（食品科学专业论文）黑曲霉酸性β甘露聚糖酶及制备魔芋低聚糖研究.pdf

江南人学博士学位论文 黑曲霉酸性p 甘露聚糖酶及制备魔芋低聚糖研究 中文摘要 9 甘露聚糖酶【b 1 ，4 - d - m a n n a nm a n n a n o h y d r o l a ，e c3 2 1 7 8 是一种能水解甘露聚糖、葡甘露聚 糖，半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主链b 1 ，4 d - 甘露吡喃糖苷键的半纤维素酶，主要来自于微 生物。它是一种有一定戍用前景的新型： 业_ i j 酶目前存在发酵酶活性偏低的缺陷，导致其生产和 应用成本高，限制了该酶的广泛应用。本论文较系统研究了发酵培养基组成和发酵条件对黑曲霉 a s p e r g i l l u sn i g e rl w 一1 同态发酵产酶的影响，大幅度提高了发酵酶活性同时对酶性质和酶法水解 工艺进行了研究，为指导酶的工业化生产和应用以及进一步的分子生物学研究奠定了基础。 通过单冈素试验、p l a e k e t t b u r m a n 实验和响应面分析法，确定了黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e rl w 1 菌株锥形瓶| 古| 态发酵的最佳产酶培养基组成。为麸皮：豆饼粉= 7 5 ：2 5 ( g g ) ，其它物质相对于同体 物料的质量分数分别为魔芋粉4 ，k h 2 p 0 4 0 3 ，玉米浆5 ，c a c l 20 1 ，m g s 0 4 0 1 ，( n h 4 ) 2 s 0 4 l ，液同比为1 5 ：l 。通过发酵条件优化得到了该菌株的最优培养条件即培养基起始p h 自然， 培养温度3 2 c ，静置培养8 4 h 。在上述最优条件下，该菌株产酸性8 甘露聚糖酶的最高酶活达2 4 8 7 9 l u g 干曲，比未优化前发酵酶活提高了2 2 7 倍，是迄今为止所有报道中酶活水平最高的。 通过曲盘( 大小十2 0c m 4c m ) 固态发酵扩大培养试验，获得了酸性b 甘露聚糖酶同态发酵的 最优工艺，即培养基最初料水比为1 ：1 8 起始p h 自然，接种耸1 0 ( 相对于干物料) ，曲盘中装 料1 5 0 9 ( 以干料计) ，分别于发酵2 8 h 、4 5 h 补水和翻曲，3 2 培养7 2h 。在该条件下最高发酵酶活 可达2 2 2 5 0 t w g 干曲。 采用磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分部盐析、p h e n y ls e p h a r o s ec l - 4 b 疏水层析阶段洗脱、 s e p h a d e xg - 7 5 凝胶过滤层析、d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 阴离子交换层析以及p h e n y l s e p h a r o s e c l - 4 b 疏水层析梯度洗脱的手段方法，从黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e rl w 1 吲态发酵曲中分离剑相 对分子质昔和疏水性质非常相近的a 、b 两种1 3 一甘露聚糖酶组分其中组分b 所- 1 i 酶活比例较大。 纯化酶的同收率为1 4 3 ，纯化倍数为3 8 6 。采用s d s p a g e 电泳和h p l c 两种不同方法对纯化的 主要组分b 进行鉴定，表明其为一种纯酶组分。 运用s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤层析和s d s p a g e 电泳测得纯化酶的相对分子质革分别为4 1 0 0 0 和4 0 0 0 0 ，两种方法测定结果基本一致，表明该酶以单体形式存在；i e f p a g e 测得该酶的等电点为 4 3 ，苯酚硫酸法测得该酶含糖耸为2 1 7 ；氨基酸含量测定显示，纯化酶中含量较高的前五种氨基 酸分别为a s p 、g l y 、s e r 、g l u 和t h r ，含有较多酸性氨基酸，为酸性蛋白。 对纯化酶酶学性质研究显示，该酶最适反应温度为7 0 ，6 0 以下稳定；在测试的三个温度范 围内，纯化酶最适反应口h 值均为3 5 ，表明该酶为酸性酶，该酶在p h 3 5 8 范围稳定。z n ”、c a 2 + 、 e d t a 对酶有明显的激活作用，m n ”对酶有较强的抑制作用，f d + 、p b 2 + 、s n ”、f e ”、c u 2 + 、a i 3 + a g + 对酶的抑制作用较弱；其它金属离子对酶活影响不大。以上性质与粗酶试验结果基本一致。纯化 酶对槐豆胶半乳甘露聚糖和魔芋葡甘露聚糖的j o 值分别为5 1m g m l 和1 4m g m l ，对两种多塘的 值分别为1 4 2 9 i t m o l m i n - i m 9 1 和6 2 5 i t m o l m i n - lo m g ，表明魔芋粉与酶的亲和力大些。 采用h p l c 法和h p l c m s 法对纯化酶水解槐豆胶半乳甘露聚糖的产物进行定性和定量分析， 发现产物除少晕单糖甘露糖外，主要含有甘露二糖、甘蹯三糖，其二糖、三糖、四糖三类寡糖占总 水解产物的4 9 7 5 。