中，由于微生物分泌的活性植酸酶能使植酸水解生成肌醇和磷酸盐，植酸 可减少1 5 2 0 ，因而，矿物质的可溶性可增力h 2 - 3 倍，利用率可增# h 3 0 , - - , 5 0 t 1 2 - 1 3 l4 1 。 夏岩石i l5 j 等将豆豉的营养成分列于下表l 和表2 。 表1 1 豆豉的氨基酸模型与f a o ，w h o 参考模型的比较( m g g n ) 2 山东轻t 业学院硕士学位论文 ( 1 ) 大豆异黄酮 大豆异黄酮是目前大豆及其发酵制品中最引人注目一种功能性成分。由于具 有一定的类似雌激素作用，又可称为植物雌激素。以前一直被认为是豆腐、豆乳 等大豆食品不快味( 苦味、收敛味) 成分，而最近免疫学调查发现，它具有抗氧化、 抗菌、增强免疫、预防乳癌、前列腺癌等生理功能可以降低人体多种雌激素依赖 性疾病的发病率，而且在防治心血管疾病、预防骨质疏松病、治疗妇女更年期综 合症等方面有重要作用口o 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 1 。目前已明确，大豆异黄酮抗癌机制主要包 括以下几个方面：类似女性雌激素作用及抗激素作用；抑制与癌相关酶活性作用； 在癌细胞增殖阶段，具有抑制新血管增生作用；能消除活性氧，从而具有抗氧化 作用；还可以调节细胞周期；具有抑制一些与d n a 切断的有关酶活性作用。大豆 异黄酮被认定是目前植物界筛选抗癌成分的首选物质。众多动物实验也证实大豆 异黄酮具有预防骨质疏松症的效果。中山医科大学史琳娜【2 7 】等利用去卵巢大鼠研 究大豆异黄酮对骨丢失的影响，发现含有大豆异黄酮的大豆分离蛋白具有预防骨 丢失作用，而去除异黄酮大豆分离蛋白却无此作用。孙兴引弱j 等通过对丹贝发酵 基质及参数的优化，显著提高丹贝异黄酮苷元含量达到11 0m g l o o g 月贝粉。但目 前尚未见以毛霉、曲霉为主生产的豆豉异黄酮相关报道及相应的保健功能研究。 ( 2 ) 褐色色素类 褐色色素也称蛋白黑素或类黑精( m e l a n o i d i n ) ，是大豆蛋白质以及它的分解产 3 第1 章绪论 物多肽类与还原糖之间作用发生美拉德( m a i l l a r d ) 反应生成的。从1 9 9 7 年以来，西 南农业大学的石轶松【2 9 j 等对豆豉的类黑精的形成机理及理化功能性质进行了研 究，呈水溶性，等电点为p h 2 - 3 ，是一类弱酸性高分子，具有一种特有的强蓝色荧 光，在酸或碱条件下很容易被水解，然而不被消化酶降解。它具有很强的抗氧化 作用，主要是由于其分子内保持有稳定的自由基结构，此结构能捕集溶液中的自 由基。同时，它还会与铁、铜等金属离子相结合，形成不溶化合物而析出。褐色 色素还有类似食物纤维功能、调节血糖及抑帝i j a c e 活性等功能例。阚建全川等对 豆豉类黑精深入研究，发现毛霉型豆豉非透析类黑精具有较强消除自由基能力， 在干燥物系中对猪油有较明显抗氧化作用，且对n 一二甲基亚硝胺合成有很强抑制 作用，从理论上进一步说明它可作为豆豉中保健功能成分之一，并测定重庆永川 豆豉中类黑精含量为3 6 1 。 ( 3 ) 豆豉溶栓酶 日本学者须见洋行于1 9 8 7 年发现纳豆中有一种具有强溶栓作用的功能因子 纳豆激酶，其溶解血栓能力比尿激酶和纤溶酶原激活因子( p a ) 等治疗血栓症 的药都要强，而且该酶具有无毒副作用、使用安全、体内半衰期长、提取工艺简 便及价格低廉等优点，弥补了现在常用的同类药品毒性较强、副作用较大、体内 半衰期较短及造价较高等缺点。纳豆激酶在体内和体外都具有很好溶解血栓功能， 通过在纤维平板上滴加纳豆激酶提取液，使平板不透明圆圈变成透明，从而发现 并证明其体外溶栓作用。豆豉中含有溶解纤维蛋白抗栓主要成分的溶栓酶， 特别适应患有血栓病、血稠、脑梗塞等疾病的人食用【3 2 】。