垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物氯化转化.pdf_第1页
垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物氯化转化.pdf_第2页
垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物氯化转化.pdf_第3页
垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物氯化转化.pdf_第4页
垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物氯化转化.pdf_第5页
已阅读5页,还剩57页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

东北农业大学 硕士学位论文 垂子买麻藤和一株放线菌代谢产物分离纯化、结构鉴定及生物 氯化转化特性研究 姓名:姜冰 申请学位级别:硕士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:向文胜 20080620 摘要 摘要 从天然产物中筛选发现新型结构的活性化合物是天然产物研究的重点领域。传统的天然 产物化学研究内容主要为通过萃取、层析以及色谱制各等手段进行分离纯化,获得达到一定 纯度的单体化合物,测定其U V 、I R 、M S 、N M R 等谱学数据,确定化合物的结构;再进行体外 或体内生物活性及作用机理研究。 本文运用经典的植化研究方法对垂子买麻藤( G n e t u mp e n d u l u m ) 中的化合物进行提取 分离以及结构鉴定。应用萃取、正相硅胶柱层析、凝胶S e p h a d e xL H 2 0 柱层析多种分离手 段,一共分离得到四个化合物,应用现代波谱技术鉴定了化合物的结构。最终确定来自此植 物的四个化合物是:3 ,5 二羟基4 甲氧基均二苯代乙烯( I ) 、银松素( ) 、丹叶大黄素( ) 、 射干乙素( ) 。其中化合物I 为首次报道的一全新的化合物。 此外本研究以枯草芽孢杆菌( B a c i l l u ss u b t i l i s ) 和藤黄微球菌( S a r c i n al u t e a ) 为活性检 测菌,利用活性跟踪的办法对一株放线菌发酵液的活性成分进行分离以及化合物的结构鉴 定。应用正相硅胶柱层析、反相柱层析、凝胶S e p h a d e xL H 一2 0 柱层析以及反相H P L C ( H i 【g h P e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y ) 制备等多种层析技术,一共分离得到七个化合物,应用 现代波谱技术鉴定化合物的结构。这几个化合物分别为:8 氯染料木素( 1 ) 、染料木素( 2 ) 、 大豆营元( 3 ) 、3 ,4 ,7 三羟基异黄酮( 4 ) 、芒柄花黄素( 5 ) 、5 羟基5 甲基2 己烯酸( 6 ) 和腺苷( 7 ) 。 其中化合物5 羟基5 甲基2 己烯酸( 6 ) 和腺苷( 7 ) 具有很好的抗菌活性。 在分离得到的化合物中,发现8 一氯染料木素( 1 ) 可能是由染料木素( 2 ) 由放线菌经过生物 氯化得到的,为了证实这一观点,对不同发酵期间两种物质的含量进行了研究,发现在发酵 达到第三天时,染料木素大量减少,与此同时8 氯染料木素的含量增加,说明此放线菌具 有生物氯化的特性。 关键词:垂子买麻藤;放线菌;新化合物;生物卤化 A b s t r a c t I s o l a t i o na n dS t r u c t u r eE l u c i d a t i o no fM e t a b o l i t e sf r o m G n e t u mP e n d u l u ma n dO n eA c t i n o m y c e t e w i t hB i o l o g i c a lH a l o g e n a t i o n A b s t r a c t D i s c o v e r i n gn e wa c t i v en a t u r a lp r o d u c t sf r o mn a t u r a lr e s o u r c e si sa l li m p o r t a n t a p p r o a c hf o rn e wd r u gr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t T r a d i t i o n a l n a t u r e p r o d u c t c h e m i s t r yi Sf o c u s e do ni s o l a t i o n p u r i f i c a t i o na n ds t r u c t u r ee l u c i d a t i o n T h ep u r e c o m p o u n d Ss t r u c t u r ew a sd e t e r m i n e db yU v ,I R ,M Sa n dN M R , i t sb i o l o