（分析化学专业论文）分子印迹技术在蛋白质分离和识别中的应用.pdf

南开大学硕士研究生学位论文 ab s t r a c t m o l e c u l a r i m p r i n t i n g t e c h n o l o g y i s a p r o m i s i n g t e c h n i q u e f o r p r e p a r i n g h o s t c o m p o u n d s w i t h m o l e c u l e - s p e c i fi c re c o g n i t i o n t e m p l a t e s i t e s i n r o b u s t n e t w o r k p o l y m e r s u s in g t h e p o l y m e r i z a t i o n o f c r o s s - l in k in g a g e n t s a n d f u n c t i o n a l m o n o m e r s . a ft e r t h e t e m p l a t e r e m o v a l , t h e r e s u l t i n g p o l y m e r s a ff o r d c o m p l e m e n t a ry re c o 州n o n s i t e s w h i c h a r e a b l e t o s e l e c t i v e l y re c o g n i z e t h e t e m p l a t e d u r i n g s u b s e q u e n t re b i n d i n g p r o c e d u r e s . c h e m i c a l l y a n d m e c h a n i c a l l y s t a b l e m o l e c u l a r ly i m p r i n t e d p o l y m e r s w e r e s u c c e s s f u l l y u s e d a s s e n s o r s , c h r o m a t o g r a p h i c s t u ff in g , a n d m i m i c s f o r b i o l o g i c a l re c e p t o r s , e n z y m e s , a n d a n t i b o d i e s . u s u a l l y , o n l y l o w m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o u n d s a r e u s e d a s t e m p l a t e m o l e c u l e s a n d p ro t e i n s a r e s e l d o m u s e d b e c a u s e o f 比 e i r i n t r i n s i c l i m i t a t i o n s . i n t h e t h e s i s , w e m a i n l y g o i n t o t h e a r e a o f m o l e c u l a r l y i m p r i n t e d p o l y m e r s a s s o r b e n t s t o s e p a r a t e a n d r e c o g n i z e p r o t e i n s . t h e b o v i n e h e m o g l o b i n - i m p r i n t e d p o l y m e r s w e r e s y n t h e s i z e d a n d d e m o n s t r a t e d p r o p e r t i e s o f a d s o r p t i o n a n d s e l e c t i v e re c o g n i t i o n . t h e r e a r e t h r e e p a r t s , a s s h o w n i n t h e f o l l o w i n g : 1 . t h e b a s i c t h e o ry o f m o l e c u l a r l y i m p r i n t e d p o l y m e r s a n d t h e d e v e l o p m e n t a n d f u t u r e o u t l o o k o f p r o t e i n i m p r i n t i n g w e re re v i e w e d i n t h e i n t r o d u c t i o n . 