（农业生物环境与能源工程专业论文）高温逆境下菜豆膜伤害机理及调控措施的研究.pdf

摘要 | 高温逆境是设施及夏季露地蔬菜栽培中普遍存在的问题，尤其是在夏季，设施内的气 温常常高达4 0 c 以上，致使作物的生长发育严重受阻，产量和品质下降，造成巨大损失。 因此，对作物耐热性的研究受到人们越来越多的关注。对作物耐热性的研究不仅有助于揭 示植物在高温逆境下免遭伤害的各种生理、生化变化规律，而且有助于发展各种增强作物 膜脂脂肪酸组成、光合特性、膜稳定性等方面研究了高温胁迫对菜豆的影响。另一方面以 我国生产上主栽菜豆品种“美国地豆”为材料，研究各种膜稳定剂对缓解菜豆高温胁迫的 作用1 研究结果表明：( 1 ) 高温胁迫条件下。菜豆类囊体膜脂中脂肪酸的饱和程度提高， 有利于植物抵抗高温逆境，且耐热菜豆品种较热敏感菜豆品种类囊体膜脂中脂肪酸的饱和 程度高；( 2 ) 在高温胁迫条件下，对耐热品种和热敏感品种膜稳定性及光合特性的研究均 证实耐热品种较热敏感品种对高温表现了较强的适应能力：( 3 ) 自然高温逆境条件下给菜 豆喷施各种膜稳定荆，其中5 0 m g l 脯氨酸增产效果明显，说明它对缓解菜豆高温逆境有 一定的作用通过高温胁迫条件下喷施5 0 m g ，l 脯氨酸后测定膜稳定性等生理指标，从机 理上进一步验证了脯氨酸增产的原因。 ， 关健词。集高温胁迫_ 类囊体潞膜疆i 继，调控施耖 h i g ht e m p e r a t u r es t r e s s i sac o m m o np r o b l e mf o rh o r t i c u l t u r a lp l a n t se s p e c i a l l yt h o s e g r o w ni ng r e e n h o u s e t h ea d v e r s ee f f e c to fh i g ht e m p e r a t u r es t r e s so nt h ey i e l da n dq u a l i t yo f h o r t i c u l t u r a lp l a n t si sv e r ys e r i o u s s om o r ea n dm o r ee x p e r t sa t t a c hi m p o r t a n c et ot h er e s i s t a n c e o fh o r t i c u l t u r a l p l a n t s t oh i g ht e m p e r a t u r es t r e s s s u c hr e s e a r c hc a l ln o to n l yc o n t r i b u t et o u n d e r s t a n dt h e i n j u r y a n da c c l i m a t i o nm e c h a n i s m so fp l a n t sg r o w ni nh i g h t e m p e r a t u r e c o n d i t i o n s ，b u ta l s oh e l pt od e v e l o ps o m et e c h n o l o g i e st o a l l e v i a t es u c hs t r e s s t h i sp a p e r r e v i e w st h er e s p o n s eo fm e m b r a n e so fv e g e t a b l ec r o p st oh i g l lt e m p e r a t u r es t r e s s a n di t s a c c l i m a t i o nm e c h a n i s m s ，i n t r o d u c e st h es o l u t i o n st os u c hs t r e s s t h i se x p e r i m e n tc o n s i s t st w o s e c t i o n s i no n es e c t i o n ，t h er e s p o n s eo fc o m m o nb e a nc u l t i v a r sd i f f e r i n gi nh e a tt o l e r a n c e ， 8 5 - c t , s t r i k e ( h e a tt o l e r a n t ) a n db b l - 4 7 ，b s l - 2 4 0 ( h e a ts e n s i t i v e ) i nt h ed e g r e e o fs a t u r a t i o no f t h y l a k o i dm e m b r a n ef a t t ya c i d s ，t h ec o n t e n to fc h l o r o p h y l l ，t h ec h a n g e so fp h o t o s y n t h e s i s ，t h e s t a b i l i z a t i o no fm e m b r a n e s ，t oh i g ht e m p e r a t u r es t r e s sa r er e s e a r c h e d i nt h eo t h e rs e c t i o n ，t h e e f f e c to fr e g u l a t i v er e a g e n t so nc o m m o nb e a ng r o w nu n d e rh i g i lt e m p e r a t u r ea t es t u d i e d t h e d e g r e eo f s a t u r a t i o no ff a t t ya c i d sh a sb e e nm e a s u r e df o rt h y l a k o i dm e m b r a n e si s o l a t e df r o m l e a v e so fc o m m o nb e a n sg r o w nu n d e ro p t i m a la n dh i g ht e m p e r a t u r e a l t h o u g ht h el i p i d - c l a s s c o m p o s i t i o n i sn o ts i g n i f i c a n t l yc h a n g e df o rt h et w oc o n d i t i o n s ，t h ed e g r e eo fs a t u r a t i o no f f a t t y a c i d si sg r e a t e rf o rh i g h t e m p e r a t u r e t h a no p t i m a l t e m p e r a t u r ep l a n t s f u r t h e r m o r e ，t h es a t u r a t i o n o ff a t t ya c i d si sg r e a t a rf o r8 5 - c ta n ds t r i k et h a nb b l m 7a n db b l - 2 4 0 t h er e s e a r c ho ft h e c h a n g e so fp h o t o s y n t h e s i s ，t h es t a b i l i z a t i o no f m e m b r a n e st oh i g ht a m p e r a t u r es t r e s sp r o v et h a t 8 5 - c tc a ni n d e e dt o l e r a t eh i g ht a m p e r a t u r es t r e s st h a nb b l - 4 7 i ns e v e r a lr e g u l a t i v er e a g e n t s , t h e p r o l i n e ( 5 0 m g l ) c a nm a r k e d l y i n c r e a s et h e y i e l d a n d i m p r o v e t h es t a b i l i z a t i o no f m e m b r a n e so fc o m m o nb c a i ig r o w nu n d e rh i 【g ht e m p e r a t u r e ，i no t h e rw o r d s ，i tc a no b v i o u s l y a l l e v i a t et h es t r e s so f h i g h t e m p e r a t u r e k e y w o r d s ：c o m m o n b e a n ，h i g ht e m p e r a t u r es t r e s s ，t h y l a k o i d m e m b r a n e l i p i d s ， s t a b l l i z a t i o no f m e m b r a n e s 。c e n t r e i 2 第一章前言 在诸多的逆境胁迫中，温度是对作物的生长发育有很大影响而又不易人为控制的一种。 在低温胁迫对作物的影响及作物的抗冷、抗冻机理方面，前人作了大量研究【l 】1 2 】吐相比 之下，对作物耐热性的研究则较少。人类的活动。尤其是工业的发展，使全球气温不断升 高。近年来世界各地频遭热浪袭击，而且预计这种趋势仍会继续h 】。气温的升高不仅给人 们的生产生活带来了极大的不便，而且也在很大程度上影响了作物的正常生长发育。高温 逆境更是设施栽培中普遍存在的问题，尤其是在夏季，设施内的气温常达4 0 c 以上，致使 作物光合作用受阻，生殖器官发育不良。产量和品质下降，造成巨大的经济损失。因此。 对作物耐热性的研究引起人们越来越多的关注。