该结果与众多文献报道的相似，表明该酶为内切b 甘露聚糖酶。 以魔芋胶葡甘露聚糖为原料，采刖黑曲霉酸性b 甘露聚糖酶相酶液进行酶法水解条件的研究， 得到的优化工艺条件为：魔芋胶( 水溶液) 浓度1 5 0g l ，加酶鼙5 0l u 幢魔芋胶，5 0 水解6h 。所 获酶解产物经薄板层析和h p l c 检测表明主要为低聚糖以及少鼙单糖。利用酵母发酵法去除其中的 可发酵性单糖，可以大大提高酶解产物中魔芋葡甘露低聚糖的含量。 本研究试验成功了一种新的魔芋胶酶解工艺，突破了魔芋胶粘度大所带来的屏障，解决了甘露 i i 苎塑墨 低聚糖生产工艺中最关键的问题，即将魔芋胶浓度从1 0 3 0g , z l 提高至1 5 0g l ，使工业化规模酶解 魔芋胶生产甘露低聚糖成为可能。该魔芋甘露低聚糖的生产工艺尚未见报道 关键词 黑曲霉，b 甘露聚糖酶，固态发酵，分离纯化，酶学性质，酶法水解t 甘露低聚糖 i i i 江南大学博士学位论文 s t u d i e so nt h ea c i d i c1 3 一m a n n a n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e rl w - i a n di t sa p p l i c a t i o nf o rt h ep r o d u c t i o no fo l i g o s a c c h a r i d e sf r o m k o n j a cg l u c o m a n n a n a b s t r a c t 1 3 - m a n n a n a s e ( 1 3 - 1 4 - d - m a n n a nm a n n a n o h y d r o l a s ee c3 2 1 7 8 ) ，w h i c hc a t a l y z e st h er a n d o m c l e a v a g eo f1 3 - d - i ，4 - m a n n o p y r a n o s y ll i n k a g e sw i t h i nt h em a i nc h a i no fg a l a c t o m a n n a n ，掣u c o m a r m a n ， g a l a c t o g l u c o m a n n a na n dm a n n a n i sa “n do fh e m i c e l l u l a s e i tc a nb ep r o d u c e dm a i n l yb yv a r i o u s m i c r o o r g a n i s m s 1 3 - m a n n a n 撵c a nb eu s e f u li ns e v e r a lp r o c e s s e si nt h ef o o d ，f e e d , t e x t i l e 。a sw e l la si nt h e p u l pa n dp a p e ri n d u s t r i e s d e s p i t eh a v i n gh i g hp r a c t i c a lp o t e n t i a l i t i e s t i l ea s eo f m a n n a n a s ei ss t i l ll i m i t e d d u et ol o wy i e l d sa n dh i g h - p r o d u c t i o nc o s t s t h er e s e a r c h e so nt h e1 3 - m a n n a n a s ef r o ma s p e r g i l l u 8n i g e r l w - 1w e r ev e r yi m p o r t a n tf o rt h em a n u f a c t u r eo f f u n c t i o n a lk o n j a kg l u c o m a n n a no l i g o s a c c h a r i d e s ，w h i c h p r o v i da ni m p o r t a n tb a s ef o ri n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o na n da p p l i c a t i o n m u l t i v a r i a n ts t a t i s t i c a l a p p r o a c h e sc o n t a i n i n g p l a c k e t t b u r m a nd e s i g na n d r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g yw e r ee m p l o y e dt oe v a l u a t et h ee f f e c t so fs e v e r a lv a r i a b l e so