g i c a la c t i v i t y w a st e s t e db yi nv i t r oo ri nv i v oe x p e r i m e n t I nO U ri n v e s t i g a t i o no fc h e m i c a lc o n s t i t u e n t sf r o mG n e t u mP e n d u l u m f o u r c o m p o u n d sw e r ei s o l a t e db yt h em e t h o d so fn o r m a l p h a s es i l i c ag e la n ds e p h a d e x L H 2 0c h r o m a t o g r a p h y T h e nt h ec o m p o u n d sw e r ee l u c i d a t e do nt h eb a s i so f c h e m i c a la n ds p e c t r a lm e t h o d s F o u r c o m p o u n d s w e r ee l u c i d a t e da s 3 , 5 - d i h y d r o x y - 4 - m e t h o x y s t i l b e n e ( I ) ,p i n o s y l v i n ( I I ) ,r h a p o n t i g e n i n ( 1 1 1 ) a n ds h e g a n s u B ( ) ,t h ec o m p o u n dIi san e wc o m p o u n d S a r c i n al u t e a ( A T C C9 3 4 1 ) a n dB a c i l l u ss u b t i l i s ( A T C C6 6 3 3 ) w e r et r e a t e da s b i o a s s a y g u i d e d t h e yl e dt ot h ei s o l a t i o no ft h ea c t i v ec o n s t i t u e n t s C o m p o u n d sh a v e b e e ni s o l a t i o nf r o mt h ea c t i n o m y c e t eb yr e p e a t e d l yc h r o m a t o g r a p h yo nn o r m a la n d r e v e r s e d p h a s es i l i c ag e lc o l u m n s s e p h a d e xL H 一2 0a n df i n a lp u r i f i c a t i o nb yr e v e r s e d p r e p a r a t i v eH P L C B Yd e t a i l e da n a l y s i so ft h es p e c t r a ld a t a ( I RE S I M S ,1 H N M 凡 1 j C N M RD E P T ,C O S YN O E S YH M B C ) ,s e v e no ft h e mw e r ee l u c i d a t e d a s f o l l o w i n g ,8 - c h l o r o - g e n i s t e i n ( 1 ) ,g e n i s t e i n ( 2 ) ,d a i d z e i n ( 3 ) ,3 ,4 。,7 - t r i h y d r o x y i s o f l a v o n e ( 4 ) ,f o r m o n o n e t i n ( 5 ) ,5 - h y d r o x y - 5 - m e t h y l h e x 一2 - e n o i e a c i d ( 6 ) a n d a d e n o s i n e ( 7 ) 5 - h y d r o x y - 5 - m e t h y l h e x - 2 一e n o i ea c i d ( 6 ) a n da d e n o s i n e ( 7 ) h a v eg o o d a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y I nt h ec o m p o u n d si s o l a t e df r o mt h ea c t i n o m y c e t e 8 - c h l o r o g e n i s t e i n ( 1 ) W a s d e d u c e dt h eb i o l o g i c a lh a l o g e n a t i o np r o d u c to fg e n i s t e i n ,F r o mt h et i m ec o u r s e p r o f i l eo ft h i sb i o t r a n s f o r m a t i o n ,8 - c h l o r o g e n i s t