对作物耐热性的研究不仅可以丰富植物逆 境生理学，而且还可以揭示植物在高温逆境下遭受伤害的生理、生化变化规律，进一步找 出与作物耐热性密切相关的生理生化指标在此基础上才可能制定增强作物耐热性的技术 措施，以及更有效的选育耐热性强的品种，达到稳产高产及提高品质的目的。 蔬菜必须周年均衡供应市场需求和不耐贮运的特点决定了抗热性研究对蔬菜生产的特 殊意义。加之长期以来人们对蔬菜高温伤害的基础研究远不如对低温伤害的研究深入，以 致在抗热性鉴定和抗热品种选育以及降温措施等方面都缺少必要的实验积累和理论指导。 高温胁迫是胁迫强度和胁迫时间两方面共同作用的结果。b e l eh r a r e k b j o r k a 和b e r r y 总 结提出了高温伤害的两种基本类型：长期( 几天或几星期) 处在稍高于适宜生长温度条件 下的高温胁迫和短期( 几分钟或几小时) 处在相对很高温度下的高温胁迫由这两种类型 的高温胁迫导致的伤害是完全不同的前者引起的多为间接伤害，高温导致代谢异常，渐 渐使植物受害。其过程是缓慢的，高温持续时间越长或温度越高伤害程度也越重；而后 者对植物造成的多为直接伤害，高温直接影响细胞结构，使蛋白质变性，腊类移动，造成 膜伤害。在短期接触高温后，当时或事后就呈现热害症状。在露地和设施栽培中，高温对 植物造成的伤害大多数是缓慢的间接伤害“1 。 菜豆是在全球分布很广的作物之一，属喜温蔬菜，既怕严寒，又畏酷暑，幼苗生长适 温为1 8 2 0 ，花芽分化适温为2 0 一2 5 营养生长最高能忍耐的温度为3 5 1 2 。菜豆对 日照长度要求不严，光饱和点为3 6 3 4 5 4u e m - 2 s - l 。光补偿点为2 7u e m - 2 s - 1 。它对高温敏 感，在炎热气候条件下生长常发生大量落花落英，从而严重影响产量f 6 。本实验以菜豆为 材料进行高温逆境伤害机理及调控措施的研究具有代表性，同时也能为其它作物的抗热性 鉴定和抗热品种的选育提供理论依据 3 本研究中选用的两对耐热性存在明显差异的菜豆品种，它们对高温胁迫反应的差异在 很多方面都已被证实沈征言揭示了这几个品种在高温下单花花粉粒数目、结荚数等的差 异【7 l 】：金新文研究了它们在高温胁迫下的蒸腾强度、种子活力及种子a t p 含量的变化川； 王光耀比较研究了两个品种高温处理后叶片超微结构及其贮藏物质的差异1 7 2 i i ”l ：尚庆茂等 研究了抗热性不同的菜豆品种高温下蒸腾强度日变化的差异 7 4 1 。 林鸣的研究发现，菜豆在不同生育期、不同器官( 叶片和下胚轴) 获得抗热性的能力 不同，经热锻炼后获得的抗热性在叶片上表现出品种间的差异，而在下胚轴中则没有【8 “。 赵丽的研究发现，菜豆叶片在不同的生长阶段耐热潜势( h t p ) 有明显差异，其中成叶( 充 分展开的叶片) 阶段菜豆h t p 在较长一段时间内基本保持稳定，且品种间差异也充分显现， 因此，进行品种闻耐热性比较鉴定时，应以成叶做试材，而叶龄很大的叶片不宜使用【8 3 】。 本实验在前人研究的基础上，进一步从以下几个方面研究抗热性不同的菜豆品种对高 温胁迫的适应机制。 1 1 类囊体膜脂组分与植物耐热性的关系 众多研究表明，高温胁迫会影响许多生理过程。如光合作用、呼吸作用、蒸腾作用及 膜的稳定性等，其中光合作用是对高温最敏感的1 8 1 0 1 。对于生物膜来说，不同的生物膜对 高温的反应不同。对各种分离膜系统的研究表明，类囊体膜比线粒体膜和原生质膜对高温 胁迫的反应更敏感叶绿体高温处理后导致光合反应的热失活是在不耐热的类囊体膜上 u o l u l l 1 1 1 2 1 。 类囊体膜以脂双分子层形式为光系统i 、光系统、光系统i i 捕光叶绿素a b 蛋白复 合体、细胞色素b f 复合体和偶联因子( c f o - - c f , ) 提供疏水环境并将其装配在膜上。负责光 能捕获和电子传递以及光能磷酸化等过程【7 1 类囊体膜的稳定性对高温逆境中蔬菜的光合 效率有直接作用，它的稳定性在很大程度上影响着其它生物膜的稳定性，具有高温逆境信 号的放大作用，因此类囊体膜的稳定性可能与蔬菜高温伤害密切相关。 在生物膜的结构和功能中，膜脂成分起着重要作用。它既能影响生物膜的流动性又能 影响膜结合酶的活力按照生物膜的流动镶嵌学说膜的双分子层脂质的物理状态通常呈 液晶相，温度过高时会转化成液相，过低时会转化成凝胶相，后两种状态都会影响镶嵌于 脂质中的蛋白质的功能【1 4 j ，使膜功能受到伤害【1 3 】植物对温度的适应在于减轻或避免膜脂 相变的发生【i ”膜脂组成中不饱和类脂或不饱和脂肪酸含量高时相变温度低。反之则相变 温度较高“。 植物类囊体膜脂组成有其特殊性。动物细胞膜、植物细胞质膜以及除去叶绿体之外的 其它细胞器膜脂成分主要是磷脂，而类囊体膜上主要是不带电荷且富含不饱和脂肪酸的糖 脂，即单半乳糖基甘油二脂( m g d g ) 和双半乳糖基甘油二脂( d g d g ) ，含量分别占总脂 的4 5 - 5 0 和2 5 - 3 5 其主要磷脂组分磷脂酰甘油( p g ) 为1 0 左右而且在植物膜 脂的不同磷脂中。