2 . t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e f u n c t i o n a l m o n o m e r s a n d t e m p l a t e p r o t e i n , t h e p h a n d t h e i o n i c s t re n g th o f t h e m e d i u m w e re p r i m a r i l y i n v e s t i g a t e d fr o m t h e m o l e c u l a r l e v e l u s 吨 u v s p e c t r o s c o p y . mo l e c u l a r l y i m p r i n t e d g e l p o l y m e r s b a s e d o n p o ly a c ry l a m i d e g e l s f o r t h e s e l e c t i v e i m p r i n t i n g o f b o v in e h e m o g l o b i n w e r e p r e p a r e d 妙b u l k p o l y m e r i z a t i o n . t h e p r o p e r t i e s o f r e c o g n i t i o n a n d s e l e c t i v i t y o f t h e i m p r i n t e d p o l y m e r s w e r e s t u d i e d w i t h e q u i l i b r i u m a d s o r p t i o n , s i n g l e a n d c o m p e t i t iv e a d s o r p t i o n s . t h e re s u l t s o f e q u i l i b r i u m b i n d i n g e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d t h a t t h e p o l y m e r s h a d a ff in i t y a n d s p e c i fi c i ty f o r t e m p l a t e i n a q u e o u s m e d i a , a n d t h a t th e i r m o l e c u l a r r e c o g n i t i o n a b i li ty w a s g r e a t l y a ff e c t e d 勿s h a p e a n d h y d r o g e n b o n d i n g i n t e r a c t i o n s o f t h e b i n d i n g s i t e s . 3 . m o l e c u l a r l y i m p r i n t e d p o l y m e r s b a s e d o n p h o t o g r a ft i n g s u r f a c e - m o d i fi e d n 南开大学硕士研究生学位论文 p o l y 均r r e n e b e a d s a s m a t ri c e s w e r e p r e p a r e d u s i n g b o v i n e h e m o g l o b i n a s t e m p l a t e m o l e c u l e i n a p h o s p h a t e b u ff e r . t h e r e s u lt s o f i r , s c a m t i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e a n d e l e m e n t a l a n a l y s i s d e m o n s t r a t e d t h e f o r m a t i o n o f a g r a ft i n g p o l y m e r l a y e r o n t h e p o l y s t y r e n e - b e a d s u r f a c e . a n d t h e a d s o r p t i o n s t u d i e s s h o w e d t h e i m p r i n t e d p o l y m e r s h a d g o o d a d s o r p t i o n c a p a c i t y a n d s p e c ifi c r e c o g n i t i o n f o r b o v i n e h e m o g l o b i n a s t e m p l a t e m o l e c u l e . b a s e d o n t h e s e , a m o d e l w h i c h c a n s e l e c t i v e l y e n r i c h t h e t e m p l a t e p r o t e i n i n m i x e d p r o t e i n s c o u