e i nW a So b s e r v e df r o mt h et h i r dd a y o ff e r m e n t a t i o n T h er e s u l tc o m p l e t e l yc o n f i r m e dt h a tt h ea c t i n o m y c e t eh a v e b i o l o g i c a lh a l o g e n a t i o nc h a r a c t e r i s t i c K e yw o r d s :G n e t u mP e n d u l u m ;N e wC o m p o u n d ;A c t i n o m y c e t e ;B i o l o g i c a lH a l o g e n a t i o n C a n d i d a t e :J i a n gB i n g S p e c i a l i t y :B i o c h e m i s t r ya n dM o l e c u l a rB i o l o g y S u p e r v i s o r :P r o f X i a n gW e n s h e n g 研究生学干茳论文独鲥声明和使用授权 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得 f 洼;垫邃壅墓丝霞囊挂型童盟笪:查拦互窒L 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一阉工作的同志对本研究所徽的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 妥如 日期:2 00 6 年6 月砂网 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学授有关保留、使用学位论文盼规定,学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索, 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文 在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名:日期:沙缉6 月L 嗣 导师 签名:弋弋占乏群 日期:尊逸年多肛蝈 I I I 犬然药物是卦物的一个重要组成部分。自古咀来,人类在与疽病的斗争中,通过咀身试 药辞逢径,对天然药物的应用积累了丰富的经验。在中国天然药物有称为中草药,更具有 白己的特色,与中医一起构成了中华民族文化的瑰宝,是中华民族五千年来得以繁衍昌盛的 一个重要原田,也是垒人娄的宝贵遗声( 曼立军,2 0 0 3 ) 。 11 天然药物在现代药物中的地位 天然药物来自植物、动物、矿物和微生物,井以植物米源为主,种类繁多。我们现在使 用的很多约品都直接或间接地来源于天然产物,虽然有些传统的天然药物被合成品代替但 蛀近几年,新的天然药物却_ 庄研究丰治疗上得到新的地位。_ 1 定数量的新的植物米源的成分 己进人西方药品,b 场如临床上对植物药的研究已在抗癌如紫杉酵和喜树碱和抗疟如青篙素 粪化台物等领域取得了重大进展。九十年代销售最好的药物中一半咀上来自天然产物或它们 的衍生物。除已纯化的植物来源的曲品外,些草药及其粗提物制剂也有巨太的市场。从事 天然产物研究的科学家们致认为目前天然产物形成了正在应 H 的或发展中的大量药物的 基础。1 9 8 4 1 9 9 5 年抗癌神魄炎药物的种类刊资源的分忻结果表明,6 0 多种己被批准或将被 批准的药物来源于天然产物。资料研完表明药物可来源丁生物制品( 米白哺乳动物的疫苗、 单克隆缚) 、术加修饰构天然产物、经修饰的天然产物( 例如、 台成) 、全台戚产物厦以天然 产物为模删的台成产物,除全台成产物外,其他各粪均与天然产物相关。 崮I I 曲物采塬统讨幽 A l ln e wc h e m i c a le n t i t i e s o r g z n i z e db y $ o L I r c e y c a f 目咽iUl一I一 目J=ni丌ii” niHiurI1hiwu一m 蚓 Ri”niiumi中一 iiHiiHiiiHiHij删籼删虹。寸j#刿。阿ii=划 例I2 小分子化台物中并种米源药物所山的比例 F i gI 一2 A l ls m a l l m o l e c u l e f l e wc h e m i c a le n t i f e sb ys o t l r c e ( 幽I 卜1 3 中1 3 代表生物曲物,N 代表大然药物,N D 代表漉于天然曲物后期进行半 台成r 作,s 代表全合成药物,s 幸代表全合成曲物,世曲效团来自天然药物,v 代表疫苗。) 在祈研究的药物中1 9 8 3 - 2 0 0 6 年间米搏丁天然产物的蓟物有2 3 1 种,全台成药2 8 9 种,天然产物4 4 。其中抗菌药物中7 8 是天然J “物,3 1 种抗癌药物中6 】是天然产物, 3 2s 的抗炎鲥物米源丁走然产物,5 2 种抗高血压药物中,4 8 足以天然产物为模型合成的。 截I r 到1 9 9 4 年8 7 种已被批准的抗癌曲物中,来自犬然产物的有5 4 种,I _ 6 2 。