目前豆豉溶栓酶的生产 分离工艺存在周期长、步骤多、收率低等缺陷，难以满足人们对新一代溶栓剂纳 豆激酶的要求。随着分离科学技术的不断发展，新型分离技术在生物产品分离纯 化中的应用己日益广泛，为了获得高纯度、高产率的豆豉溶栓酶，采用新型分离 技术分离豆豉溶栓酶已势在必行。豆豉溶栓酶分离纯化的发展方向：( 1 ) 磁性高分 子微球分离方法；( 2 ) 反胶团萃取分离方法【3 3 】。 ( 4 ) 大豆磷脂删 大豆磷脂是由卵磷脂、脑磷脂、磷脂肌醇和磷脂酸等成分组成的混合物。大 豆磷脂是人体组织组成的重要成分之一，所以，它可作为日常多聚磷酸胆胺的来 源，关系到机体内脂肪、胆固醇的代谢酶系统和脂肪在肝脏中的转化作用等。此 外，大豆磷脂还是脑和神经系统中乙酰胆碱以及前列腺素等活性物质的前体，并 能溶解和清除肌体内的某些过氧化脂质、活化脑细胞、调节内分泌系统。所以， 含有大豆磷脂的大豆制品，可延长寿命， 统疾病均有不同程度的缓解和治疗作用； 对各种老年病和老年性痴呆、脑血管系 也可以调节肌体内胆固醇的沉积，故对 防治心血管疾病也有非常积极的作用；还可增加和改善血液凝固，故可用于补血 制品的生产。此外，大豆磷脂还有保护肝脏、防止脂肪肝和肝硬化的作用，能部 4 山东轻工业学院硕上学位论文 分溶解胆结石和防止胆结石的生成，也可以消除烟、酒和苯胺等毒性物质对人体 的危害，具有一定的解毒作用。 ( 5 ) 大豆低聚糖 大豆中天然存在的低聚糖有棉子糖( r a f f i n o s e ) 、水苏糖( s t a c h y o s e ) 、蔗糖等， 其生理功能在于其独有的双歧杆菌增殖特性。通过微生物发酵，低聚糖既有损失 也有生成。发酵过程中低聚糖形成有两大途径：一是微生物产生的糖苷转移酶通 过转糖基作用合成低聚糖；另一是微生物产生的内切半纤维素酶类，如半乳聚糖 酶、甘露聚糖酶和木葡聚糖酶及木聚糖酶等水解半纤维素类多糖产生低聚糖1 3 7 。 大豆发酵食品中已发现的低聚糖有低聚果糖、蔗果三糖( 包括其三种异构体) 、低聚 半乳糖、低聚异麦芽糖以及低聚木糖等。其中，低聚果糖是在发酵中产生的，主 要是由蔗果三糖的三种异构体在果糖基转移酶的作用下形成的；而低聚半乳糖是 由1 3 一半乳糖苷酶转糖基作用形成的。在自然界许多微生物如根霉、毛霉等都会 产生半乳聚糖酶，它是一种内切糖苷酶，可水解半乳聚糖产生低聚半乳糖。低聚 异麦糖是支链淀粉的酶解产物，其分子中至少含有一个0 【一l ，6 糖苷键，在酱油中存 在【3 研；而低聚木糖是木聚糖受木聚糖酶降解所得的产物。大豆发酵食品丹贝经少 孢根霉发酵后，蛋白质净利用率( n p u ) 提高3 0 ，而低聚糖和植酸明显下降1 4 。 ( 6 ) 大豆皂甙 近年来国内外研究表明大豆皂甙具有以下许多生理功能：降脂减肥、抗凝血、 抗血栓、抗糖尿病、抑制过氧化脂质生成及分解、抗病毒、免疫调节j 抑制或延 缓肿瘤等作用。鱼红闪【4 2 】等研究表明，在大豆发酵制品大酱的发酵过程中，大豆 皂甙总量未发生大变化，但在制曲的过程中皂甙种类增加到8 9 种，发酵过程中 逐渐减少到4 5 种，并发现大豆皂甙在发酵过程中皂甙糖基被部分水解或加上糖 基。但对成品大酱中新皂甙生理活性未作研究，其它大豆发酵食品皂甙变化及活 性研究方面未见报道【矧。 ( 7 ) 大豆多肽类 大豆蛋白质经酶降生成多肽的生理功能研究取得较大进展，已有许多研究报 道大豆多肽具有许多较新生理作用：降血脂，降胆固醇，低过敏原性，降血压， 促进矿物质吸收，增强运动员肌肉和消除疲劳，调节胰岛素，促进脂肪代谢及抗 氧化等作用4 5 1 。此外，大豆多肽对一些微生物如乳酸菌、双歧杆菌、酵母及霉 菌等生长有一定的促进效果【矧。s m a c c h i 和g o b b e t t i 【3 9 】，对乳源性活性多肽的研究中， 发现发酵乳制品更富含各种活性多肽。