l d b e f a b r i c a t e d k e y w o r d s : m o l e c u l a r l y i m p r i n t i n g t e c h n o l o g y , b o v i n e h e m o g l o b i n , p o l y a c 州a m i d e g e l , p h o t o g r a ft i n g , i n i f e r t e r 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文; 学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务; 学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版; 在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适 当复制论文 的部分或全部内容用 于学术活动。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 盖 林 坷 年 t 月1 1 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名: 哪 学位论文作者签名: m 解密时间: 年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 标 5 ( t 雨v-, 沥5 ?f 石 一墨墨jf,识别性 是因 为im i;是根据印 迹分子( i m p r i n t e d m o l e c u l e ) 定做的， 它具有特殊的 分子 结构和官能团，能选择性地识别印迹分子;其实用性表现在它与天然的生物分 子识别系统如酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比，具有抗恶劣环境的能 力，表现出高度的稳定性和长的使用寿命，且制备过程简单。由于分子印迹聚 合物具有以上这些优点，它在许多领域，如色谱中对映体与异构体的分离、固 相萃取、化学仿生传感器、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离技术等领域展 现了良好的应用前景。 1 . 1 . 2 分子印迹技术的墓本原理 分子印迹技术是制备具有分子识别作用的客体化合物的技术， 将模板分子 与功能单体相互作用形成超分子复合物，在交联剂作用下形成聚合物，然后在 一定条件下除去模板分子， 得到带有与模板分子空间结构互补的识别位点的分 子印迹聚合物，如图 1 . 1 所示。该识别位点具有 “ 记忆”功能， 可以选择性地键 合待分离混合物中的 模板分子，从而达到分离、纯化的目的。 分子印迹制备过程可分为三步:第一步，模板分子与带有烯键的功能单体 ( mo n o m e r ) 在溶剂中通过各自的功能基团形成在空间结构上互补的复合物: 第 二步， 在复合物溶液中加入带有两个或两个以 上烯键的交联剂 ( c r o s s l i n k e r ) 和 引发剂 i n i t i a t o r ) ， 通过光或热的作用引发聚合反应， 使功能单体与交联剂在模 板分子周围形成网状高分子聚合物: 第三步， 通过一定手段 ( 如抽提，解离) 使模板分子与聚合物分离，在聚合物上留下与印迹分子在三维空间上匹配且具 有特定识别位点的孔穴. 在整个合成过程中，模板分子与烯类单体间结合力的大小决定着聚合物的 识别能力。根据印迹分子与功能单体之间形成配合物时作用力的性质，分子印 迹聚合物的制备过程分为共价键作用和非共价键作用两种。m a s b a c h k将它们 相 应 地 分 为 预 组 装( p re - o r g a n i z e d a p p r o a c h ) 和自 组 装( s e l f - a s s e m b l y a p p r o a c h ) 方式。 第一章绪论 关，但是可以根据蛋白质在其中所担任的角色不同加以区分，指蛋白质可作为 生物印 迹过程中的基质， 也可作为 模板分子(4 7 1 .本文主 要是 指后者，即蛋白 质 在合成材料中作为模板分子形成对模板分子有特异性键合性质的聚合物。以下 内 容对当前蛋白 质印 迹的研究成果和现状进行了 介绍。 一般地， 蛋白质印迹方法分为2 d和3 d法。 2 d印迹是指将模板蛋白限制在 印 迹材料表面进行印 迹的体系; 而3 d印迹是指在本体聚合中通过嵌套模板分子 产生印迹效果的方法。 1 . 2 . 2 . 1 蛋白质3 d印迹: 丙烯酿胺、水凝胶、溶胶一 凝胶和混合物 3 d蛋白 质印 迹法的主要问 题是如何有效地从印迹聚合物中除去模板分子。 任何印迹体系的根本要求都是模板蛋白能够自由地进出印迹位点，设计标准主 要是使用各种基质来控制孔隙率和孔的大小。 1 . 2 . 2 . 1 . 1 3 d丙烯酞胺印迹 许多 研究是使用传统 ( 甲 基) 丙烯酸胺类物质来制备蛋白 质印 迹的ml p s 1 0 然而，该方法的主要局限性是蛋白质在传统方法所用的有机溶剂中是不溶的。 