磷脂酰甘油( p g ) 主要存在于类囊体膜上，不仅脂肪酸较饱和，而且它 的c 1 6 1 ( 3 t ) 脂肪酸残基的双键是反式的，熔点较顺式的c i 6 ：1 ( 9 c ) 高得多，所以通常将c 1 6 3 1 1 作为饱和脂肪酸计算| 1 4 1 。类囊体膜中的酰基甘油腊还包括异鼠李糖基甘油二脂( s q d g ) ， 其含量比p g 要低。类囊体膜脂的特殊性决定了类囊体膜上脂蛋白的相互作用有其特殊 性，进而就可能对类囊体膜结构及光合作用过程中的系列过程起到重要作用n g 】【1 ”。 高温引起膜类脂发生相交，从而破坏膜的结构及其功能是高温引起膜伤害的机理之一。 原来高温下蛋白质变性和蛋白质中二硫键的热稳定作用是普遍被接受的，但自从提出膜脂 相变假说人们转向植物膜脂在高温适应下饱和化的意义p 。膜脂的流动性受膜脂组成、 膜脂脂肪酸的不饱和度、脂，蛋白比值等的影响【1 2 w q 。高温使细胞膜系统的组成发生变化， 膜脂的流动性增大，以致不能保持原有的膜脂生理功能，并在膜上产生一些孔隙，破坏膜 的选择透性引起离子渗漏凡是组成膜脂的脂肪酸饱和程度越高，其流动性越不容易受 高温影响，抗热性也就越强1 2 0 j 类囊体膜脂的饱和程度对植物耐热性的影响要比其它细胞 器膜脂饱和程度对植物耐热性的影响更大膜脂的饱和程度主要受膜脂成分及其不饱和脂 肪酸的含量决定的研究表明：类囊体膜脂饱和程度的提高能够增强膜的稳定性，从而有 利于植物抵抗高温逆境1 2 1 1 2 2 1 1 2 3 1 y u u k im u r a k a m i 等人用转基因烟草和拟南芥突变体研究不 饱和脂肪酸含量与植物耐热性之间的关系其中两种转基因烟草t 1 5 和1 2 3 的叶绿体中的 编码三烯脂肪酸合成酶的基因被抑制，f a d 7 、f a d s 拟南芥突变体中缺少t , o 3 脂肪酸去饱和 酶研究结果表明( 1 ) t 1 5 和1 2 3 烟草叶绿体中三烯脂肪酸的相对含量要显著低于野生种 烟草叶绿体中三烯脂肪酸的相对含量，而二烯脂肪酸的相对含量正相反 ( 2 ) 在2 5 5 5 c 的温度范围内，通过测定p s i i 的放氧量来评价光合作用的强弱。在4 0 ( 2 时野生烟草的光 合作用显著下降，而t 1 5 和1 2 3 转基因烟草在4 0 ( 2 时光合作用还要高于2 5 c 时的光合作 用用f a d 7 、f a d 8 拟南芥突变体及野生种做实验也得到了相似的结果但另一拟南芥突变 体f d 3 ( 其内质网上缺少o 3 脂肪酸去饱和酶) 在此温度范围内光合作用下降的趋势与野 生种相似。说明影响光合作用在高温下发生变化的因子是类囊体膜脂中的三烯脂肪酸而不 是非叶绿体膜脂中的三烯脂肪酸( 3 ) 拟南芥野生种和f a d 7 、f a d s 突变体均生长在同样的 5 高温条件下，野生种的生长明显受到抑制不久后蒌蔫，而f a d 7 f a d 8 突变体的生长受高温 的影响不大。实验中能对高温产生抵抗作用的转基因烟草及拟南芥突变体与各自的野生种 的唯一区别就是：前者含有较低水平的三烯脂肪酸及较高水平的二烯脂肪酸口”。整个实验 结果说明叶绿体膜脂中不饱和三烯脂肪酸含量的降低有利于植物抵抗高温逆境。植物类囊 体膜脂饱和程度的提高有利于植物抵抗高温逆境，但其机理却众说不一。有研究表明，高 温条件下类囊体膜脂饱和程度的提高能够提高p s i i 捕光色素蛋白复合体的热稳定性。进而 也增强了整个光合作用的耐热性1 2 4 】f 2 5 1 1 2 6 j 。另有研究表明，类囊体膜脂饱和程度的提高可能 提高了一些脂的相分离温度如提高了单半乳糖基甘油二脂向非双层结构脂转化的温度。 脂相分离能够破坏膜的组成和结构，而相分离温度的提高能够在一定程度上保护膜结构 1 2 3 1 1 2 6 1 2 7 1 1 2 8 1 。 目前的研究多是针对某一作物品种在高温逆境下脂类的变化，而对耐热性不同的作物 品种在高温胁迫下类囊体膜脂变化的研究尚未见文献报道。而且对植物类囊体膜中脂类 及脂肪酸在逆境胁迫下作用的研究主要基于机理方面，而在应用方面研究比较少。 1 2 活性氧代谢及其清除系统酶活性水平与作物耐热性的关系 自由基伤窖假说是高温下膜伤害机理的又一假说。活性氧伤害植物的机理之一在于它 能够启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作用，进而破坏膜结构。一般把生物体内直接或间接由氧 转化成的氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质统称为活性氧其中包括超氧化物自由基 ( 0 2 一) 、羟自由基( + o h ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、脂类过氧化物( r o o ) 、单线态氧( 1 0 2 ) 等。在活性氧中，许多属生物自由基。它们具有极活泼的化学性质，本身不稳定，只能在 瞬间存在。但能够持续的进行连锁反应。因此在生命活动中起着重要的作用卿l 。 植物体内的活性氯自由基产生于叶绿体的光合作用和线粒体的呼吸作用。正常情况下， 在生物体内活性氧自由基在不断的产生。