腐乳生产中，蛋白酶水解大豆蛋白质d h 在 2 5 左右，平均肽链长度约为四个氨基酸残基，正好是大豆多肽产品要求的肽链长 度【4 7 】。说明发酵大豆制品中，大豆蛋白经微生物产生蛋白酶分解后生成多种可能 具有生物活性多肽，今后还应进一步研究该类多肽生理活性作用及其微生物酶解 的最佳条件。 5 第l 章绪论 1 3 豆豉国内外研究现状 1 3 1 豆豉的生产工艺 ( 1 ) 毛霉型豆豉 工艺流程： 茶色大豆_ 浸泡_ 沥干_ 蒸豆_ 焖豆呻出甑_ 冷却_ 接种_ 入室_ 上垫培养 一成曲_ 配料一润料_ 装坛发酵_ 成品 t 食盐、白酒、甜酒酿、水 李幼筠【1 6 1 等人选育出的中温型m r c 一1 毛霉菌种，并研究了生产工艺。其工艺 采用m r c 一1 菌株纯种制曲，制曲周期由传统的1 5 - - 2 0 天缩短到3 4 天，并添加一 定蛋白酶液，乳酸菌，酵母菌进行多菌种强化发酵，发酵周期由传统的1 2 个月缩 短到4 个月，并保持了四川毛霉型豆豉的传统风味。杜木英等利用中温型毛霉和 x 1 菌，在4 5 混合发酵1 个月的豆豉，其理化，感官指标均接近自然发酵生产的 毛霉型豆豉，缩短了生产周期和含盐量。 ( 2 ) 根霉型豆豉 精选大豆_ 清洗一浸泡一脱皮_ 蒸煮_ 冷却一调酸_ 接种混匀_ 发酵一成品 一加盐后发酵_ 后发酵制品 根霉型豆豉常见的是丹贝。丹贝是印度尼西亚的传统大豆发酵食品。王华1 8 1 等采用液体发酵少孢根霉菌丝作为种子制作丹贝，种龄为1 5 h ，前发酵时间是18 h ， 缩短了生产周期。 ( 3 ) 细菌型豆豉 工艺流程： 大豆叶淘洗_ 煮熟- 沥干 三i 二三二篓：二薹： _ _ - _ _ - _ - _ - - _ _ r _ j l 配制_ 入坛发酵 土 成品水豆豉 制曲过程中起主要作用的微生物为细菌，所以水豆豉属于细菌型豆豉。在日 本细菌型豆豉以纳豆为主，国外对纳豆的研究比较多，国内也丌始对细菌型豆豉 的保健功能进行研究。南京农业大学董明盛【1 9 】等人利用n k 一5 菌株开发了具有特 定生理活性的新型纳豆保健品。 1 3 2 国内研究现状 国内对豆豉的研究主要集中在优良菌种选育和传统工艺改造。从1 9 9 7 年以来， 西南农业大学石轶松【4 8 】等对豆豉类黑精的形成机理及理化功能性质进行研究；陈 留记【4 9 j 等对豆豉褐变机理进行探讨，为解决豆豉速成低盐化生产工艺奠定基础； 6 山东轻t 业学院硕士学位论文 杜木英【5 0 5 1 】等曾对豆豉生产过程中生化机理进行系统研究，为采用纯种发酵大规 模生产豆豉提供可行工艺技术。国内对豆豉保健功能研究仅限于丹贝异黄酮 5 2 5 3 5 4 5 5 】、豆豉类黑精5 6 1 等有限几篇文献，豆豉其他保健功能成分研究尚未见报道。 我国对豆豉的研究刚刚起步，目前，生产厂家多采用传统的自然发酵工艺， 生产规模小，产品档次低，其市场占有率愈来愈低，发展前景令人堪忧。应加大 科研开发力度，优选、优化生产菌种，将豆豉的生产由传统作坊式向工业化、标 准化方向转变，从而提高产品质量，发挥自身的优势，提高其国内市场份额，进 而发展为国际化的产品。 1 3 3 国外研究现状 国外豆豉研究以日本纳豆、印尼丹贝研究较为深入。纳豆和丹贝均源于我国 的豆豉1 5 7 1 ，与豆豉仍有异曲同工之处，然而两者的发展现状和在食品界的影响力 已是青出于蓝。他们不仅研究工艺的改进，近十余年主要研究这类发酵食品的保 健功能，欧、美等国学者对大豆发酵食品营养价值和保健功能的研究兴趣也越来 越浓。但n a t t o 及t e m p e 与国内毛霉、曲霉型豆豉是完全不同两类产品，而且前两类 食品有很强地方嗜好性，不适合大多数中国居民口味。 1 4 立题依据和研究内容 1 4 1 立题依据 豆豉的发酵成熟是一个缓慢和难以控制的过程。