此外，蛋白质在非水介质中的分解或扩散会使其结构形态与水溶液中的不同。 因此，一些研究小组用水溶性丙烯酸单体，本体聚合法制备了水凝胶 lu ll ，其 组成与电泳凝胶类似。 v a i d y a ( 6 等人 用a a m和b i s a印 迹了 胰岛 素 分子。 在d m f 和水的 混合 溶 液 中，胰岛素与聚合引发剂 n - 丙烯酞对氨基苯胖 ( 作为特殊的单体)发生聚合反 应，用丙酮从制备的凝胶中洗脱蛋白质。在保持印迹位点完整性和合适孔的尺 寸允许蛋白质最大t通过时， 优化交联剂浓度确保凝胶溶胀最小化。溶液损耗 ( d e p le t i o n ) 实验显 示了 对 胰岛 素的 键 合特性， 而 且 模板蛋白 在胰岛 素 和胰岛 素 蛋白 酶的 混合竞争键合实验中是有利的。体系的s c a t c h a r d 分析表明印迹聚合物 起到了 与真正受体一样的作用 ( 直线表示选择性键合) ，非印迹聚合物表现出亲 和色谱的性质，为非线性的，因此是非选择性键合。 类 似 地， h j e r t e n 研 究 小 组 s a e 6 1 ， 以 蛋白 质为 模 板， a a m和n n - m b i s a为 单体生成凝胶。 将凝胶过筛， 得到的颗粒填装色谱柱， h o a c 和十二烷基硫酸钠 ( s d s ) 的馄合溶液洗脱模板蛋白。 当含有模板蛋白的多种蛋白 上样时， 模板蛋 白 被选择性吸附. 这个方 法先后 用于牛血红蛋白( h b ) 、 细胞色素c ( c y c ) 、 铁 第一章绪论 传递蛋白( t o 、 人类生长 激素( h g h ) 、 核糖核酸酶( r n a s e ) 和马 肌红蛋白( m b ) 阴的 制备。 假设在凝胶和蛋白 质之间形成大量弱的 静电 相互作用力，总的相互 作用增强，因此印迹比较成功。而传统印迹理论解释为少而强的键比多而弱的 键形成的印 迹聚合物效果 好，两者说法不同. h j e r te n理论从小蛋白 质的印 迹特 异性键合实验来看是有合理性的，但是，在同样的凝胶上，小蛋白的吸附量比 大蛋白的小 ( 蛋白 质越大，表面积越大，因此与凝胶相互作用越多) 。 p a n g (6 71 用 反 相 悬 浮 聚 合 物 法 制备了 以 牛 血 清 蛋白( b s a ) 为 模 板 的甲 墓 丙 烯 酸凝胶球，得到了有良 好大孔结构的均匀球形颗粒，这对蛋白质进出聚合物是 极其有利的。实验结果表明，印迹聚合物微球与非印迹聚合物相比吸附量大， 更重要的是对模板蛋白 b s a ( mw 6 7 k d , p l 4 .8 ) 和竞争蛋白卵清蛋白 ( o b ) ( m w 4 4 k d , p l 4 .5 ) 间的 分离因子 a 达到 4 .7 1 。 作者认为这是空间因素和多点 静电 相互作用的结果， 这与h j e rt e n 的理论一致。 g u o w 以 大 孔交联的 壳聚糖球为 基质， 用丙 烯酞胺凝 胶印 迹了 h b 。 聚合之 前， 丙烯酞胺和蛋白 质扩散到壳聚糖孔中， 之后a c o h / s d s 溶液洗脱蛋白质。 实 验表明，印 迹壳聚糖球比非印 迹壳聚糖球/ 丙烯酞胺球，对模板分子有更好的吸 附容 f和 选择性。 进一步将壳聚糖球填入色谱柱， 对h b 和 b s a 显示了 选择性圆. 同时也表明，在印迹过程中，加入壳聚糖有助于提高球的机械稳定性。 h u a n g 0 等 人提出 了 两 性印 迹聚 合 物用 于蛋白 质的 分 离。 在磷酸 缓 冲溶 液 中， 两种功能单体( m a a 和n - 3 一 二甲 基氨基丙基甲 基丙烯酞胺) ， 交联剂( b i s a ) 和致孔剂c a c o 3 ， 分别制备了 b s a 和溶菌酶 ( l y z )的印迹聚合物。 然后用酸除 去c a c o 3 ， 用链霉蛋白 酶分解模板蛋白。 这样得到的聚合物用作色谱固定相， 并 评价其吸附容量和选择性。 结果显示， l y z 优先键合到l y z 印迹聚合物上， 而b s a 却在b s a 印 迹的聚合物上没有出现类似的结果。 这是协同多点相互作用的结果。 oun 等人进一步报道了 用m a a 和a a m 作功能单体， 2 一 二甲基氨基乙 烷基甲 墓丙烯酸盐为交联剂， 印迹l y z 的方法。 生成的聚合物湿态过筛， 然后依次用二 次水、 n a c l 溶液和二次水洗脱模板分子 ( 这种温和洗脱条件与琦 e r t e n (m ) 和 h u a n g ) 报 道的 酸 洗 步 骤 形成了 对比) . 聚合物 凝胶 冷冻 干 燥， 进行溶液 d e p l e t i o n 实验。 印迹聚合物的选择性印迹因子为1 . 8 3 - 3 . 3 8 ( 印迹因子定义为印迹聚合物对 蛋白 质的吸附量与非印 迹聚合物对蛋白 质的吸附t之比) 。 但是，由 于聚合物也 能从蛋白 质溶液中键合吸附血清蛋白， 这种键合也并非严格地符合模板特异性。 通过洗脱过程， 仍有大于2 5 %的原始模板残留 在聚合物中。 第一章绪论 丙烯酞胺类物质能在水相中印迹蛋白质，主要是因为它能形成低交联度的 凝胶聚合物，确保蛋白质大分子能够自由地进出。从上述方法中， 我们得到一 些成功的例子，但是交联度低的材料很容易丧失印迹性质，并且一般也会因环 境的改 变而变的不稳定is o .