但也在不断的被消除处于动态平衡状态，此时 体内自由基的浓度是极低的，它们不仅不会损伤机体。而且还可以显示其独特的生理作用。 但在胁迫条件下( 包括低温、高温、干旱等) 。不良环境条件会影响体内自由基代谢系统的 平衡即增加活性氧的产量和破坏、降低活性氧清除系统的酶活性或含量i 。大量迅速生 成的氧自由基若不能及时被活性氧清除剂分解，它们将引发一系列的膜脂过氧化反应。所 谓膜脂过氧化就是指在生物膜的不饱和脂肪酸中发生的一系列自由基反应。它是自由基对 类脂中的不饱和脂肪酸引发而产生的，井由此产生对细胞有毒性的膜脂过氧化物。膜脂过 氧化的中间产物自由基能够引发蛋白质的聚合和交联，对生物膜造成严重伤害舯】 6 植物对膜脂过氧化有两类防御系统。一类是酶促防御系统，包括s o d 酶( 超氧化物歧 化酶) 、c a t ( 过氧化氢酶) 、p o d ( 过氧化物酶) 等。另一类是非酶促防御系统，包括维 生素e 、维生素a 、辅酶q 等l 。 s o d 酶是活性氧清除系统中的一个关键酶，因为它能够催化超氧化物自由基歧化成 h 2 0 2 和0 2 ，从而消除它的毒害作用l ”1 。一般认为，s o d 酶的活性与植物抗氧化胁迫能力 呈正相关。吴国胜等发现，在高温胁迫下，大白菜叶片s o d 酶活性表现为先上升后下降的 趋势，耐热性强的品种s o d 酶活性波动的幅度比较小【6 ”。过氧化氢酶的功能就是降解细 胞中的h 2 0 2 ，因此它的活性的降低将会导致h 2 0 2 的积累。通过h e r b e r t w e i s s 反应，h 2 0 b 能够和0 2 作用生成毒性更大的羟自由基。羟自由基能够直接攻击不饱和脂肪酸，导致细 胞中膜脂过氧化【”1 f r i d o r i c h 等认为植物在高温逆境下。细胞内的超氧自由基、羟自由基的产生和消除系 统的平衡受到破坏，即增加了话性氧( 0 2 。h 2 0 2o h - ) 、单线态氧( 0 2 1 ) 的量，破坏或降低了 活性氧清除剂，如s o d 、c a t 、p o d 、谷胱甘肽还原酶等保护酶系统的活性及维生素e 、 维生素c 、类胡萝h 素等保护剂的结构或含量水平。此时积累的自由基首先伤害膜系统， 膜内的拟脂双分子层中的不饱和脂肪酸链易于被氧化分解而造成整体膜的破坏【”】。 m d a ( 丙二醛) 是膜脂过氧化的主要最终产物 3 4 1 ，常被作为判断膜脂过氧化作用的一 个主要指标，它也会对生物膜造成严重损伤t 3 0 1 。 很多实验结果表明：高温加剧了膜脂过氧化。膜脂过氧化产物m d a 的含量随高温胁 迫程度的加大而增加，且s o d 和c a t 均随热胁迫程度的增加而降低但苗期适当的高温 锻炼能够提高或维持膜保护酶的活性，减轻膜脂过氧化程度，从而增强幼苗对高温的抵抗 能力1 1 3 6 1 1 3 7 1 因此，高温对膜的伤害也像干旱和低温胁迫一样与膜脂过氧化有关p 。1 1 3 ”。 活性氧代谢失调是植物在各种逆境胁迫条件下遭受伤害的共同机理之一，并且由于不 同逆境对植物活性氧的影响十分相似，故活性氧代谢能够反映植物的综合抗逆性 2 0 1 。王鸿 先等人认为：活性氧代谢平衡的能力可作为植物抗性的生理指标以及用于品种的鉴定和选 育l 。 1 3 质膜的稳定性与作物耐热性的关系 高温也可导致质膜稳定性的破坏。但所需温度远高于类囊体膜受影响的温度1 8 1 当高 温胁迫达到一定程度时质膜透性发生变化，导致电解质外漏，电导率升高在很多研究 7 中都采用测电导百分率的方法评定植物的抗热性i 1 l 。但也有部分研究表明：直接用电导百 分率的方法评定植物的抗热性的结果与通过光合器官的一些变化来测抗热性的结果不一 致。司家钢等人认为，直接用电导百分率来评定植物的抗热性不够准确，电导百分率在高 温处理后与未处理之间的差值才能更好的反映植物的抗热性f 9 】 4 ”。 1 4 调控措施的研究 1 4 1 钙元素对缓解植物高温胁迫的作用 钙不仅是植物生长所需大量元素之一。而且也是一种转导许多生理过程的胞内信号分 子。在胁迫条件下，胞内游离c a 2 + 显著增加h “，这种增加可以启动基因表达。激活一系列 生化反应，使植物能够适应环境胁迫h ”。c a 2 + 可作为磷脂的磷酸和蛋白质的羧基间联结的 桥梁，使膜的结构更牢固。目前认为，c a 2 + 可作为生物膜的稳定剂。c a 2 + 与细胞壁中果 胶酸形成果胶酸钙，保护中胶层结构，同时它具有抑制多聚半乳糖醛酸酶活性的作用，因 而减少细胞壁的分解； g o n g 等发现用c a c b 浸种能够提高玉米幼苗的抗热性，而用m g c l 2 则不能。他们的 实验表明：在热胁迫下，用c a c l 2 浸种的幼苗比那些没有用c a c l 2 浸种的幼苗能维持相对 较高的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性，较高的保护酶活性有 利于减轻膜脂的过氧化作用i “1 。在钙与低温胁迫、干旱胁迫及渗透胁迫的研究中也表现出 了类似的结果h ”。 w e i s s 认为胞外c a 2 + 对高温伤害的减轻作用可归结到c a 2 + 对细胞膜表面电荷的屏蔽作 用。