其中1 5 种是_ 天然产物,2 5 种是半台成衍生物。1 9 8 9 2 0 0 6 年司中请的抗癌药物中来自天然产物的 蓟物有1 2 8 种,【o6 I 。1 9 8 9 2 0 0 6 年间住愉床前利临床试用的药l 吊中有5 0 个化台物来自 天然产物,其中9 个求白海产晶,3 2 个微生物和9 个植物衍生物另外还有3 0 个是以天然 产物为模型合成的段8 8 个生物制一帚。1 9 8 3 1 9 9 4 年问,在9 3 种新批准的抗感染鲥物中米白 天然产物的有5 9 种I 6 3 ,其中7 个是纯t 丘然产物,4 5 个是、h 成衍生物,7 个是以天 然产物为模型合成的( N e w n a n 等,2 0 0 7 ) 。 1 2 未来天然药物研发的重点 新曲开发被视为一国医药工业的经济与技术实力的体现。进入九十年代后,全球经济进 入一个斯高速增睦j 。随着r 业国家_ 凡均国比收入的不断提高,现化文明病”已取代感染性 疾病l n 成为对人类健康威胁最人的疾病。这娄疾病包括:高血压、高血脂、糖尿病与精神瘐 病等。现以全球第一人蹉卦市场美国为例,至九十年代仞抗堪染药物销售额仅一l 该国医药市 而3 成销售份额,而降曲脂药、降i f , 曲、抗糖j 5 j 病药己迅速上升为医药市场的主打品种。反 映存新药开笸方【自1 ,往排名1 廿界前1 0f t 的九十年代巫暗炸弹曲品名单上,降血脂鲔稳居前 儿值,其中包括洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、F V 伐他汀以及抗过域药氯甫他定笛。九 1 年代新头号畅销l 铲奥黄拉唑”( 洛赛克) 的销售预高逃刮纪采的6 7 亿黄元。而一些精神 痫约物中枢神经系统曲物如氟阳汀、舍曲林、怕岁曲汀、氯氮平以及抗偏头疝曲舒马曲坦 均进八畅销曲物排名衍。 只霉将九十年代的匝暗纽药品名单八1 年代的进行对比即可蛙现:九十_ L = 代的畅销药 更若巫拄改善人1 ,命质自 的药物( 如降血脂曲、抗精神墒曲物) 而八十年代州以治疗1 ” 曲物为土耍的巫螃继卢r 铺。由此呵地,位两个不同的年代,吐暗绒曲r 的内涵己悄然笈生丁 变化。 毒一、卜E 舢 那么在二r 一世纪头十年里,重磅纽药品队伍叉将发生什么样的变化? 从事医曲信息1 j 开发工作的同行们均十分戈注这一问题。综台国外医药刊物的报道,可以认为今后几年国外 重点开按的新药包括: ( ”具有靶向治疗作用的新药,如专州于清疗晚期乳癌、肺癌、6 0 列腺癌取l 卵巢癌 的单克隆抗体粪新药,这类产品的特点是直接作用于肿瘤而不影响健康组织。 ( 2 ) 蛋白质多肚类清疗新蓟。这类产品品种多达上百种,己上市的胰岛素类、生K 激 素、某些酶雨l 降钙索之娄均为蛋自质多肽类产品。新开发的蛋白质多肚类产品将侧重于可 降低某些严重影响生活质量的疾病的新硭治疗剂,如阿尔菠海默氏症( 老年擅l 呆症) 治疗曲、 帕金森氏病衔疗曲、骨质疏栏治疗药、数菩老年妇女生命质量的药物( 如提高雌檄索分泌量 的药物改善与更年期后症状有关的曲物等) 。据悉九十年代末至二十一世纪初国外己开发 上市的蛋白质多肽类新药己有3 5 种之多,而目前正在扦发中的蚩白质,多肽类新曲多达1 0 0 多种其中不乏朱来的重磅级产品,如环戊肽类新药I n t e g r i l i n 、戈瑞林、布瑞林、亮丙瑞林、 F u z e o n ( 由3 6 个氨基酸组成的新型蛋白质类治疗药,可治疗H I V 病毒引起的免疫缺损症状) , F u z e o n 被科学家视为抗艾滋病新药开发的一个全新里程碑。它在二十一世纪极肯可能成为 第一只销售额突破1 0 亿毙元的蚩白质类新药。 ( 3 ) 其它治疗新鲥,如抗糖尿病的新药、减肥新药和治疗精神分裂症的新药均有可能 成为潜在的重磅级新l 产品。在九十年代有不少此类上市新药令人意料之外地进入重磅药物 排名榜,其中包括抗抑郁剂如氟两汀、舍曲林、帕罗西汀与氯氮平、舆氮平等。 综上所述,以重磅级新鲥的时代变迁可明显看出如下趋势,今后1 c 界级新药的开发将更 加侧重于能改善 们生命生活质晕的新曲,而畅销世界近、| 个世纪的抗生素类药物将退居 次席,但有一点可咀占定,抗肿瘤卦始终是世界各国医药厂商的新曲开发重点因为迄,夸为 I r 癌症仍为对 娄健康培大威胁之一。可以相信随着科学技术的小断发展,在新世纪里人定 会开拄山能对付可恶的舯瘤杀手的新型药物。 天然产物一直是创新曲物的一个重要来源。新药发展的历史实践业己表明,有些天然活 性产物如青霉素等不仅本身就可直接开发成新药产品而且还成了研制后续系列新曲产品的 削1 - 3 抗穆曲中吾米源药物所- 比例 F i gI - 3 A l la v a i l a b I ea n t i c a n c e r d r u gb yS O U r c e 重要先导物。即便是本身不宜直接开发的新的犬然活性产物往往也会为创新鲍物研究提供新 的活性尤导宝【= = 构,供进 步蚺牡J 故造平优化。由此可见,新活性大然产物的研究对创新药物研 究且订重要的意义, 避虬 东北农业大学理学硕十学位论文 1 3 天然产物的研究新方法 1 3 1 高速逆流色谱分离技术 高速逆流色谱( H S C C C ) 是近2 0 年迅速发展起来的新型液液分配色谱技术。