丙 烯酞胺 类物质也在选择合适的单体上受到限制， 这些缺点促使我们寻找新型的印迹材料。 1 . 2 . 2 . 1 . 2 3 d 水凝胶印迹 近年来，合成了一种新型可溶胀的聚合物水凝胶，这种受刺激响应的 凝胶能 在膨胀和收缩的两相中发生可逆的体积变 化，而温度、 溶剂组 成、 p h , 离子强度、光和特殊的化学物质等也会刺激凝胶，使它发生类似的变化。这种 凝胶被称作“ s m a rt 凝胶，一般用在控制释放体系、制动器和传感器中，也有用 作人工肌肉的例子阁。这些反应在控制蛋白 质的特异性键合方面是有价值的， 并做了 各种努力，尝试将水凝胶与分子印迹相结合来制备酶特性的水凝胶。 k a r m a l k a r 报道了 一种金属配体介质法， 在水凝胶基质中定 位咪哇、 狡基 和经基来模拟一类丝氨酸蛋白酶 ( 比如:a - 胰凝乳蛋白酶) 。洗脱模板分子2 一 异 丁酞氨癸酞基一 l 一 苯丙烯一氮基毗睫，通过对硝基苯酣水解的监测，来测定该聚 合物的催化性质。 结果表明， 印迹聚合物的催化水解速率与a 一 胰凝乳蛋白酶的催 化水解速率较接近，而非印迹水凝胶只表现出轻微的活性。 k o i n a s cu 组报道了 对菊萄糖磷酸的聚丙烯酸氢氧化物的非共价分子印 迹， 制备了能够定童特异性识别荀萄糖异构体的mi p 水凝胶。 离子间相互作用形成预 聚合络合物， 表氯醇的加入发生了交联。印迹葡萄糖的mi p 水凝胶对模板葡萄糖 的选择性键合要比对果糖的好。 w a t a n a b e l0s 以 a a 为 交联剂， 与 n - 异丙 基丙 烯酞胺发生共聚， 合成了 包括以 去甲肾上腺素在内的多种分子为模板分子的温度敏感型水凝胶。洗脱模板分子 后，该水凝胶在温度低于较低临界溶液温度时表现出溶胀特性，而在更高温度 下表现为收缩的特性。低温下的溶胀凝胶置于模板溶液中不会再发生膨胀，而 收缩商温水凝胶会随着模板浓度的增大继续膨胀，这意味着收缩态的水凝胶能 记忆模板分子，而膨胀态的水凝胶则不能。 尽管水凝胶目 前仅用于小分子的印迹， 但是其膨胀能力会有利于去除对照 蛋白， 因 此印 迹水凝胶为蛋白 质存在的 包埋问 题提供了一个可行的解决 方案圃. 一些研究小组进一步报道了 将水凝胶材料做为蛋白 质传输剂，这种体系的主要 第一章绪论 指标就是蛋白 质包埋a 。 通过对蛋白 质的封装和包埋处理， 在较宽材料范围 内， 蛋白质能维持并保留生物活性刘。 尤其证实了， 溶胶一 凝胶化学是制备掺 杂聚合物的理想方法 . g i l l 和b a l l e s t e r o s 10 针对大分子化合物的 封装和包埋发 展了多孔溶胶一 凝胶。这些聚甘油基硅酸盐类聚合物与传统溶胶一 凝胶相比体现 了更高的稳定性，这种稳定性与特殊要求的高孔率相结合有利于对印迹过程的 发生。 1 . 2 . 2 . 1 . 3 3 d 溶胶一 凝胶蛋白 质印迹 溶胶一 凝胶通过对蛋白 质的 封装和包埋，能特异性地与各种蛋白 质相互作用 t n . 网 。 溶胶一 凝胶能 在水相中发生温和地聚合发应，可用于蛋白 质分子印迹。 v e n t o n l 0 0 在聚硅氧烷共聚物中， 用3 - 氨丙基三乙 氧基硅烷和四乙 基正硅酸 盐制备了尿素和b s a 的印迹聚合物。 生成块状整体聚合物， 经研磨后， 链霉蛋白 酶消化酶解除去包埋的蛋白质。与对照蛋白相比，印迹聚合物对其相应模板分 子显示了更强的亲和性， 在两种蛋白 之间表现出了选择性。 然而， v e n t o n 小组t网 所做的另一组以 h b 和mb 为模板分子的类似研究中，m p却未能表现出任何印迹 效果。 标记蛋白的再键合实验表明 键合蛋白与溶液中标记蛋白不平衡，惫味着 聚合物与模板分子之间存在强作用力，可能掩盖了聚合物的特异性。尿素释放 t测定表明，在特异性m : 与其模板蛋白 h b 和mb )存在下，当特异性模板缔 合所释放的尿素it比 其他蛋白的少时，则发生了 特异性印迹。该工作中没有提 到孔率的影响，但结果显示仍有2 5 %的蛋白 质残留在聚合物基质中。 综上所述，溶胶一 凝胶反应因其制备条件温和，水溶性好，适合蛋白质的印 迹。然而，蛋白质的本体印迹似乎局限于上述的例子。这可能是因为生成的溶 胶一 凝胶结构紧密， 需要研磨来暴露识别位点，而机械研磨过程会破坏较大的识 别位点，很大程度上也就减小了 对大分子的特异性。 1 . 2 . 2 . 1 . 4 3 d 混合- d n a 蛋白质印迹 已 知，蛋白 质与 d n a 间的 相互作用有很强的特异性. u m e n o 提出了 一 种 印迹蛋白质的新方法， 即用表面聚合的d n a 链来识别蛋白质。 设计合成了与d n a 相互作用的温度敏感型单体，该单体与 d n a 链形成一个共扼体 ( 光引发d n a 与 补骨脂素末端基团的反应) o d n a 链表面形成的共辘聚合物， 对与 d n a 作用的蛋 白 质形成了 一种阻塞效应， 利用这种效应， 在形成共扼聚合物之前， 首先使d n a 第一章绪论 与核酸内切酶发生作用，印迹产生e c o r l ( 一种限制酶) 的印迹位点。 图1 . 2 给出 了对e c o r l 有特异性键合位点的印迹过程. 