豆豉的制曲和后发酵时间都 很长，需要投入的费用就很多。尤其是单菌种接种制曲，产酶体系简单；产品风 味不够丰富。而多菌种人工接种制曲则改变了这个状况。枯草芽孢杆菌主要分泌 中性蛋白酶，而黑曲霉的酸性蛋白酶活性则较高。中性蛋白酶只能把蛋白质水解 至短肽，并不能将蛋白质水解成游离氨基酸【5 引。随着豆豉曲p h 值的降低，中性蛋 白酶的催化作用减弱，最终导致原料蛋白质利用率不高，风味不足。而酸性蛋白 酶的存在弥补了这一不足。应用黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合制豆豉曲。由于在制 曲的过程中其所分泌的蛋白酶分别为酸性蛋白酶和中性蛋白酶，丰富并加强了成 曲的酶系，从而能将蛋白质水解成游离氨基酸，便于消化吸收。加速豆豉的成熟 无论从经济的角度还是从贮藏角度都具有现实的意义。因为豆豉制造者在短期内 生产出成熟风味的产品的这种方法，节约投资费用和操作费用。 1 4 2 研究内容 本课题在研究采用多菌种制曲的基础上，对豆豉的发酵以及口味改善进行了 研究，确定了缩短豆豉生产周期的最佳工艺参数：主要研究以下的内容： ( 1 ) 大豆预处理对豆豉生产周期的影响； ( 2 ) 采用枯草芽孢杆菌a s l 3 8 9 ，黑曲霉a s 3 3 5 0 进行种曲制备的研究； ( 3 ) 采用多菌种制曲，缩短豆豉的制曲周期的研究： ( 4 ) 缩短豆豉后发酵时间，并在此基础上改善豆豉的口味。 7 第2 章大豆预处理对豆豉生产周期的影响 第2 章大豆预处理对豆豉生产周期的影响 2 1 引言 在豆豉生产工艺中，大豆的预处理共分为浸泡和蒸煮二部分。大豆浸泡的目 的是原料吸收一定水分，蒸煮时蛋白质迅速达到适度变性，淀粉易于糊化，浸泡 的所达到的含水量与制曲的关系密切，要求大豆浸泡后含水量达到4 5 左右。大 豆蒸煮的目的使大豆组织软化，蛋白质适当变性，有利于菌体的分泌酶作用于蛋 白质【5 9 】。如果蒸煮不足或者过度，在发酵过程中会因为蛋白质变性或过度变性， 影响豆豉的感官品质。本实验主要测定大豆浸泡、蒸煮特性，测定氨基酸态氮含 量、完整率和硬度。氨基酸态氮是豆豉成熟的一个重要指标，硬度是蛋白酶作用 于大豆的一个重要因素，蒸煮时间太长硬度降低，有利于蛋白酶作用于大豆，但 是不能保证大豆的完整率，所以要结合各项指标，来确定最佳的预处理参数。 2 2 试剂及方法 2 2 1 试剂 氢氧化钠、甲醛、邻苯二甲酸氢钟、酚酞、三氯乙酸、碳酸钠、磷酸氢二 钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、酪素、蛋白胨、牛肉提取物、氯化钠、琼脂、 钼酸钠、钨酸钠、磷酸、盐酸、溴素、硫酸锂均为生化试剂。 2 2 2 仪器与设备 d z k 眦型电子恒温水浴锅黄马市卸甲综合电器厂 h z 振荡器 东联电子技术开发有限公司 f a 2 0 0 4 电子分析天平上海天平仪器厂 g h x 9 0 8 0 b 1 隔水式电热恒温培养箱山东潍坊医疗器械厂 d s x 2 8 0 a 1 不锈钢手提式灭菌器 上海申安医疗器械厂 d z k 、眦型电子恒温水浴锅黄马市卸甲综合电器厂 l g l 0 2 4 a 高速离心机 北京医用离心机厂 g h x 一9 0 8 0 b l 隔水式恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司 2 2 3 实验方法 ( 1 ) 浸泡条件的确定 浸泡温度对浸泡时间的影响 浸泡温度分别为2 0 。c 、2 5 、3 0 。c 、3 5 。c 、4 0 ，浸泡之后要求大豆水分含 量在4 5 左右，测定各个温度下所用的时间。 浸泡温度对大豆及水溶液中氨基酸态氮含量的影响 浸泡温度分别为2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 。