它依靠 聚四氟乙烯蛇形管的方向性及特定的高速行星式旋转产生的离心力作用,使无载体支持的固 定相稳定的保留在蛇形管中,并使流动相单向、低速通过同定相。在短时间内实现样品在互 不相溶的两相溶剂系统中高速分配,继而达到连续逆流萃取分离物质的目的。与其他分离手 段相比,H S C C C 不用固相载体作固定相,并具有分离纯度高、样品回收率高、适用范围广、 可一步制备纯品的优点,既适用于小量分析,也可用于规模纯化,在生物、医药、天然产物 化学、环境分析、食品等领域有广泛的应用。特别是在天然产物有效成分的分离、纯化、制 备方面显示出强大的优势。 与传统的液相色谱法相比较,H S C C C 对样品的预处理要求非常低,仅需简单的提取, 甚至不用前处理都可达到好的分离效果( L i u 等,2 0 0 5 ;L i 等,2 0 0 5 ;L i u 等,2 0 0 5 ;L i 等, 2 0 0 5 ;W a n g 等,2 0 0 5 ) 。但由于天然产物中成分复杂,且大数有效成分含量低,因此近年来 国内外许多专家对样品制备做了一些探索,通过优化提取方法米提高得率以及用不同前处理 手段使得目标组分得到适当的富集。L i u 等( 2 0 0 5 ) 以氯仿甲醇水( 4 :3 5 :2 ) 为溶剂系统, 分离纯化淫羊藿中的3 种黄酮类有效成分。G a o 等( 2 0 0 6 ) 分别以正己烷乙酸乙酯甲醇 乙酸一水( 1 :6 :1 5 :l :4 ) 及乙酸乙酯一正丁醇乙腈一0 1 H C I ( 5 :2 :5 :1 0 ) 为溶剂体系,通过两步高 速逆流色谱分离,从灯盏花中分离制备黄芩素苷成分。L i u 等以正己烷2 乙酸乙酯2 甲醇2 水( 5 :5 :7 :5 ) 从中药吴茱萸中分离制备5 种生物碱类活性成分。L i u 等( 2 0 0 5 ) 以氯仿乙醇0 2 m o l LH C I ( 3 :2 :2 ) 为两相溶剂系统对浙贝母中的两种生物碱类活性成分进行分离。L i n g 等 ( 2 0 0 7 ) 以氯仿一甲醇2 3 1 0 2 m o l F L N a i l 2 P 0 4 ( 2 7 5 :2 0 :1 2 5 ) 为两相溶剂体系从苦参中分离制 备3 种生物碱类活性成分,所得化合物纯度均在9 5 以上。W e i 等( 2 0 0 6 ) 采用在线二维 H S C C C 联用技术分别以正己烷乙酸乙酯甲醇水( 1 :l :l :1 ) 年1 1 ( 5 :5 :4 5 :5 5 ) 为两相溶剂体系从 中药白芷中分离制备3 种香豆素类活性成分。L i 等( 2 0 0 4 ) 以正己烷乙酸乙酯乙醇水( 5 :5 :5 :5 ) 为两相溶剂体系从中药蛇床子中分离制备两种香豆素类活性成分。 1 3 2 液一质、液一核、液一质一核联用技术 L C M S 和L C M S “技术越来越多地在天然产物研究中得到应用。对其进行分析的化合 物类型范围也很广,包括黄酮( K i t e 等,2 0 0 3 :L a i 等,2 0 0 7 ) ,咖啡酸衍生物( L i 等,2 0 0 3 ) , 甾体及其苗( P i a z 等,2 0 0 5 ) ,萜类及其苷( K i t e 等,2 0 0 4 ;C h e r t 等,2 0 0 7 ;L i 等2 0 0 6 ) , 生物碱( K i t e 等,2 0 0 3 ) 等。 L C N M R 在上世纪7 0 年代后期已经提出,但是直到近十年,核磁共振技术不断发展,适 用- 丁梯度洗脱程序的新型探头使灵敏度增加、溶剂峰压制技术等,使N M R 与液相联用在技 术上成为可能,L C N M R 才真止得以应用( E x a r c h o u 等,2 0 0 5 ) 。O t m a rS p r i n g 等则首次 用L C N M R 对植物Z a l u z a n i ag r a y a n a 提取物中的倍半萜内酯类成分进行了分析,鉴定了3 个化合物,其中1 个可能是新化合物( S p r i n g 等,1 9 9 5 ) ,此后,L C N M R 在植物代谢物研 究中的应川范同更加广泛:包括脂肪酸( S y k o r a 等,2 0 0 7 ) ,黄酮( A n d r a d e 等,2 0 0 2 ) ,异黄 酮( R i j k e 等2 0 0 4 ) ,小脂素,单萜二聚体,倍、| ,萜,倍半萜内酯,二萜( S c h a l l e r 等,2 0 0 1 ) , 强心茁,糖茁:类化合物( G a v i d i a 等,2 0 0 2 ) ,禁醌,豢基异喹啉,四氢菲,咯生物碱,以及 4 引言 其他类化合物( V o g l e r 等,1 9 9 8 ;G u i l e t 等,2 0 0 3 ;王映红等,2 0 0 2 ;王映红等,2 0 0 1 ;H o s t e t t m a n n 等,2 0 0 2 ) 。 L C N M R 联用技术优点很多:减少了从提取到谱学数据测定中间的样品制各步骤,实 验周期缩短,减少样品分散,需要样品量少,样品消耗量低,分析速度快,结构信息多等等。 但是,L C N M R 灵敏度较低,只能分析混合物中含量较大的化合物;流动相溶剂峰的存在 更增加了困难,而且对某些基团没有信号响应。单独使用L C N M R 鉴定未知化合物的结构 是有限的。 