血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验ppt课件.ppt_第1页
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验ppt课件.ppt_第2页
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验ppt课件.ppt_第3页
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验ppt课件.ppt_第4页
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳实验ppt课件.ppt_第5页
已阅读5页,还剩12页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

实验二(P124)血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳(Celluloseacetatemembraneelectrophoresisofserumproteins),1,实验目的,1、掌握电泳法分离蛋白质的原理2、学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和操作方法3、学习蛋白质染色的方法,2,分离蛋白质的方法,分离方法,沉淀法,层析法,电泳法,3,实验原理,电泳:是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下,不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可对它们进行分离。,4,以蛋白质为例:,H,OH,H,OH,pHpIpH=pIpHpI,5,影响电泳迁移率的因素:1、内在因素:蛋白所带净电荷的性质和电荷的量、蛋白的大小和形状2、外界因素:电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象,6,血清中几种主要蛋白组分:,缓冲液pH=8.6,pIpH,血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动,7,醋酸纤维薄膜电泳,醋酸纤维薄膜作为支持介质醋酸纤维薄膜:将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯,溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜,其厚度为0.10.15mm,8,染色剂,一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色,9,实验操作,1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后,取醋酸纤维素薄膜放在滤纸中并吸干表面液体。整条薄膜颜色一致而无白色斑点,则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。2.电泳槽的准备电泳槽有两个互相隔离的槽,各自装有缓冲液,接不同的电极,红色为正极,黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆,滤纸的一头搭在横杆上,另一头浸入缓冲液中,形成滤纸桥。,10,3.点样:点样前,将薄膜粗糙面朝上,距一边1.5cm处用铅笔划一条平行线作为点样标志区。点样时,用点样器毛吸取血清,在薄膜粗糙面上轻而温和地印一下(盖章法)。点样区距阴极端1.5cm(见图)。此步是实验的关键。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图(黑线处为点样位置),点样区,6.5cm,1.5cm,11,4.电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂。连接好电泳仪。在室温下电泳,恒压110V,打开电源开关,电泳时间60min。电泳后,调节旋钮使电压为零,关闭电泳仪切断电源。,12,5.染色:电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5min,染色时可置于摇床,均匀摇晃。6.漂洗:将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗3次,每次5min,直至背景蓝色脱尽,条带清晰为止,取出薄膜放在滤纸上,用吹风机冷风吹干或者自然晾干。,13,8.记录和分析实验结果透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录,并判断分析结果。透明后的薄膜可作扫描或照相。正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白,2,3,4,5,分别为1,2,及球蛋白,6为点样原点,14,注意事项,1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2、点样时,应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去,薄膜吸水量以不干不湿为宜。3、点样时,动作要轻、稳,用力不能太大,以免损坏薄膜或印出凹陷影响电泳区带分离效果。4、点样应点在薄膜的粗糙面上,点样量要适量,不宜过多或过少。5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端,且点样面向下。6、应控制染色时间。时间长,薄膜底色不易脱去;时间太短,着色不易区分,或造成条带染色不均匀,必要时可

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论