而c o o k 等鼹i j 认为是由于c a 2 + 结合固定膜上的组分而减少了质膜的流动性l ”1 。 1 4 2 钼、硼对缓解植物高温胁迫的作用 有研究表明，硼对膜的稳定性有直接作用，钼通过参与无机态磷向有机态磷的合成间 接影响膜的稳定性刘鹏等( 2 0 0 0 ) 的研究表明，施硼或施钼都有利于大豆抗膜脂过氧化 胁迫，而且硼和钼二者里现相互促进的作用。 1 4 3 植物生长调节物质对缓解植物高温胁迫的作用 植物生长调节物质既包括现在公认的五大类植物激素和其它已知的及未知的内源生长 物质，也包括一些人工合成的对植物生长发育有显著影响的化合物。一些研究表明，某些 植物生长调节物质与植物高温胁迫之间存在一定的关系i “。 8 a b s s 等观察到高温驯化过程中葡萄叶片中a b a 水平上升，用外源a b a 对葡萄组培细 胞进行2 4 小时处理能显著提高其抗热性【，。a b a 处理能显著增加5 0 ( 2 下玉米苗的存活率， 减少玉米根的电解质外渗率p ”。但a b a 对植物高温胁迫的减缓作用需要适宜的浓度。缪 昱珉等的研究表明，用一定浓度的脯氨酸、6 l - b a 、多效唑( p p 3 3 3 ) 于高温季节黄瓜生长 发育的不同阶段喷施，对黄瓜产量的提高有显著效果p 2 l 。 1 4 4 细胞相溶性物质对缓解植物高温胁迫的作用 现己证明细胞相溶性物质的存在能够在一定的高温胁迫下保护水溶性蛋白质，防止热 变性的发生1 5 3 1 1 ”】【”i 。进一步的研究表明，一些细胞相溶性物质如糖、多元醇等的存在能够 显著提高光系统h 的热稳定性1 5 6 1 ，其原因可能是：细胞相溶性物质通过稳定光系统i i 反应 中心的3 3 k d 外周蛋白对中心复合体的绑缚作用而保护了光系统i i 反应中心的电子传递 ”另有研究表明，一些细胞相溶性物质具有清除羟自由基的能力，如肌醇、山梨酵、甘 露醇和脯氨酸等p ”。 9 第二章不同耐热性菜豆品种高温胁迫下类囊体膜脂成分及饱和度的变化 高温引起膜类脂相变，从而破坏膜的结构进而影响其功能是高温引起膜伤害的机理之 一，而类囊体膜是植物进行光合作用的部位，它较其它生物膜对高温的反应更敏感。本实验 以耐热性不同的菜豆品种为对象研究类囊体膜脂组成和饱和度及其在高温胁迫下的变化， 探求高温逆境下菜豆类囊体膜脂变化的规律，探讨其对高温胁迫的适应机制。 2 1 材料与方法 2 1 1 供试材料与实验设计 选用已被证实的对高温胁迫敏感性不同的四份菜豆品种研究高温逆境下菜豆类囊体膜 脂成分的变化，其中s t r i k e 和8 5 c t 为耐热品种，衄l _ 之4 0 和b b l - 4 7 为热敏感品种。 以上实验材料来源于美国明尼苏达大学。 生长箱模拟高温实验：实验于2 0 0 1 年1 2 月一1 月进行。设常温和高温两种处理。常温 为2 5 ，2 0 ( 日腋) ，高温处理为3 7 7 2 5 ( 日腋) ，日长为1 2 小时。早8 点至晚8 点。光周期 同步。生长箱内温度误差为1 ，光照强度为1 2 s 皿m 2 s - 。选用对高温敏感性差异较大的 两个菜豆品种：b b l _ _ 4 7 和8 5 _ _ ( x 为实验材料，在中国农业大学科学园加温目光温室中 育苗。育苗基质为草炭：蛭石：砂子- - 2 ：2 ：1 ( 体积比) ，掺入适量腐熟鸡粪。将菜豆播于 6 0 c m * 2 5 c m 的塑料筐中，每筐4 0 株，每个品种播两筐，给以正常的水肥管理出苗后， 每筐选生长一致植株保留2 0 株育苗期阃温室平均温度为2 2 。最高温度为3 0 ，最低 温度为1 5 当第一片复叶完全展开时将两个品种分别移入培养箱，进行高温和常温两种 处理处理时间为5 天5 天后两个品种分别取l o 株幼苗的第一片复叶混合，进行脂类的 分析测定。 自然高温处理实验：于2 0 0 1 年8 月1 0 日分别将四份热敏感性不同的菜豆品种直播于 塑料薄膜连栋温室中后部t 温光环境基本一致。每个品种播两畦，每畦2 0 株，给以正常水 肥管理。当第一片复叶成熟时，每个品种选l o 株生长一致、健康的幼苗，采下第一片复叶， 混匀进行叶绿素及脂类的分析测定。叶绿素测定结果为三次重复的平均值。 2 1 2 测试方法 2 1 2 1 总类脂的提取： 注：类囊体膜的提取在4 条件下进行 1 0 2 0 9 菜豆成熟叶片洗净，缓冲液中快速绞碎，8 层纱布过滤 ( 0 3 3 1 4 山梨醇，5 0 出t r i n c i n e - - n a o h ，2 m me d t a - - n 乱，0 1 5 b s a ) 将溶有总脂的氯仿分成两部分。分别用氮气吹干，用于测总脂及各脂中脂肪酸的成分 及含量。 2 1 2 2 类脂的分离：( 附层析示意图) 各脂：硅胶板双向层析法：总脂：硅胶板单相层析法 硅胶板规格：硅胶板g ，2 0 c m * 2 0 c m , 显色剂：0 0 0 2 的2 ，7 - 二氯荧光素( 溶于6 0 丙酮) 第一层展开液：氯仿：甲醇：蒸馏水= 6 5 ：2 5 ：4 ( 体积比) 第二层展开液：氯仿：甲醇：氨水：异丙胺= 6 5 ：3 5 ：5 ：0 5 ( 体积比) 总脂展液：丙酮：正己烷= l ：l 单脂层析总脂层析 单脂层析图中最前端为色素其余依次为：m g d g ( 单半乳糖基甘油二脂) 、d g d g ( 双半 乳糖基甘油二脂) 、p g ( 磷脂酰甘油) 、s q d g ( 异鼠李糖基甘油二脂) 。