这种新方法首先使d n a 与目 标蛋白 相 互作用，形成识别位点，在d n a 链上的其他部位形成聚合物，除去模板蛋白后， 对模板蛋白 显示了 选择性。尽管这种方法实际应用还存在很大的局限性 ( 可用 在d n a - 键合蛋白的分离上) ，但却对mi p s 提出了一种特殊的仿生方法。 针对蛋白质印迹提出的各种方法，看到传统本体与混合物分子印迹法在特 异性蛋白 包埋和分离方面是有潜力的。但是，还未考察过这种体系做生物传感 器的稳定性如何。为了满足蛋白质质量传输的需要，印迹材料通常采用具有高 孔率的凝胶，但是这意味着与传统整体印迹材料相比， 交联度低，稳定性差。 而且环境变化也会影响凝胶的性质，甚至某些情况下会造成孔的坍塌，功能团 的永久丧失。此外，大强度的洗脱条件 ( 酸、酶)也会影响凝胶的功能。因此 表面印迹成为印迹大分子模板如蛋白质更加合适的方法。 r w ao w 剔一一 图1 .2 d n a 骨架上印迹蛋白质 1 . 2 . 2 . 2 蛋白质2 d 印 迹:表面与界面设计 模板大分子所用的本体印迹材料兼容性是有限的，可以选择在薄膜或支撑 物表面生成印 迹聚合 物14 1。 这种2 d 或表面方法能使大分子自 由 进出 键合 位点， 使 蛋白 质的特异性表面成为印迹的目 标 ( 固定点) 。然而，由 于仅能识别蛋白 质表 面的一部分， 所以 2 d 方法的特异性并不高， 键合位点的各向异性会相对提高。 但是这种方法具有质量传递好、与传感器平台相结合的优势，使得对表面印 迹 第一章绪论 的关注越来越多，也有一些对表面印迹新方法的相关报道。 1 . 2 . 2 . 2 . 1 2 d 溶胶一 凝胶印迹 m o s b a c h 2 1 小组首次成功报道了蛋白 质印迹， 提出了在多孔硅球表面印迹t f 的表面涂层印迹聚合物的方法。水相中，在多孔硅球表面硅烷化合物发生聚合 反应，其中包括一种与t f m碳水化合物作用的新型硼化硅烷。 h p l c 实验表明t f 印 迹的聚合物对模板蛋白的亲和性高于对b s a 的 ( 相对保留值为2 . 1 6 ) 。同时， 比较了涂层球与经研磨粉碎同样混合物制备的本体材料的性质，结果表明，涂 层球有更好的酶的性质 ( 球表面印迹的硅烷为4 0 %，而研磨粉碎后的材料仅为 5 %) 。这说明表面包埋印迹蛋白 质优于本体聚合。 s h i o m i 0 1 通过亚胺键将h b 共价固定在二氧化硅上印迹了多孔二 氧化硅。印 迹完成后，草酸破坏蛋白质与二氧化硅间形成的共价键，从而洗脱蛋白 质。研 究了 h b 和竞争蛋白的再键合性质，发现这种印迹聚合物比h b 自由存在溶液中时 形成的聚合物对印迹分子有更好的吸附选择性。实验结果表明，键合亲和性与 蛋白 质的 等电 点( p 1 ) 、 体积大 小 和 键 合位点 本身的 性质有关( 形 状、 疏水 性) . 尽管，溶胶一 凝胶用于蛋白 质相互作用、蛋白 质包埋阅、传感器和电 化学阅 相结合的例子有很多，但是溶胶一 凝胶蛋白 质印迹 ( 2 d 或者3 d)的报道却很少。 1 . 2 . 2 . 2 . 2 2 d 金属配位 关于金属离子及其在印迹聚合物中配位特异性键合作用已作过了 评价 n 1 通过将有利的基团与聚合物结构相结合，蛋白质残荃与金属离子的相互作用来 实现对模板蛋白的特异性。 m a l l i k 0 7 等人通过咪哇使金属离子与组胺酸 ( h i s )残基配位，并考察了一 系列能形成配位蛋白 质合成受体双眯哇的蛋白 类似物 ( 两个咪哇基通过有机间 隔 基 相 连) 。 类 似 地， k e m p e 1 报 道了 一 种 表 面 印 迹 法 来 制备 h p l c 分 离 中 蛋白 质 的选择性吸附剂。 制备过程中用到了 金属鳌合单体 ( v b i d a ) 、甲 基丙 烯酸衍生 化硅球、 r n a s e a 和金属离子。 用同 样方法制备了 b s a 印 迹的聚合物。 通过与 c u e 配位， 暴露在h i s 残基表面的咪哇基能够与单体v b ma 相结合。当发生聚合反应 时， 金属 键合受体要以 精 确合适的 距离定位在硅胶表面， 才能在c u e 存在 下 选择 性键合蛋白 质 ( 图1 . 3 ) 。 这种方法能从r n a s e a 和l y z 的混合物中识别 r n a s e a a 然而， 这种方法仅局限与表面有h i s 残基裸露的蛋白 质，对蛋白 质印迹没有普遍 第一章绪论 应用性。 知如曰目比 妞钾加 加 .加 . 肠. 一-奋 甲白:二 加 .侧州 .甲. 魂 因饱目 目 幽 目. .目 目帕 曲 . 伽目白 . 图1 .3 修饰硅球表面产生 r n a s e a 的键合位点 1 . 2 . 2 . 2 . 3 2 d 丙烯酞胺化学 b u r o w l 0 1 利用丙 烯酞胺在官能化氧化 硅球基质上印 迹葡糖氧化酶 ( g o ) . 以蛋白 质为模板分子，两种交联剂 ( m b i s a 和n n 一 二经基乙烯荃二丙烯酞胺) 和两种功能 ( a a m 和a a ) 单体相混合，在活化硅球表面发生聚合发应，形成一 薄层聚合物. 再键合实验表明g o 与b s a 相比 对印迹蛋白 g o 显示了选择性。 