L C M S ( L C M S “) 与L C N M R 集成应用,为未知化合物结构的鉴定提供了有效的工具 ( W o l f e n d e r 等,2 0 0 0 ) 。M S 快速筛选,并获得初步的结构信息;N M R 对其结构信息进行补 充,最终确定未知成分的结构。V o g l e r 等( 1 9 9 8 ) 结合应用这两种联用技术,鉴定了V e r n o n i a f a s t i g i a t a 中9 个倍半萜内酯的结构。此外,结合L C M S 和L C N M R ,对黄酮( W e b e r 等, 2 0 0 6W o l f e n d e r 等,2 0 0 3 ) ,黄酮苷( G a l l 等,2 0 0 3 ) ,异黄酮( Q u e i r o z 等,2 0 0 2 ) ,糅质( K r a u s 等,2 0 0 2 ) ,萜类及其苷( W a r i d e i 等,2 0 0 4 ;H o s t e t t m a n n 等,2 0 0 1 ) ,萘二酮衍生物( C o g n e 等,2 0 0 3 ) 、生物碱( B r i n g m a n n 等,2 0 0 1 ) 等化合物的分析都有所报道。 毫无疑问,L C N M R M S 在天然产物研究中的应用充分发挥了N M R 和M S 的优势,两 者所提供的结构信息相互补充。能够对天然样品中的复杂成分进行分析,对未知化合物进行 结构鉴定,使复杂的天然样品检测、分析、鉴定速度显著加快。通过L C N M R M S 进行化学 筛选,识别并锁定新型结构的化合物,有选择性和针对性地获取新型结构的化合物,有效避 免已知化合物的重复分离,显著提高获得新型结构化合物的几率和效率。 1 4 生物卤化的研究进展 生物催化生物催化体系是迄今为止人类所知的最高效和最具有选择性的温和催化体系。 生物体中的酶以远远超出人们想像的速度催化各种生化反应。酶不仅在生物体内,也能在生 物体外促进天然的和人工合成的化学分子的诸多转化反应,并且显示出优良的化学选择性、 区域选择性和立体选择性。 目前所知道的自然条件下产生的卤化物超过3 6 0 0 种,分别由真菌、藻类高等植物及动 物产生。自然产物中以氯代谢物和溴代谢物占主体,而碘代谢物和氟代谢物的含量则很小。 不同的卤代谢物各有其特定的物理、化学和生物作用。从细菌及真菌体内分离得到的卤化物 通常具有抗菌活性,例如氯霉素和氯四环霉素( 见图1 4 ) 。 H O C I O 洲0-100 - 10 0 图1 _ 4 氯霉素和金霉素的结构 F i g 1 4T h es t r u c t u r eo f c h l o r t e t r a c y c l i n ea n dC h l o r a m p h e n i c o l B o v i c e l l i 等( 2 0 0 2 ) 在研究中发现,黄烷酮在C 6 位置上被氯化或溴化,其亲和力在黄 酮卤化物中活性最强;在C 8 位置或C 6 和C 8 位置上被氯化或溴化,基本上没活性;但是 5 C - 6 位苴上被氯化或溴化,即使c 环上有一个甲氧基其活性诬是比较高。生物法中氯过氧 化酶能卣化黄烷酮、枘皮素、橙皮索等,在C6 自IC8 位置上可出现C 1 或B r 原子,但不 能在其他黄酮物质中卤化。等由八放珊瑚T e l e s t o r i i s e i 中分离到种抗肿瘤的卣化十一烷活性 物质。B e 曙e r 等( 1 9 7 2 ) 发现扁虱利用2 , 6 - 二氯苯酚做性信息素,而4 氯吲哚- 3 一乙酸是一种 植物生长激素( M l a r u m o 等,1 9 6 8 ) :从某些矿物中分离得到的卤化物通常具有医学防护作 用( G i b b l e 等,1 9 9 9 ) 。在自然条件F 氟化物的台成极其罕见。目前,我们所知道的自然条 件F 合成的少景氟化物是由两种链霉菌和一些生在热带和弧热带的高等植物产生的。人 们住许多药鼎中加入氟元素,使药物性能得到故善,例如抗癌药物氟尿嘧啶。另一种由细茁 代谢产生的氟化物是一种抗生素类核杀菌素,它是从涟霉菌中分离得到的。 人们在研究苗类卣代谢物 ;里霉素的合成时首改发现了卣化反应酶。在过氧化氢和氯 离子的I 同参与F ,这种酶催化了 尔里霉紊的后圳中间体的卤化反应,我们称这种酶为“氯 过氧化物酶”( S h a w 等,19 6 1 ) 。 在最近的研究中,曲班牙的S a l a s ( 2 0 0 5 ) 研究小组已经成功的建立了基嗣克隆和表达 系统对化台物进行生物由化的研究尽管酶催化卣化反应的应用还处于早期,但已经显示出 很大的席用的潜力。例如色氮酸7 卣化酶等F A D H2 卤化酶,在体内组合进行卤化和稽化 反应的基础上构建了一个可用于抗癌的蝴蝶霉素的化台物库。 【H 寸卜( c o 。 ;巧敬 I _ l l”b “1 、i 、r 1 “、巧毫j R 口州HJ t 1 、,l “ :,( 、- 卫 岔“惑j 倒1 - 5 通过生物卣化作,_ 的得剑的化合物伴 F i g I 一5B i o s y n l h e t i cp a t h w a y sf o rp r o d u c t i o no f t h ec o m p o u n d s 麓瓣 卜船一R R lli:、 。叫 j l H 楚蕊 一圆 i fV m , 四 气p 毡 吒垮 孥 | | 叫。 