免疫印迹法的实验技术课件.ppt

免疫印迹法的实验技术（WesternBlot印迹方法）,一、Western-Blot简介,WesternBlot，又称为免疫印迹（Immunoblot）,是70年代末80年代初发展起来的蛋白质测定技术。蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治斯塔克（GeorgeStark）。在尼尔伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的分析生物化学（AnalyticalBiochemistry）中首次被称为WesternBlot。,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。WesternBlot印迹方法，是检测蛋白质混合液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。,实验主要内容：,实验原理,将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶【SDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS-PAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物（硝酸纤维素膜或PVDF膜）上用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合用ECL发光或DAB显色检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄色条带蛋白条带。,WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,实验用途用于检测样品中特异性蛋白质是否存在。对特异性蛋白质进行半定量分析。,蛋白免疫印迹组成,凝胶电泳,1,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带,2,把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上,样品的印迹,3,用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原,免疫学检测,实验步骤,提取细胞或组织蛋白测定蛋白含量制备SDS-PAGE胶蛋白变性、上样电泳转膜封闭一抗TBST洗膜HRP标记的二抗TBST洗膜ECL底物显色X光片曝光、显色结果分析,二、蛋白样本的制备和浓度的测定,蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白的提取组织蛋白提取组织和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解）按比例配制-置于玻璃匀浆器中，充分研磨（冰上操作）4离心，12000rpm，10min取上清分装1.5ml离心管中20保存。（低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解。）蛋白酶抑制剂：如PMSF、EDTA、EGTA等，要根据具体情况具体选择。,注意事项注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗。所用离心机需提前预冷。为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。,蛋白浓度的测定,原因：WesternBlot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含量测定。蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力。,方法：,目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法Bradford法）。目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如BCA法试剂盒.,BCA法工作原理,BCA(bicinchoninicacid二辛可酸)法测定蛋白质的原理与Lowery法相似。即在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nM处有最大光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂等影响小。,SDS-PAGE电泳,SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法。原理1在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。2在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合（1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。,实验前的准备,设备和材料的准备:电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽)、电泳仪的准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、烧杯、量筒试剂的准备和配置:双蒸水、30%丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为8.8)、Tris-HCl(PH为6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲液、电泳缓冲液、蛋白Marker,根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度.（一般浓缩胶为5%，分离胶根据所测蛋白分子量定）,作用,浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）（0.5-1cm）。分离胶：由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。(PH为8.8),实验步骤,组装SDS-PAGE凝胶用玻璃槽配制和灌注分离胶用水压线30-40分钟直至分离胶凝固倒掉压线水配制和灌注浓缩胶插入样品梳凝胶直至浓缩胶凝固制备样品样品:上样缓冲液=4:1,混匀1000C加热5分钟,离心取上清)拔出样品梳加入电泳缓冲液,上样，电泳电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止,夹心式垂直电泳槽,蛋白变性的原因上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液的混合物，按比例配制，100煮5min。其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷。,注意事项,玻璃板要清洁,对齐卡严，防止漏胶。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩.过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制.溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中.浓缩胶缓冲液(PH为6.8)、分离胶缓冲液(PH8.8)，PH值要准确。胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓慢,避免有气泡的产生.为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的电泳上样缓冲液.正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由上向下方向电泳。,说明：不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。,2019/12/15,25,可编辑,四、转膜,蛋白质印迹法就是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相支持物上。常用的固相支持物有NC（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性，价格比NC膜要贵。NC膜更常用。,附：膜的选择主要根据：膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量）膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）有两种规格：0.45um和0.2um（forMW20kDa)。不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显色方法）,转膜通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。电泳印迹效率更高。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成三明治形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在膜上。转移后的膜就称为一个印（blot），用于对蛋白质的进一步检测。,实验前的准备,设备和材料的准备:转移电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽)、转移电泳仪的准备、膜、滤纸、海绵垫、玻璃棒试剂的准备和配置:电转液、甲醇（PVDF膜）、（考马斯亮蓝染色液、丽春红染色液）,根据待测样品的蛋白质分子量选择转移的电流大小及时间.我们通常200mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间(h)80-1408%1.5-2.025-8010%1.5154012%0.752015%0.5,实验步骤,NC膜预处理：（剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1转移缓冲液平衡5分钟以上。注意：必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，避免手上蛋白将膜污染。）剪裁6层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同时4层海绵垫也用转移液浸泡。取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转移液中。转膜制作“三明治”：由夹子的黑板（阴极）侧开始，依次为黑板海绵垫片3层滤纸胶NC膜三层滤纸（注意：排除气泡）海绵垫片(阳极)，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。,正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作宜在4进行）。小心取出转移膜，做好标记，在1TBST液中漂洗两次。（用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全,用丽春红染色液膜,检测蛋白质是否转移到膜上.）,打开转膜夹板，由阴极侧海绵垫片3层滤纸样品凝胶NC膜三层滤纸（排除气泡）海绵垫片阳极侧,实验注意事项,PVDF膜需100%甲醇预处理，再用缓冲液平衡，才能用。必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中,滤纸要充分浸于转移缓冲液中.操作要轻，避免胶膜的破损。记住“黑面胶，白面膜”，夹子的黑面朝架子的黑面。必须保证“三明治”各层之间均无气泡。电转移时最好为恒流,电转移的时间和电流大小取决于凝胶的厚度和蛋白质分子量的大小.分子量大,电流稍大时间长;分子量大,电流小时间短;注意做好膜上的标记。,五、固相免疫检测,转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。,DAB显色原理：DAB在HRP作用下形成红褐色不溶产物，从而指示目的蛋白位置及强弱。ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上标记的辣根过氧化物酶(HRP)，使底物发生氧化还原反应，从而发出荧光。ECL发光相对于DAB显色而言，具有发光持久，灵敏度高(一般可达到pg级以上)等优点，且DAB具有致癌性。,ECL结果DAB结果,实验前的准备,1.设备和材料的准备:洗膜用平皿摇床ECL发光所需(避光盒、X-光片、X-光片曝光盒等)2.试剂的准备和配置:封闭液(5%脱脂奶粉、BSA、WesternBlot膜封闭液）一抗二抗抗体稀释液TBST缓冲液ECL试剂盒或DAB试剂盒,实验步骤,1、封闭：将转移后的膜浸入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动封闭1h（或4过夜）；（封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，使抗体只能跟特异的蛋白结合）2.一抗反应将一抗用抗体稀释液稀释到所需浓度；将封闭后的膜放入一抗工作液中，4反应过夜(或37,2小时)。3.洗膜将膜从一抗中取出，TBST洗涤10min3，室温下缓慢摇动洗涤。4.二抗反应将二抗用抗体稀释液稀释到所需浓度。将膜放入二抗工作液中室温30min。5.洗膜TBST洗涤10min3，室温下缓慢摇动洗涤6.曝光及洗片（或DAB显色）,曝光及洗片方法,按1:1（v/v）混合ECL试剂盒中两种液体。将上述混合液均匀铺在NC膜表面，室温作用2分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC膜（避免在膜的上面出现气泡）。在暗室中（红光下）将X光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。将曝光后X光片放入显影液中显影、清水中漂洗、定影液中定影1分钟（具体曝光时间及显影时间需根据显影结果作出调整）,实验注意事项,1.处理膜的过程中，切勿使膜干掉（否则导致背景增高）2.选择合适的一抗及二抗浓度（浓度高不一定效果好，过高会导致背景变