ns o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o ni n f l a s kw i t ht h es t r a i na s p e r g i l l u sn i g e rl w - 1 t h eo p t i m u mm e d i u mi n g r e d i e n t sf o ra c i d i c1 3 - m a n n a n a s e p r o d u c t i o ni nf l a s kw e r e f o l l o w s ：t h ep r o p o r t i o no fw h e a tb r a nt os o y b e a nf l o u r7 5 ：2 5 i n i t i a lp h n a t u r a l ，t h er m i o o f w a t e r t od r a w m e d i u m1 5 ：1 ，4 k o n j a k p o w d e r , o 3 k h 2 p 0 4 ，5 s t e e p l i q u o r ，0 1 c a c l 2 ，0 i m g s 0 4 ，l f n h 4 ) 2 s 0 4 ( a l lr e l a t e dt od r ym e d i u m ) 1 1 1 ec u l t i v a t i o nw a sc a r r i e do u ta t3 2 f o r8 4 h w i t ht h e s ec o n d i t i o n s ，t h ea c i d i c1 3 - m a n n a n a s ea c t i v i t yr e a c h e d2 4 8 7 9i u gd r ym e d i u m ，b e i n g 3 2 7 f o l d c o m p a r e dw i t hc o n 仃0 1 i tr e a c h e st h eh i 曲e s te n z y m ea c t i v i t yo f a l lr e p o r t ss of a r b a s e do ns u c c e s s f u lr e s u l t so ff l a s k , a c i d i c1 3 - m a n n a n a s es c a l e - u pp r o d u c t i o nw a sc a r r i e do u ti nk o j i p l a t e ( m 2 0c m x4c m ) t h e o p t i m a lk o j ip l a t e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w e r e 鸹f o l l o w s ：t h er a t i oo f w a t e r t o d r ym e d i u m1 8 ：1 ，i n i t i a lp hn a t u r a l ，i n o c u l u ms i z e1 0 ( r e l a t e dt od r ym e d i u m ) ，d r ym e d i u mc o n t e n t l5 0 9 k o j ip l a t e w i t ht h e s ec o n d i t i o n s ，t h ea c i d i c 3 - m a n n a n a s ea c f i v i t yr e a c h e d2 2 2 5 0i u gd r ym e d i u ma t 3 2 cf o r7 2hb ya d d i n gw a t e ra n dt u r n i n gk o j i t w of r a c t i o n saa n dbw i t h1 3 - m a n n a n a s ea c t i v i t yf r o ms o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nc u l t u r ew e r ep u r i f i e d t h r o u g hs e q u e n t i a ls t e p so fb u f f e re x t r a c t i o n , a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n , p h e n y ls e p h a r o s ec l - 4 b h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( w i t hs t e p w i s eg r a d i e n t ) ，s e p h a d e xg 一7 5g e lf i l t r a t i o n ，d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wi o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dp