c ，浸泡之后要求大豆水分含 量在4 5 左右，测定浸泡后大豆及水溶液中氨基酸态氮含量。 ( 2 ) 蒸煮条件的确定 8 山东轻t 业学院硕七学位论文 蒸煮方式对大豆色泽的影响 蒸煮方式选择常压蒸煮和高压蒸煮二种方式，蒸煮后观察大豆的色泽。 常压蒸煮时间对大豆及水溶液中氨基酸态氮含量的影响 浸泡温度为3 5 ，时间1 5 h ，浸泡之后常压蒸煮，煮沸时间分别为1 h ，1 5 h ， 2 h ，2 5 h ，分别测定煮后大豆和水溶液中的氨基酸态氮含量。 常压蒸煮时间对大豆完整率的影响 浸泡温度为3 5 c ，时间1 5 h ，浸泡之后常压蒸煮，煮沸时间分别为l h ，1 5 h ， 2 h ，2 5 h ，测定大豆的完整率。 常压蒸煮时间对大豆硬度的影响 浸泡温度为3 5 。c ，时间1 5 h ，浸泡之后常压蒸煮，煮沸时间分别为1 h ，1 5 h ， 2 h ，2 5 h ，分别测定大豆的硬度。 ( 3 ) 水分含量的测定： 干燥法测定f 删。 ( 4 ) 氨基酸态氮含量的测定【6 l 】： 甲醛法测定【6 1 1 。 ( 5 ) 硬度的测定 将一玻璃板放于平整的桌面，取4 粒完整的豆粒放于玻璃板的四角，取另一 玻璃板盖上，逐渐添加砝码，直至豆粒压扁。记下砝码和玻璃板重量：。 硬度( g c m 2 ) = w s公式2 1 式中w 砝码和玻璃板的重量( g ) s 一粒豆的面积( 约0 8 c m 2 ) ( 6 ) 完整率的测定 在蒸煮过程中没有破碎的豆子颗粒数占总豆子的百分数。 2 3 结果与讨论 2 3 1 浸泡温度对浸泡时间的影响 浸泡温度分别为2 0 c 、2 5 * ( 2 、3 0 c 、3 5 c 、4 0 c ，浸泡之后要求大豆水分含 量在4 5 左右，测定各个温度达到要求所需的时间。 9 第2 章大豆预处理对豆歧生产周期的影响 3 5 3 52 5 厘2 蕾 1 5 l 2 02 53 03 54 0 温度( ) 图2 1 浸泡温度对浸泡时间的影响 f i g u r e 2 1t h er e l a t i o nb e t w e e nt i m ea n dt e m p e r a t u r e 由图2 1 可知，大豆含水量达到4 5 所用时间随浸泡温度的增加足基本按线性 减少的。3 5 时1 5 h 、4 0 时1 2 h 含水量达到4 5 ，水的温度越高加速了大豆吸水 速度。氨基酸态氮是后发酵中重要的理化指标，是衡量豆豉在后发酵中的质量标 准，所以确定最佳的浸泡温度和时间还需测定浸泡后大豆中氨基酸态氮的含量。 2 3 2 浸泡温度对大豆及水溶液中氨基酸态氮含量的影响 浸泡温度分别为2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 ，浸泡之后达到大豆水分含 量在4 5 左右，测定此时大豆及水溶液中氨基酸态氮含量。 a 水溶液中氨基酸态氮含量的测定 嘣 0 0 2 5 舡0 0 2 腻厂、 怕浆0 0 1 5 甾。 醐 0 0 l 蕊 0 0 0 5 l 一，j 一 2 02 53 0 。1 一_ j 3 54 0 温度( ) 图2 2 浸泡温度对水溶液一f - 氨基酸态氮含最的影响 f i g u r e 2 2t h ei n f l u e n c eo f b e a n ss o a k i n gt e m p e r a t u r e o nt h ec o n t e n to fa m i n on i t r o g e ni nw a t e r b 大豆中氨基酸态氮含量的测定 1 0 山东轻t 业学院硕士学位论文 0 0 8 浆0 0 7 5 。0 0 7 裟0 0 6 5 城0 0 6 蒜。