识别 效应的产生是模板蛋白与聚合物间弱静电相互作用和形状互补的结果侧. h ir a y a m a 报道了用同 样方法制备的l y z 印迹聚合物，实验结果表明， l y z 与 h b 相比， 该聚合物虽然对两种蛋白 均有非特异性键合， 但仍对l y z 表现了一定的特 异性7 1) 以上方法，讨论了目 标位点在蛋白质表面的情况。根据空间位阻性质和结 构互补效应， 形成大量 相互作 用位点产生了 特异性。 it a c h k o v , 3 发展了 另一 种 方法“ 抗原决定基” 法，该法中聚合反应所用的模板分子不是整个蛋白， 而是一段能代表较大多肚或蛋白 一部分的短肤，就好象在免疫学中一个抗原决 定基能代表一个抗原一 样 ( 图1 .4 ) . 从方法上看， 这个方法并不像传统意义上印 迹蛋白质，但它的最终目 标却是获得对母体分子的识别。 该法的印迹程序更像有机相中，分别以 m a a 和e g d m a 为功能单体和交联 剂的传统印迹方法。 以 四肚-y p l g 为棋板的分子印迹聚合物实现了 对后叶催产 第一章绪论 素一九肤的选择性识别。四肤和九肤在c 一 端都有着一样的三氨基酸序列。这就 使得聚合物与蛋白质部分形成特异性强的相互作用，而不是靠整个蛋白质分子 上大量弱相互作用实现的，因此，理论上讲，这能提高聚合物的特异性和亲和 性。由于小肤不像整个蛋白质那样存在构象变化和降解的问题，考虑使用有机 相中的传统印迹方法。实验结果说明这种方法制备的聚合物对模板分子有较高 的选择性和亲和性。然而，当用血管紧缩素n 一八肤在水相中重复该方法时， 生成的聚合物对八肤有保留，但对它的母体蛋白 血管紧缩素1 1 却根本没有键合 作 用 ass c o m p le x ; ia n 0 月 p d y m n n 翻 o n 助闭 p 侧 口 1 血 ， 翻 . 栩 . 口.0脚， 妇 由 口. 公公胭勺.目 卜 . 目. 上 “ ” 而 ， 哈一- 伟 比 1 川if 图1 . 4 抗原决定基法的示意图 近来， 开始了 基于 r a c h k o v 的“ 抗原决定荃” 法的 商业化生产。 a s p i r a 生物 体 系 设 计了“ 蛋白 质印 迹” 技 术(, e . g 7 . h i r a y a m a u 等 提出 ， 合 成 序列与 蛋白 质一 部分相对应的小肚用作模板分子，在聚合物或球的表面形成能够孔穴来识别整 个蛋白 质. a s p i r e 计划在市场上销售用于分离分析能 识别单个蛋白 或不同 类蛋白 的 膜97 1 。 这种膜是带有特异性序列位置的 平板聚合 物表面，其中每个位置都有 多键合位点。 他们的专利技术宣称，这种高亲和性膜能捕获单一蛋白质或印迹 的微排列能捕获一类蛋白 质% j 尽管，丙烯酞胺化学被认为是目 前最普遍和通用的印 迹技术，但是我们从 上面的实例中看到，它并不是印迹蛋白质的理想方法。印迹蛋白还有许多材料 1 6- 第一章绪论 能供选择，有些小组就采用非丙烯酞胺基质来印迹蛋白质。 1 . 3 蛋白质印迹的结论与未来展望 1 . 3 . 1 结论 对蛋白质印迹已成事实。但是有关蛋白 质印迹的报道在分子印迹领域中所 占比 例不足2 %， 其关注点依旧停留在生物活性差上。 这也是蛋白 质印迹的 本质 难点，尤其在抗体识别，免疫亲和柱， e l a s a和分离凝胶这样的竞争性技术逐 渐商业化的情况下。 印迹的主要障碍是模板分子的大小与位阻影响。本体聚合中，大分子作为 模板分子，孔隙率高的聚合物才能达到较好的质量传递效果。反过来，这些高 孔隙率削弱了聚合物的结构，使其稳定性和实用性变差。一般来说，本体聚合 印迹蛋白质的丙烯酞胺材料趋向于得到内部分布识别位点的低交联聚合物ca . 6 1- 6 5 . 胡 。 该聚合物有利于质量传递， 且其水凝胶结构能在除去模板和再吸附时发 生 膨 胀. 环 境的 变 化改 变 孔的 大 小 ， 这 一 点 是 十 分 有 利的 ， 在p a n g (5 7 1 实 验 条 件 下就很清楚的表现出丙烯酞胺球的大孔结构。水凝胶技术的出现使对蛋白质的 特异性印迹成为了可能。例如，这些材料用作药物传输剂意味着通过改变环境 条件， 该材料本身的降解或其孔径的变化能够以 确定的速率释放模板，但其不 稳定性和功能基团的丧失对分离是不利的。交联度高时，稳定性和功能团保持 较好， 成功印迹模板分子的机会较大;相反，高交联度限制了聚合物的应用范 围 ( 模板可能会渗漏，总容量也会下降) 。当然，v e n t o n 报道的传统高交联度 聚合物，尽管也显示了对蛋白质的识别作用，但很明显，仍有大量的蛋白 质残 留在聚合物中，这一点证明了孔隙率的重要性。 薄膜或表面印迹法制备的聚合物能很大程度上减小模板分子的空间位阻， 但也存在部分印 迹产生 位点异性的问 题。 目 前， 以 球阳、 玻璃(,e 1 或者聚苯乙 烯叫 作基质时得到的聚合物证实了3 d凝胶的稳定性。然而， 2 d印迹会降低材料的 总容量，限制了其在高体积分离环境下的实际应用。 水相中的分子印迹限制功能单体、交联剂和聚合方法的选择。 传统的分子 印 迹一般不在水相中进行，因为水分子会破坏模板和功能单体间形成的氢键u 5 第一章绪论 制备聚合物的条件一般都是要仔细考虑的，理论上讲，水分子的存在不利于模 板 键 合 ， 而 且 像p h . 