h e n y ls e p h a r o s ec l - 4 bh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( w i t hl i n e a rg r a d i e n t ) f r a c t i o naw a ss i m i l a rt of r a c t i o nbo nm o l e c u l a rm a s sa n d h y d r o p h o b i ep r o p e r t y a f t e rt h es t e p st h ee n z y m ew a sp u r i f i e db y3 8 6 - f o l dw i t har e c o v e r yo f1 4 3 t h e m a i nf r a c t i o nbw a sh o m o g e n e o u sa se x a m i n e db ys d s - p a g ea n dh p l c 1 1 1 em o l e c u l a rm a s so f t h ep u r i f i e de n z y m ew a se s t i m a t e dt ob e4 1k db ys e p h a d e xg - 7 5g e lf i l t r a t i o n a n d4 0k db ys d s p a g e w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h e1 3 - m a n n a n a s ew a sam o n o m e r t h ei s o e l e c t r i cp o i n tw a s e s t i m a t e dt ob e4 3b yi e f p a g e t h ee n z y m ew a sag l y c o p r o t e i nw i t hc a r b o h y d r a t ec o n t e n to f 2 1 7 b y p h e n o l v i t r i o lm e t h o d t h ec o m p o s i t i o no fa m i n oa c i d so ft h ee n z y m ew a sa n a l y z e d i ts h o w e dt h a tt h e5 h i g h e s tc o n t e n to fa m i n oa c i d sw e r ea s p g l y s e r , g l ua n d1 1 l ro fa l lt h ea m i n oa c i d s 1 1 1 ec o n t e n to f a c i d i ca m i n oa c i dw a sh i g h e rt h a nt h a to fb a s i ca m i n oa c i d i n d i c a t i n gt h a tt h ep u r i f i e de n z y m ew a sa l l a c i d i cp r o t e i n t h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e so f t h ep u r i f i e d1 3 - m a n n a n a s ew e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ef o r a b s u a c t e n z y m er e a c t i o nw a s7 0 t h eo p t i m a lp hw a s3 5a t5 0 7 0 1 2 w h i c hi n d i c a u mt h a tt h e1 3 - m a n n a n a s e w a sn i la c i d i ce n z y m e t h ee n z y m ew a ss t a b l eb e t w e e np h 5 0 - 8 0a n db e l o w6 0 c t h ee n z y m ea c t i v i t y w a ss t i m u l a t e db yz n 2 + 、c a 2 + 、e d t aa n dp a r t l yi n h i b i t e db ym n 2 + 、f e 2 + 、p b 2 + 、s n 2 + 、f e 3 + 、c u 2 + 、a 1 3 + 、 a g + t h e s ep r o p e r t i e sw e r ev e r ys i m i l a rt oc r u d ee n z y m e t h em i c h a e l i sc o n s t a n t s ( k m ) o f t h e1 3 - m a n n a n a s e f o rl o c u s tb e a ng u ma n dk o n j a kg u mw e r e5 1m g m la n d1 4m g m l ，a n dm a x i m u mv e l o c i t i e s ( 缸) f o r t h e s es a c c h a r i d e sw e r e1 4 2 9i x m o l - m i n 1 m g a n d6 2 5p m o l m i n m g 。