p T o 11V wo 6 引肓 曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼曼曼量曼曼。 I I m E l l E EI I I 舅曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼舅 卤化物的合成有化学法和生物法,生物法的过程温和有效,选择部位准确,但只能在确 定物质部位卤化,产量也比较低;化学法的产量较高,但过程不宜控制,易引入有毒物质, 所以生物法具有一定的潜力。 1 5 本研究的内容和意义 医药产业是目前世界上发展最快的产业之一,多年来一直保持快速增长,在国际上被公 认为“永不衰落的朝阳产业”。从天然产物中寻找新的药物一直是各国科研工作者研究的热 点。本研究通过通过对垂子买麻藤及一株放线菌化学成分的研究,最终分离得到具有生物活 性的物质。主要研究内容为: ( 1 )垂子买麻藤中化合物的分离纯化; ( 2 ) 通过波谱信号对垂子买麻藤中化合物进行结构鉴定; ( 3 ) 通过活性跟踪的办法对放线菌发酵液中的化合物进行分离纯化 ( 4 ) 对从放线菌发酵液中分离的化合物进行结构鉴定 ( 5 ) 对放线菌生物氯化特性的初步研究 经过研究最终从垂子买麻藤中分离出一个全新的化合物,我们是首次报道。从放线菌 中分离得到具有生物活性的化合物,并且它本身所具有生物氯化的特性值得我们去进一步的 研究,我们可以将此放线菌中有关卤化基因克隆出来并且进行体外表达,对黄酮类的化合物 进行氯化或者溴化,这将是非常有意义的一项工作。 7 东北农业人学理学硕十学位论文 2 垂子买麻藤化学成分的研究 买麻藤因性近麻而得名,本草纲目拾遗中日其:“性柔易治,以制履,坚韧如麻, 故名,言买麻得藤也”,又名买子藤等( 中华本草,1 9 9 9 ) 。买麻藤为买麻藤纲G n e t o p s i d a 买麻藤科G n e t a c e a e 买麻藤属G n e t u m 裸子植物,全世界仅一个属,共3 0 多种,分布于亚 洲、非洲、南美洲,其中南亚最多。我国境内有1 0 种,药用8 种,主要分布在两广、云南、 海南及福建等地。在云南北纬2 5 。以南的地区,就有5 种3 个变型,足见我国买麻藤资源 丰富( 祁振声等。2 0 0 0 ) 。现代药理研究表明,买麻藤煎剂对甲型链球菌等多种细菌都有不 同程度的抑制作用( 中药大辞典,1 9 8 6 ) ,其有效成分有平喘作用,此外,还具有抗过敏及 抗蛇毒作用( 辛宁等,1 9 9 8 ) 。 2 1 实验部分 2 1 1 仪器、材料与试剂 旋转蒸发仪( R o t a v a p o rR 一2 0 0 ) 核磁共振仪( D R X 4 0 0 ) 质谱仪( L C QA d v a n t a g e ) 三用紫外分析仪 电子天平( T B 一2 1 4 ) 正相硅胶( 柱层析用) 高效薄层硅胶板( H G F 2 5 4 ) 凝胶( L H 2 0 ) 所有试机均为分析纯,H P L C 用色谱纯 2 1 2 材料的来源、鉴定及处理 瑞士B I C H I 瑞士B r u k e r 美国F i n n i g a n 江苏其林贝尔 美国D e n v e r 青岛海洋化工厂 烟台化工研究院 上海安马西亚 植物材料于2 0 0 3 年取自于云南省西双版纳,大藤本,皮灰棕色,皮孔突起,密生而明 显。叶片革质,窄椭圆形至矩圆状卵形,长1 0 1 8 厘米,宽4 7 厘米,先端急尖或短渐尖, 基部圆或宽楔形,侧脉8 1 0 对,稀疏互生,叶柄长达1 5 厘米。雄球花序顶生,3 - 4 回分枝, 形成稀疏的大形圆锥花序,雄球花穗长1 1 5 厘米,粗3 4 毫米,环状总苞将雄花包围在内, 每轮总苞内有雄花4 5 7 0 ,雄花的基部仅有极少的短毛,假花被倒圆锥状盾形,顶端平,成 不规则的四或五角行,基部窄细,花丝合生,花药矩圆形,花穗上端有1 4 1 6 朵倒披针状不 育雌花排成一轮;雌球花序一次分枝,稀不分枝,花穗有环状总苞1 2 2 1 轮,每轮有雌花 1 0 2 1 。雌球花穗成熟时格伦的间距1 5 2 5 厘米,轴粗壮,经3 4 毫米。成熟种子倒卵状长 椭圆形,长3 4 厘米,径达1 8 厘米,先端钝圆或急尖,基部逐渐窄缩而下成延柄,炳长2 3 厘米,径2 3 毫米。鉴定为垂子买麻藤( G n e t u m p e n d u l u mC Y C h e n g ) 。样品经阴干后, 切成小块保存。 8 图2 - 1 乖子买麻藤的照片 F i g2 - lT h ep i c t u r eo f G n e t 蜊p e n d u l 州CYC h e n g 21 3 化合物的提取和分离 将4K g 干燥的垂F 买麻藤兰打成粗粉,用9 5 的乙醇在审温F 攫泡充分提取。收集提 取液,减压除去溶剂后的浸膏状物质F I ( I7 9g ) 用水恳混后用乙酸乙酯萃取三次,把乙酯 相蒸干后得到粗提物F 2 ( 3 0g ) 。将F 2 粗提物上硅胶( 1 0 0 2 0 0 目) 柱层析,以p e l r o l e u m e t h e r - M e z C O ( 9I - 1 :1 ) 梯度洗脱。每份收集3 0 0m l ,其收集1 0 个流份,根据T L C 检删 层忻液为p e t r o l e u me t h e 卜M e 2 C O ( 31 ) 将第三个流份希第六个流份蒸干后分别得到F 3 ( 4 0 曲和F 4 ( 17 9 ) 。