离 子 强 度 、 温 度 等 环 境 的 变 化 也 会 影 响 聚 合 物 的 性 能 17 . n 1 本文提到两种方法来克服蛋白 质印迹存在的问题，第一，是目 前已知水溶 液法;第二，是在有机溶剂中以一段肤链为模板，来识别整个蛋白质的传统方 法侧。由 于蛋白 质体积庞大， 相互 作用的 位点数多， 水分子的竞争显得比 较微 弱， 所以 水分子的存在似乎对蛋白 质/ 聚合物相互作用的影响不是十分严重。 我们知道，当相互作用位点数少且相互作用强时，mi p s 显示出最大程度的 选择性. 多点弱相互作用生成的m i p s 特异性较差， 非特异性键合明显 1+ 1 。印迹 热力学理论上表明刚性结构较差的蛋白质模板在其相应的基质中产生的识别位 点数较少圆.理论上，蛋白 质表面积增加，模板与功能单体的相互作用数也会 增加，但这种相互作用弱且特异性差。当蛋白质和聚合物间的相互作用位点数 多时， 非特异性作用增加， 这就产生了位点异性。 从文献中知道， 形 成印 迹的 最好方法有两种。 h j e r te n提出当 模板大分子的 空间因素有利于识别、 排列过程时， 弱且多 种方法能够产生选择性。 h j e rt e n 1 的3 d凝 胶实验数据和其它大量静电 相互作用【网 证实了 这点。 d l n u v 0 8 21 提到的 方法是空间因素影响的疏水相互作用在提高模板分子键合方面起重要作用。这 与通过聚焦相互作用产生特异性的方法是不一样的。例如，抗原决定基法是利 用模板的一部分实现对整个模板的 选择性识别刘 。间 氨基苯硼酸 ( a p b a ) 叫 和金属鳌合u v l 聚合物他们的表面都有各自 特异性目 标墓团， a p b a聚合物表面有 经基， 金属鳌合聚合物表面有h i s 残基， 这些特殊的基团能够产生较强的特异性 相互作用。但即便如此，却始终没有一种方法有十分显著的优势。 分子印迹领域中，大多数工作集中在有生物活性的小分子上，同时集中发 展对模板分子有独特高亲和能力的印 迹材料。我们对蛋白质大分子和小分子的 识 别 性质 做个比 较: m i p : 对生物素 的 离解常数( 筋) 范围 从1 . 4 - 1 6 . 8 n m ， 对 微 胧 氨 酸l r 的肠为0 .3 n m 2 ， 对 雌 二 酮的局为0 .4 4 - 6 .6 n m 0 ; b o s s i 用a p b a 作 基 质d 2 1 ， 制 备聚合 物 对 微过氧 化酶、 乳过 氧化酶 和血红 素的局分别为1 .5 1 lm . 0 . 5 4 哪 和0 .0 5 6 p .m。 以 上数 据我 们看出， 蛋白 质的 数据 要比 小分 子的 数 据小 一 个数量级。 这并不奇怪，因为与制备方法成熟、操作简单的小分子体系相比， 我们对蛋白 质大分子印迹尚缺乏进一步的研究，尚未得到优化的蛋白 质体系。 同 样地， 与其他大分子相比， 有些体系佃 ， 川 虽然显示了 对蛋白 质的 特异性识别， 但是要从竞争大分子的混合体系中分离得到模板分子还是比较困难的，成功的 第一章绪论 例子较少网. 而对于小分子， 很多实 验数据说明n f lis能从其对应异构体中 成功 分离出 模板分子(66 . la i n 。 本文中提到的体系 均在提高 对模板分子的吸附i上作了 研究，但真正体现对模板分子有印迹效果的竞争吸附才是最终的衡量指标。有 些数据表明高交叉反应不利于模板选择性的提高( so , r t l ，这就降低了相应材料的 实际 应用 价值。 也 有数据表明，协同 键合(; l 与模板聚集(e 11 也会影响印 迹位点的 形成。单分子蛋白与聚集蛋白的特异性识别位点是不同的。对聚集蛋白而言， 形成印迹位点的同时会造成位点各向异性和功能基的丧失。此外，溶液状态、 p h 、 离子强 度、 温度 等微小的变化也会引 起蛋白 质聚集， 所以印 迹过程中的 环 境因素也是需要考虑的因素。 这里提到的例子，在洗脱模板分子时，洗脱条件都十分的苛刻，用酸、去 污剂和酶解的方法来洗脱，这些条件会造成聚合物结构的变化，影响聚合物的 识别能 力53 . 0! 1事实 上， 聚合 物用酶解的方法处理1 6 0 h 的过程在商业化上是不 可行的侧，这些步 骤对聚合物的 识别是十分关键的，比 如说， 我们必须 保证去 污剂s d s完全被冲洗干净，才能保证不影响再键合过程。而温和的洗脱方式又 会造成大童模板分子残留在聚合物中. 1 . 3 . 2 蛋白质印迹的未来展望 本文中 提到的3 d和2 d蛋白 质印迹在设计上都是一流的 5 1 . ! ! . i ，其印 迹聚 合物表现了良 好的亲和性和特异性. 然而， 其中有些方法操作复杂、 费时费力圆、 缺乏普遍的应用价值侧，稳定性较差。由于蛋白 质性质复杂多变 ( 蛋白质很多 性质在生物学上是十分重要的) ，目前尚没有一种普遍通用的方法来印迹蛋白 质。虽然有些方法能够印迹多种目 标物，但仍存在很多缺陷。因此，我们豁要 进一步 扩展每种方 法适用的 蛋白 质范围。目 前， 虽然凝胶一 溶胶印迹蛋白 质93 ;使 用范围相对较宽，但也只有三篇文章有类似的报道。 至今， 仅有小 生物分子的iv i i p s 实现了 商业化(t o . c o l 。 而对抗体有识别性且重 现性好的生物材料对医疗设施、生物标记、药物传输、