r e s p e c t i v e l y t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a tk o n j a kg u mw a sm o r es u i t a b l es u b s t r a t et h a nl o c u s tb e a ng u m t h eh y d r o l y s a t oo fl o c u s tb e a ng u mg a l a c t o m a n n a nd e g r a d e db yt h ep u r i f i e d1 3 - m a n n a n a s ew a s a n a l y z e db yh p l ca n dh p l c - m s t h e1 3 - m a n n a n a s eh y d r o l y z e dl o c u s tb e a ng u mg a l a c t o m a n n a nm a i m l y t om a n n o b i o s ea n dm a n n o t r i o s e t h ec o n t e n to fm a n n o b i o s e ，m a n n o t r i o s ea n dm a n n o t c t r a o s er e a c h e d 4 9 7 5 o ft o t a lh y d r o l y s a t e a b o v er e s u l tw a ss i m i l a rt om a n yr e p o r t s ，i n d i c a t i n gt h a tt h ep u d f i e d 1 3 - m a n n a n a s ew a sa ne n d o e n z y m e t h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so fk o n j a kg l u c o m a n n a nw e r ei n v e s t i g a t e dw i t hc r u d ee n z y m ef r o m a s p e r g i l l u s n i g e r l w - 1 u n d e r t h e c o n d i t i o n so f k o n j a kg u m w a l e rs o l u t i o n1 5 0g l ，1 3 - m a r n l a n a s e5 0 i u ，g k o n j a kg u m h y d r o l y t i ct e m p e r a t u r e5 0 a n dh y d r o l y t i c t i m e 6l l t h eh y d r o l y s a t ew a sm a i n l y o l i g o - s a c c h a r i d e sw i t ho n l ys m a l lt r a c e so fm o n o - s a c c h a r i d e sa n a l y z e db yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h ya n d b yh p l c t h ec o n t e n to fo l i g o - g l u c o m a n n a ni nh y d r o l y s a t ew a so b v i o u s l yi n c r e a s e dt h r o u g he l i m i n a t i n g m o n o - s a c c h a r i d e sw i t hy e a s tf e r m e n t a t i o n a nu n i q u ee n z y m o l y s i sp r o c e s sf o rk o n j a kg u mw a so b t a i n e d k o n j a kg u mc o n c e n t r a t i o nw a s o b v i o u s l yi n c r e a s e df r o m1 0 - - 3 0 叽t o15 0g l t h i sm a d ei tp o s s i b l ef o ri n d n s t r i a l i z e dp r o d u c t i o nf r o m k o n j a kg u mt om a n n o o l i g o s a c c h a r i d e s of a r1 1 0i n f o r m a