0 5 ； 2 02 53 03 54 0 温度( ) 图2 3 浸泡温度对大豆氨基酸态氮含量的影响 f i g u r e 2 3t h ei n f l u e n c eo fs o a k i n gt e m p e r a t u r eo nt h ec o n t e n to fa m i n on i t r o g e ni ns o y b e a n 因为在豆豉的生产中氨基酸态氮的含量是衡量豆豉成熟的重要指标，所以要 求在浸泡和蒸煮中氨基酸态氮尽量生成，但是不能游离于浸泡和蒸煮之后的水溶 液中，如果这样，会造成氨基酸态氮的流失。 由图2 2 可知随着浸泡得温度升高，水溶液中的氨基酸态氮的含量也随之增加， 在3 5 、4 0 时分别为0 0 2 0 5 和0 0 2 1 8 。由图2 3 可知随着浸泡得温度升高，大 豆中的氨基酸态氮的含量也随之增加，在3 5 浸泡的大豆氨基酸态氮含量为 0 0 7 6 ，4 0 。c 浸泡后大豆的氨基酸态氮的含量为0 0 7 7 ，3 5 和4 0 下的大豆氨 基酸态氮含量变化幅度不大，对后期的制曲和后发酵影响可能不明显。结合图2 1 ， 图2 2 ，图2 3 ，3 5 和4 0 浸泡所用的时间差距不大，结合经济成本，选择在3 5 时浸泡1 5 h 是最佳的浸泡参数。 2 3 3 蒸煮方式对大豆色泽的影响 常压蒸煮和高压蒸煮二种方式，大豆在高压下蒸煮颜色发暗，发生了美拉德 反应，将会影响豆豉的风味，而且在0 i m p 下蒸煮的大豆的硬度太小，易在制曲 和发酵中破碎，所以不能采用高压蒸煮。以后实验全部采用常压蒸煮j 2 3 4 常压蒸煮时间对大豆及水溶液中氨基酸态氮含量的影响 浸泡温度为3 5 ，时间1 5 h ，浸泡之后常压蒸煮，煮沸时间分别为l h ，1 5 h ， 2 h ，2 5 h ，分别测定蒸煮后大豆和水溶液中的氨基酸态氮含量。 a 煮后大豆的水溶液中氨基酸态氮的含量如图2 4 所示： 由图2 4 可知水溶液中氨基酸态氮含量随着蒸煮时间的增加而增加，并且在蒸 煮2 h 后氨基酸态氮的含量急速增加，蒸煮2 h 后水溶液中氨基酸态氮的含量为 0 0 6 5 ，蒸煮2 5 h 后水溶液中氨基酸态氮的含量达到了0 0 8 2 。 第2 章大豆预处理对豆豉生产周期的影响 戮0外10 0 6 簇，、o 0 8 粕桨卜 籍。0 0 4 | - 撅0 0 2l l1 522 煮沸时间( h ) 图2 4 常瓜煮沸时问对水溶液中氨基酸态氮含量的 影响 f i g u r e 2 4t h ei n f l u e n c eo f b o i l i n gt i m eo f t h ea m i n on i t r o g e ni nw a t e r b 煮后大豆中氨基酸态氮的含量如图2 5 所示： 1 1 52 2 5 时间( h ) 图2 5 常压煮沸时间对人豆氨基酸态氮含晕的 影响 f i g u r e 2 5t h ei n f l u e n c eo fa t m o s p h e r i cb o i l i n gt i m eo ft h ea m i n on i t r o g e ni ns o y b e a n 由图2 5 可知，在蒸煮1 5 h 后大豆的氨基酸态氮的含量急剧增加，蒸煮1 5 h 时氨基酸态氮含量为0 0 3 9 ，煮沸2 h 后氨基酸态氮含量达到了o 0 6 3 和2 5 h 时 0 0 6 4 5 ，结合图2 4 和图2 5 ，在蒸煮2 5 h 氨基酸念氮大量渗出，游离于水溶液 中，所以会对后期豆豉的质量产生影响，可以确定蒸煮时间为2 h 。 2 3 5 常压蒸煮时间对大豆完整率的影响 测定蒸煮l h 、1 5 h 、2 h 、2 5 h 后大豆的完整率。 1 2 7 6 5 4 3