总脂层析图中最前端 为总脂，下面两项均为色素。 2 1 2 3 类脂的提纯 1 ) 提纯各类脂：层析后将板用冷风吹千，喷显色剂，有脂的地方显出荧光，用铅笔标记， 然后将各个脂刮下。 2 ) 提纯总脂 9 5 硫酸甲醇溶液2 m l氮气，密封，8 5 c 加热i 小时 i 溶液冷却i 正戊烷- 蒸馏水分别i m l 。1 5 m l r 摇匀，离心，3 0 0 0 转，5 分钟 上 上清液吸出氨气畋干密封，2 5 保存待测l 1 2 2 1 2 4 类囊体膜脂脂肪酸组分的测定：气相色谱分析法( h p 6 8 9 0 ) 。分离图谱如下 其中横坐标为汽化时间，纵坐标为峰高，根据汽化时间的不同将各种脂肪酸分离。各 脂肪酸按时间顺序依次为：1 6 ：0 ( 棕榈酸) 、1 6 ：1 ( 3 t ) ( 反式十六碳三烯酸) 、1 8 ：0 ( 硬 脂酸) 、1 8 ：1 ( 油酸) 、1 8 ：2 ( 亚油酸) 、1 8 - 3 ( 亚麻酸) 。其中亚麻酸相对含量最高。2 5 分钟至7 5 分钟之间的峰为色素杂峰。 2 1 2 5 叶绿素的测定：乙醇一丙酮法m 1 2 2 结果分析 2 2 1 培养箱常温及高温胁迫下不同菜豆品种类囊体膜中脂肪酸含量的差异 表l ：高温胁迫对不同菜豆品种类囊体膜中脂肪酸含量的影响 t a b l e lt h ee f f e c to f h i g ht e m p e r a t u r es t r e s so nt h e c o n t e n to f t h y l a k o i dm e m b r a n ef a t t ya c i d so f d i f f e r a n tc o m m o nb e a nc u l t i v a r s b b l - 4 7 2 5 2 0 c 1 o0 01 20 02 89 5 1 2 1 3 7 ，2 5 1 3 0 o m g d g 8 5 c t 2 5 2 0 c1 00 0 3 7 2 5 1 60 0 b b l 4 7 8 5 一c t 2 5 2 0 4 80 0 3 7 2 5 5 10 0 d g d g 2 5 2 0 3 80 0 3 7 ，2 5 4 30 0 2 40 03 69 2 8 3 7 1 40 02 19 5 6 2 4 3 0 0 02 79 2 8 4 6 3 10 0 1 3 9 0 7 7 9 5 50 02 18 7 2 1 0 7 2 60 0 1 6 9 2 0 6 4 4 60 02 08 9 0 8 9 b b l - 4 7 2 5 2 0 c2 7 83 8 91 0 03 00 22 0 2 7 6 7 3 7 2 5 2 7 94 3 8 1 2 71 1 1 81 2 7 8 4 4 p g 8 5 c t 2 5 2 0 2 6 54 1 96 70 01 52 3 4 7 5 1 3 7 2 5 c2 6 84 9 38 20 63 11 2 4 8 4 0 b b l - 4 7 2 5 2 0 2 2 40 01 1 10 02 06 4 5 3 35 3 7 2 5 2 1 30 01 7 70 06 45 4 5 3 9 0 s q d t 3 8 5 c t 2 5 2 0 2 2 10 01 0 00 00 06 7 9 3 2 1 3 7 2 5 2 1 80 0 1 5 60 0 0 9 6 1 0 3 7 6 注：饱和程度( ) = ( 1 6 ：0 + 1 6 ：! ( 3 t 卜1 8 ：0 ) ( 1 6 ：0 + 1 6 ：1 ( 3 t 卜1 8 ：0 + 1 8 ：1 + 1 8 ：2 + 1 8 ：3 ) * 1 0 0 不同种类的植物类囊体膜中类脂及类脂中脂肪酸的组成不同。菜豆类囊体膜脂主要包 括单半乳糖基甘油二脂( 1 i g d g ) 、双半乳糖基甘油二脂( d g d g ) 、磷脂酰甘油( p g ) 和异鼠 李塘基甘油二脂( s q d g ) 。而每种单脂又主要包括棕榈酸( 1 6 ：0 ) 、反式十六碳三烯酸( 1 6 ： i ( 3 t ) ) 硬脂酸、( 1 8 ：o ) 、油酸( 1 8 ：1 ) 、亚油酸( 1 8 ：2 ) 、亚麻酸( 1 8 ：3 ) 这六种脂 肪酸。每种脂肪酸在各甘油脂中的相对含量不同，其中反式十六碳三烯酸( 1 6 ：1 ( 3 t ) ) 是p g 中特有的脂肪酸，在各甘油脂中油酸( 1 8 ：1 ) 的含量都很少。 1 4 两个不同品种的菜豆幼苗在培养箱中高温处理后，类囊体膜中脂肪酸的相对含量发生 了变化( 表1 ) 。 实验结果表明：处理温度对总脂的饱和程度影响比较大，高温胁迫提高了菜豆类囊体 膜中总脂的饱和程度。 