t i o ni sa v a i l a b l eo ns i m i l a rp r o d u c t i o np r o c e s s a b o u tk o n j a kg l u c o m a n n a n k e yw o r d s ： a s p e r g i l l u sn i g e r ， b - m a n n a n a s e ，s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ，p u f i f i c m i o n ，e n z y m ep r o p e r t i e s ， e n z y m a t i c h y d r o l y s i s ，m a n n o o l i g o s a c c h a r i d e v 缩略词表 p m a l n a n a s e l b g k g k g m k g m o s m o s d n s b i s a c r 2 - m e t e m e d s d s a p t r i s p e g b s a c y t c e d t a p a g e s d s p a g e m ， r f i e f p a g e p i h p l c h p l c m s t l c k 。 u v 缩略词表 b 甘露聚糖酶 槐豆胶 魔芋胶 魔芋葡甘露聚糖 魔芋葡甘露低聚糖 甘露低聚糖 3 ，5 一二硝基水杨酸 n ，n 。甲叉双丙烯酰胺 丙烯酰胺 巯基乙醇 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 十二烷基硫酸钠 过硫酸铵 三羟甲基氨基甲烷 聚乙二醇 牛血清白蛋白 细胞色素c 乙二胺四乙酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 分子质量 相对迁移率 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳 等电点 高效液相色谱 高效液相色谱质谱 薄层色谱 米氏常数 最大反应速率 紫外线 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：乏查璺茎日期：如产厂月扩日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：趔蒸导师签名：丛 日期：尹0 7 年j ，月扩日 第一章绪论 1 1 立题背景和意义 第一章绪论 甘露聚糖( m a n n a n ) 是指由特定的单糖残基( 主要是甘露糖、半乳糖、葡萄糖等) 以小和域b - 糖苷键连接而成的一类多糖的总称i lj 。在植物界储量非常丰富，仅次于木聚糖成为植物半纤维素的 第二大组分i z j ，广泛存在于豆科植物种子、针叶树木材、咖啡豆、椰肉粉、魔芋等植物中p , 4 1 。对甘 露聚糖这一巨大的可再生生物资源的有效利用对解决能源危机、生物利用、环境污染等具有重大的 现实意义。 按照甘露聚糖分子中所含单糖种类及其连接方式，可以将其分类为：均一甘露聚糖和异甘露聚 糖。均一甘露聚糖是指由单一n 甘露糖残基以p 1 ，4 d - n i l 喃甘露糖苷键连接而成的线状多糖。而异 甘露聚糖则是以m 甘露糖残基为主，由不同的单糖残基或糖苷键连接而成的带有分枝的不均一多糖。 自然界中的甘露聚糖主要以异甘露聚糖的形式存在，有葡甘露聚糖( b u c o m a n n a n ) 、半乳甘露聚糖 ( g a l a c t o m a n n a n ) 和半乳葡甘露聚糖( g a l a c t o g l u c o m a n n a n ) 等l ，i 。 一系列研究表明，甘露聚糖在化妆品工业、食品和医药领域有极其广泛的应用价值【4 , 6 , 7 1 ，但由 于其相对分子质量大、遇水后具有高膨胀、高粘度的特性，人和动物摄入过量将引起各种负面影响， 即所谓的抗营养作用，从而使其应用受到限制i8 + 9 1 。 近年来的研究发现，当甘露聚糖高分子降解成为相对较小的低分子后，其理化性质以及某些生 理功能将会发生变化。甘露低聚糖( m a n n a no l i g o s a c c h a r i d e s ，m o s ) 是由甘露聚糖经过化学降解或 酶法降解生成的聚合度为2 l o 的低聚糖由甘露糖残基通过b 1 。4 糖苷键组成直链，在直链或支链 ( 1 ，3 或a - i ，6 糖苷键) 上连接有葡萄糖或半乳糖等单糖残基的低聚糖。它具有独特的生理活性和 功能性质，在食品、医药、饲料、生物农药 3 , 1 0 - 1 3 1 等领域有着极其广泛的应用，已成为国际上新兴的 又一功能性低聚糖品种。 大量研究表明，该低聚糖除了具有低热量、稳定、安全无毒等良好的理化特性外，还具有促进 人与动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖，改善肠道内菌群结构 1 4 - 1 6 】；减慢肠道粘膜细 胞分泌的n - 糖苷酶的扩散速度，不升高血糖，并能提高机体的抗氧化能力1 1 7 , 1 8 ；对实验性高脂血症 的防治、降血脂和护肝作用【州；排除体内毒素和增强机体免疫防御能力1 2 0 】以及防龋齿、抗腐蚀性等 多种生理功能。