取F 3 ( 4 0 9 ) 上硅胶( 2 0 0 - 3 0 0 目) 柱层析,川p e t r o l e u me t h e rE t o A c ( 9 1 1 1 ) 梯度洗脱每份收集5 0 m l ,共收集2 9 个流份,T L C 检测,层析系统为p e t r o l e u me t h e r - M e 2 C O ( 3I ) ,台井15 - 2 2 流份羹干得到F 5 ( 4 3 0m g ) 将F 5 再上硅胶( 2 0 0 - 3 0 0 目) i q - 层析,咀 p H m l e u me t h e rM e ,C O ( 9 :1 3 :2 ) 梯度洗脱每份收集2 0 州,共收集3 3 个流份,经T L C 检删,层析液为p e t r o l e u me t h e r - M e ,C O ( 3 1 ) 台并I I 1 7 流份蒸除i 弃荆得到化合物I ( 1 7 m g ) ,台井1 9 - 2 4 流份蒸除溶剂得到化台物I I ( 1 2 m g ) 。墩F 4 ( I7g ) 上硅股( 2 0 0 3 0 0 目) _ 卜 = 层忻H C H C I ,M e O H ( 9 9 :I 1 71 ) 梯度洗脱,每份收集2 0 m l ,共收集3 1 个流份T L C 检测层析系统山p e t r o l e u me t h e r - M e 2 C O ( 3 :”,台并1 3 - 2 1 流份蒸干得到F 6 ( 2 4 0 m g ) , 将F 6 再上凝腔( L H 一2 0 ) 柱层析以M e O H 洗脱,每份收集2 0 m 】,共收集2 9 个流份,经 T L C 检洲,层析液为P E M e ,C O ( 3 I ) 台并13 - 2 0 流份篓除溶剂得到化f 物1 1 ( 2 】m g ) , 台亓2 2 - 2 7 流份蒿际溶剂得到化台物( 1 I m g ) 。 东北农业人学理学硕十学位论文 2 1 4 分离流程图 土薹釜高蓑差鎏凳水 混悬液 l 乙酸乙酯萃取三次 I 蒸除溶剂 浸膏状物质F 2 ( 3 0g ) 硅胶( 1 0 0 - 2 0 0 目) P E M e 2 C O ( 9 :1 一l :1 3 0 0m l 流份,赛 硅胶( 2 0 0 - 3 0 0 目) 1r 组分3 ( F 3 ,4 0g ) I I 硅胶( 2 0 0 - 3 0 0 目) 柱层析 lP E M e 2 C O ( 9 :1 1 :1 ) I 5 0m l 流份,共2 9 个流份 IT L C 检测P E M e 2 C O ( 3 :1 ) 1 5 2 2 流份( F 5 ,4 3 0m g ) 硅胶 P E M I 2 0m 1 T L C 检 1 1 1 - 1 7 流份1 9 - 2 4 流份 I 蒸干I 蒸干 化合物I 化合物 流份 组分6 ( F 4 ,1 7g ) I I 硅胶( 2 0 0 - 3 0 0 目) 柱层析 lC H C l 3 一M e O H ( 9 9 :卜1 7 :1 ) I 2 0m l 流份,共1 0 个流份 IT L C 检测P E M e 2 C O ( 3 :1 ) 1 3 - 2 1 流份( F 6 ,2 4 0m g ) ) 柱层析 :2 ) 3 3 个流份 0 ( 3 :1 )1 1 1 凝胶 M e O H i 2 0m 1 流份 T L C 检 1 1 3 2 0 流份 2 2 2 7 流份 I 蒸干I 蒸干 化合物化合物 图2 - 2 分离流科图 F i g 2 - 2F l o wd i a g r a mf o ri s o l a t i o n l O 柱层析 共2 9 个流份 M e 2 C O ( 3 :1 ) 垂予买麻藤中化学成分的研究 2 2 研究结果 2 2 1 化合物的结构鉴定 化合物I :白色粉末,易溶于甲醇,丙酮,石油醚; 从E S I M S 中的分子离子峰2 4 l 【M H 】以及H R E S I M S 中的分子离子峰2 4 1 3 2 9 6 M H 】推测其分子为2 4 2 ,结合1 H N M R ,1 3 C N M R 谱可以确定其分子式为C 1 5 H 1 4 0 3 ,从它 的不饱和度来看很有可能含有苯环。 由I R 谱在3 5 0 6c m 。1 有很宽的吸收可以推断其苯环上连有羟基,从红外和紫外的吸收 来看,其不饱和度可能来自苯环或者双键。结合1 H N M R 以及1 3 C N M R 信号显示其为典型的 均二苯乙烯化合物,其中万7 2 5 ( 1 H ,m ) ,7 3 4 ( 2 H ,b r t ,= 7 5H z ) ,7 4 7 ( 2 H ,d ,= 7 5H z ) 为含有有羟基的B 环上两个对称位置的氢,此夕1 , 8 7 2 5 ( 1 H ,m ) 贝J J 为为苯环C 1 2 上的一个氢, 万6 9 2 和6 9 8 ( I H ,d ,J = 1 6 3H z ) 信号推测其可能是连接两个苯环的双键上的氢,万6 6 9 ( 2 H , b r s ) 显示的是A 环上

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论