在高温胁迫条件下，热敏感菜豆品种b b l 一4 7 的类囊体膜总脂中脂肪酸组成与正常温度 下不同，饱和脂肪酸含量较正常温度下饱和脂肪酸的含量要高，而在总脂中占比例最大的 不饱和脂肪酸亚麻酸( 1 8 ：3 ) 的相对含量却较正常温度下的低，降低了5 ，它的降低伴随着 其它脂肪酸相对含量的升高。 p g 主要存在于类囊体膜上。不仅脂肪酸的饱和程度高。而且它的1 6 ：1 。w 脂肪酸残基 的双键是反式的，熔点较顺式的1 6 ：1 m ，高得多，所以通常将1 6 ：1t m 作为饱和脂肪酸计算。 实验结果中总脂的t 6 ：l ( 3 t ) 在高温胁迫条件下的相对含量要比正常温度下的相对含量高。 总脂是由各类甘油脂组成的，总脂随温度的变化并不能反映出各类甘油脂随温度的变 化情况，所以我们进一步研究了各类甘油脂在高温胁迫下的变化。结果表明：温度处理对 不同甘油脂的影响不同。 ( 1 ) m g d g 中，亚麻酸( 1 8 ：3 ) 的相对含量最高，占9 5 ，高温胁迫后其相对含量降低 了2 3 ，伴随着它的降低是其它各脂肪酸相对含量的升高，这样的变化导致了高温胁迫后 脂肪酸饱和程度提高了1 5 。 ( 2 ) d g d g 中，亚麻酸( 1 8 ：3 ) 的相对含量要比单半乳糖甘油基甘油= 脂( m g d g ) 中 亚麻酸( 1 8 ：3 ) 的相对含量低一些，但也占到了9 0 棕榈酸( 1 6 ：0 ) 和硬脂酸( 1 8 ：0 ) 的 相对含量要比l i g d g 中的高，高温胁迫后。d g d g 中亚麻酸的相对含量降低3 5 ，而其它各 脂肪酸的相对含量均升高，因此，脂肪酸的饱和程度较高温胁迫前提高了2 8 。 1 3 ) p c , 是饱和程度较高的脂。其中的棕榈酸( 1 6 ：0 ) 和反式十六碳三烯酸( 1 6 ：1 。) 的相对含量均很高，二者占到了总量的一半以上。高温胁迫后，p g 中各脂肪酸相对含量的 变化与m g d g 和d g d g 中各脂肪酸相对含量的变化不同。高温胁迫导致了p g 中亚麻酸( 1 8 ：3 ) 相对含量较大幅度的下降，较胁迫前下降了7 5 ，而它的下降伴随着反式十六碳三烯酸 ( 1 6 ：l ( 3 t ) ) 、硬脂酸( 1 8 ：o ) 、亚油酸( 1 8 ：2 ) 这三种脂肪酸相对含量的升高和油酸 ( 1 8 ：1 ) 相对含量的降低，而棕榈酸( 1 6 ：0 ) 的相对含量没有发生变化。整个脂肪酸的饱 和程度也增加了7 7 ( 4 ) s q d g 也是饱和程度较高的脂，饱和脂肪酸占了将近3 4 ，但它在总脂中占的比例 很小，只有4 - 5 。高温胁迫后，它的脂肪酸也发生了变化，表现为：亚麻酸( 1 8 ：3 ) 的相 对含量大幅度下降，较胁迫前下降了1 0 ，而硬脂酸( 1 8 ：0 ) 和亚油酸( 1 8 ：2 ) 相对含 量的上升，棕榈酸( 1 6 ：0 ) 的相对含量稍有下降，但基本保持不变，脂肪酸的饱和程度上 升了5 5 。耐热品种8 5 一c t 类囊体膜中总脂及各甘油脂在高温胁迫前后的变化趋势与热敏 感品种b b l 一4 7 的相同。 两个品种之间类囊体膜脂脂肪酸的变化：在正常温度下，两个品种总脂及各甘油脂中 脂肪酸的相对含量及饱和程度差别不大；高温胁迫后，虽然两个品种脂肪酸的饱和程度均 提高，但品种之间差别不大。高温胁迫后两个品种脂肪酸饱和程度差别不大的可能原因是 高温胁迫时间不够长因为在逆境条件下，脂类的变化过程是脂类分解合成的过程，所需 时间相对较长，在较短的胁迫时间内。耐热品种8 5 - c t 在脂肪酸水平上对高温胁迫的适应 性可能没有充分发挥出来。 2 2 2 自然高温条件下不同耐热性菜豆品种叶绿素含量的差异 + 最高温+ 最低温 j - - l ，一r 、- 一 、一 、- 一 一一一一一一一f 一一l 、一 图1 实验期间温室温度 f i g 1t h et e m p e r a t u r ei ng r e e n h o u s ed u r i n ge x p e r i m e n t 于2 0 0 0 年8 月1 0 日将四个不同耐热性菜豆品种播于中国农业大学科学园塑料薄膜连 栋温室。实验期间采用温度自动记录仪对温室温度进行监测记录( 见图1 ) 。在菜豆第一片 复叶生长这段时间里，每天最高气温不低于3 5 ( 2 ，最低温度不低于1 5 c 。平均每天3 5 c 以上高温为4 8 个小时。 1 6 蚯锻粥贩议臻 毯赠 ；o叫。竹on o【o _ 【 量嗍 n n 卜n o n 。吣n 。寸n n n 叶绿素测定结果见图2 结果表明：西个耐热品种8 5 - c t 和s t r i k e 中c h l a 、c h l b 、 c h l a + c h l b 的含量均高于两个不抗热品种b b l - 2 4 0 和b b l - 4 7 中相应成分的含量。其中抗 热品种8 5 c t 中叶绿素含量最高，热敏感品种b b l - 4 7 中叶绿素含量最低。8 5 一c t 中c h l a 、 c h l b 、c h l a + c h l b 含量分别为：2 2 8 、0 9 3 、3 5 2 m g g f w ，较b b l - 4 7 中相应成分的含量分 别高出0 5 3 、0 2 3 、0 8 3m g g f w 。 g