此外，甘露低聚糖可作为安全无毒的绿色添加剂应用于饲料工业具有对动物健康 和生长机能的促进作用 2 1 , 2 2 j ，己被公认为是最有希望的抗生素替代品之一。 甘露低聚糖的制备主要有三种方法：酸降解法、酶降解法和酸酶结合降解法1 2 3 2 , 4 1 。酸降解因反 应条件剧烈，设备腐蚀严重，反应的稳定性和重复性差，产物的聚合度不易控制，单糖含量高，且 有环境污染突出、后处理烦琐、产物得率底等缺陷。酶降解是用专一性的1 3 甘露聚糖酶或非专一性 纤维素酶 2 5 1 或d 一葡聚糖酶口“对甘露聚糖进行降解而得到均分子量较低的低聚糖。酶解法选择性高， 酶降解过程工艺简单，条件温和，不产生环境污染，而且可控制聚合度，避免了低聚糖的破坏，产 物安全性高。 b 一甘露聚糖酶( d - l ，4 d - m a i 3 r l a l m a n n o h y d r o l a s e ，e c3 2 1 7 8 ) 是一种能水解多种甘露聚糖( 包括 均一甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖) 的主链b 1 ，4 m 甘露糖苷键的半 纤维素酶，是专一性的内切水解酶1 5 7 7 l 。各种甘露聚糖经1 3 甘露聚糖酶降解后，通过高效液相色谱或 薄板层析方法分析，其主要产物是甘露低聚糖( 一般由2 一l o 个单糖残基组成) ，单糖很少产生或根 本不产生”0 8 j ”。 b 甘露聚糖酶来源广泛，在动物、植物、微生物中都发现有该酶的存在，而微生物则是产生b 甘露聚糖酶的主要来源。按其最适作用p h 值一般可分为碱性、中性和酸性p 甘露聚糖酶，细菌产生 的主要为碱性和中性酶，真菌所产酶偏酸性。国内外研究主要集中在细菌芽孢杆菌的碱性和中性酶 方面”“。到目前为止所报道的产酶水平最高的有：枯草芽孢杆菌w y 4 5 1 3 3 1 液体发酵产酶活性最高 江南大学博士学位论文 达2 8 0 0 u m l ，黑曲霉w a 9 2 0 4 1 圳固态发酵产酶活最高达8 9 8 4 u ，g 干曲。 虽然近年来微生物产b 一甘露聚糖酶酶活水平逐步提高，但距离工业化生产要求仍有差距。由于 酸性b ，甘露聚糖酶具有作用p h 偏于酸性，水解甘露聚糖等底物时不容易被杂菌污染，与动物消化 道p h 吻合等优点，在食品和饲料工业有着广泛的应用前景。另外，固态发酵具有设备简单、投资 少、见效快、成本低、操作粗放及对环境友好等优势p ”，已成为发酵尤其是真菌产酶1 4 , 3 6 - 3 8 i 的新趋势。 我国是魔芋生产国，魔芋资源丰富，主要分布在我国西南部贫困山区，1 9 8 6 年被农业部确定为 重要的特种经济作物之_ _ 1 3 9 1 。开发我国魔芋资源生产葡甘露低聚糖具有较大的社会效益和经济效益。 魔芋低聚糖的研究近年来才开始起步。国内首先由马延和p o l l 等利用碱性枯草芽孢杆菌所产b - 甘露聚 糖酶制各魔芋低聚搪，但由于该酶在碱性条件下作用，反应过程中产生的深色物质，使得分离提纯 困难增加了产品的成本，并影响产品的质量。继马延和之后，杨文博等”利用地衣芽孢杆菌n k - 2 7 所产的b 甘露聚糖酶制备魔芋低聚糖，但酶解产物中含有较多的单糖。以魔芋胶为原料，酶法制备 魔芋低聚糖的核心技术是应用高活力的1 3 甘露聚糖酶和使用高浓度的魔芋胶溶液。由于生产b 甘露 聚糖酶的制造技术未能取得实质性突破，另外魔芋胶溶于水后分子链伸展，粘度非常大，几乎所有有 关魔芋胶酶解工艺的文献报道均采用1 肚3 0 叽的魔芋胶浓度。导致了酶解产物后处理成本很高、生 产效率极低。目前葡甘露低聚糖产品仅有日本少量生产，在国内仍处于中试阶段”j 。 本课题就是在上述背景下提出的，以自行筛选的酸性b 甘露聚糖酶高产菌株黑曲霉a s p e r g i l l u s n i g e rl w - i 为固态发酵试验的出发菌株，全面、系统地研究各种因素对其合成酸性1 3 甘露聚糖酶的 影响，进行固态发酵工艺条件的优化，大幅度提高酸性1 3 一甘露聚糖酶的发酵酶活性，为最终实现产 业化生产和应用打下基础。 本课题的立题意义在于： ( 1 ) 降低b 甘露聚糖酶的生产成本以实验室自行筛选并保藏的一株酸性p 甘嚣聚糖酶高产 菌株黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e ，l w - 1 为出发菌株，通过对其固态发酵工艺条件的优化，大幅度提高该 菌株产酸性d 甘露聚糖酶的发酵酶活性，从而降低p 甘露聚糖酶的生产和使用成本，拓展酶的应用 领域。 ( 2 ) 指导1 3 甘露聚糖酶的合理应用 通过对黑曲霉l w 1 菌株所产酸性1 3 甘露聚糖酶的分离纯 化及酶学性质的研究较深入地了解该酶的理化特性( 如最适作用p h 和温度、酶的热稳定性和p h 稳定性等) ，用于指导该酶的后续加工以及在食品、饲料工业等领域中的合理应用。 ( 3 ) 促进魔芋深加工利用l w 1 菌株所产的高活性酸性b 甘露聚糖酶，对酶解魔芋甘露聚糖 条件进行探索，得到工业化可行的新工艺。该新技术的应用，可以对我国资源丰富的魔芋可食性植 物胶进行深加工，大大提高其附加值，具有显著的经济和社会效益。 1 2 国内外研究进展 对b 甘露聚糖酶的研究始于上个世纪五十年代末。1 9 5 8 年，c o u r t i o s 第一次报道了能产生1 3 甘 露聚糖酶的真菌：1 9 6 0 年，w i l l i a m 和d o e t s e h 报道了细菌产生的b 甘露聚糖酶；1 9 6 5 年，r e e s e 和 s h i b a t a 提出了口甘露聚糖酶的概念和定义1 8 4 0 1 。7 0 年代后，有关p 甘露聚糖酶的文献报道逐渐增多， 研究工作主要涉及：产b 甘露聚糖酶微生物菌株的选育，产酶发酵工艺条件的优化、酶的分离纯化 和理化特性，酶的作用机理等方面p j 4 “。进入9 0 年代，随着基因工程和蛋白质工程技术的广泛应 用及b 甘露聚糖酶在食品、医药、造纸、饲料和石油开采等工业领域中具有的潜在应用前景，对1 3 甘露聚糖酶的研究开始转向酶基因的克隆、表达和活性位点等方面i 舯j ，目前已有一些微生物和动 植物的b 甘露聚糖酶基因被克隆，并在大肠杆菌和真菌表达体系中获得了表达，但成熟的报道并不 多。 1 2 1b 甘露聚糖酶的来源 b 甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括细菌、真菌、放线菌和动植物。一些低等动物的肠道分泌 液中【舶, 4 6 a 7 1 、植物的发芽种子中1 4 、天南星科( a r a c e a e ) 植物魔芋萌发的球茎e e 5 1 l ，均发现有1 3 2 第一章绪论 甘露聚糖酶的存在。由于通过微生物发酵法生产b - 甘露聚糖酶具有活性高、来源广泛、生产周期短、 不受季节限制、成本低廉、提取方便以及比动、植物更广的作用p h 、温度范围和底物专一性等显著 的优点，是目前b - 甘露聚糖酶的主要来源( 表l 1 ) 。已报道的如细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧 菌，真菌中的曲霉、木霉、青霉、多孔菌、核盘菌，以及放线菌中的链霉菌均是产1 3 一甘露聚糖酶的 常见菌群”1 。 表1 - 1 产b 甘露聚糖酶的部分微生物 t a b 1 1s o m em i c r o o r g a n i s m sp r o d u c i n gb - m a n n a n a s e 微生物b - 甘露聚糖酶主要来源于细菌和真菌，细菌中研究最为详细的是芽孢杆菌所产的d 甘露 聚糖酶，而真菌中的曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、木霉属( t r i e h o d e r m a ) 的菌种是昏甘露聚糖酶最活跃的 产生菌。真菌中的黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 是公认安全的微生物，用其发酵生产酶制剂具有安全、 可靠和不产生毒素等优点。据现有文献报道，黑曲霉是微生物产b 一甘露聚糖酶的优良菌种之一，但 目前有关黑曲霉高产b 甘露聚糖酶的文献报道并不多”，叫。 1 2 2b 甘露聚糖酶的生物合成与产酶水平 大量研究资料表明，b 甘露聚糖酶一般以胞外诱导酶的形式存在于微生物中，只有很少一部分 以组成酶的形式存在。只有在培养基中添加1 3 甘露聚糖或甘露寡糖时才能大量进行b 甘露聚糖酶的 生物合成，否则只有基础水平的酶产生1 3 0 , 8 ”。微生物合成d 甘露聚糖酶的基质虽不尽相同，但产酶 培养基常用的碳源一般含有槐豆胶、魔芋粉等诱导物，氮源有豆饼粉、蛋白胨、酵母膏、谷氨酸钠 等。不同微生物合成甘露聚糖酶对无机盐的要求也不尽相同，一些嗜碱性细菌要求较高的p h 值和 较高的n a c i 浓度；c a 2 十、m g “、k 十则是a s p e r g i l l u s n i g e r w m 2 0 - 1 1 、b a c i l l u ss p m ，o 产p - 甘露聚糖酶 所必须的1 6 9 8 4 i 。部分微生物产1 3 甘露聚糖酶的条件见表i 一2 。 江南大学博士学位论文 a s p e r g i l l u sn i g e r w m 2 0 - 1 i a s p e r g i l l u s _ i f m i g a t u si m l 3 8 5 7 0 8 a s p e r g i l l u sn i g e rw a 9 2 0 4 a s p e r g i l l n i g e r w 3 0 1 a x p e r g i l l u sn i g e r a t c c 4 6 8 9 0 a s p e r g i l l u sn i g e r t r i c h a d e r m ah a m i a n u mt 4 b a c i l l u sc i r c u l a mw x y - 1 0 0 b a c i l l u ss pm - 5 0 b a c i l l u ss p n 1 6 - 5 b a c i l l u s s n b t i l i sb m 9 6 0 2 b a c i l l u ss u b r i l i s 、v y 3 4 b a c i l l u sl i c h