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76猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2015年32卷第10期 猪场兽医 VETERINARY 我国集约化猪场新发猪丁型冠状病毒病 的诊断 贺东生, 陈小芬, 王 飞, 苏丹萍, 陈瑞爱, 尤刘阳 (华南农业大学兽医学院, 广东 广州 510642) 猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) ,是 一种新发现的冠状病毒,它主要感染整段小肠,尤其是空肠 和回肠,引起严重的肠炎并伴有小猪的腹泻和呕吐 1。2009 2010 年 PDCoV 在中国香港首次报道该病毒 2-3。2014 年初, 在美国首次报道猪群该病的流行,此后至少有 19 个州有该新 型冠状病毒的报道。在美国,猪丁型冠状病毒感染与猪流行 性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)的临床发病情况 比较相似,但是发病症状相对较轻。新型猪肠道冠状病毒病 可引起乳猪腹泻和呕吐,发病率和死亡率高达 50% 100%, 生长猪和成年猪感染后死亡率低。现将本次病例报告如下。 1 材料与方法 1.1 病料 来自华南某集约化猪场(2 000 头基础母猪)3 7 日龄 的乳猪 5 头,全场乳猪发生严重腹泻,传播迅速,发病率 90%、死淘率 90% 以上。采集发病猪的小肠,按 1 5 研磨 制备成病料,-80 冻存待检。 1.2 主要试剂 RNA 抽提试剂盒购于上海百赛生物科技有限公司,反 转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTP、18T 载体克隆试剂盒、 DL2000 DNA Marker、胶回收试剂盒、DH5 感受态细胞 等购自 TAKARA 公司。 1.3 引物设计与合成 本实验室根据 GenBank 所发布的序列号,选择 N 基因, 运用 Primer Premier5.0 分别针对 PDCoV、PEDV、TGEV、 和 RTV(猪轮状病毒)设计 4 对引物,由睿博兴科生物技术 有限公司合成,预计扩增的特异性基因片段大小为 482 bp、 450 bp、810 bp 和 620 bp。 1.4 总 RNA 的提取 病料经离心取上清液,按照 ANYGEN 核酸提取试剂盒 说明书提取病毒总 RNA,然后用物 RNA 酶的水溶解,放 摘 要: 猪丁型冠状病毒 (PDCoV) 是一种国外新发现的猪腹泻病原, 我国广泛存在猪流行性腹泻, 但至今未见 猪丁型冠状病毒感染的正式报道。 2015 年 7 月, 在存栏 2 000 头基础母猪的华南某集约化猪场 5 至 15日龄乳 猪发生传播迅速的严重腹泻, 发病率90%、 死淘率90%以上。 经实验室PCR诊断为猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 、 猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 和轮状病毒 (RV) 检测均为阴性。 用特异性的 PDCoV N 基因引物经 RT-PCR 扩增显 示为强阳性。 在此基础上, 对扩增产物进行了基因测序和遗传变异分析, 显示该毒株在 PDCoV 新的遗传分支上, 与其他 PDCoV 有显著区别。 本研究首次报道我国出现了猪丁型冠状病毒病的新病例,毒株命名为PDCoV Ch-A。 关键词: 猪; 丁型冠状病毒; 诊断; N 基因 在 -80保存。 1.5 RT-PCR 的检测 反转录体系 : ddH2O 4 L,下游引物 R 1L,RNA 1L,70 水浴 10 min 冰浴 2 min ; 5MLV buffer 2L, ddH2O 1L,dNTPs 0.5L,RNA 酶 抑 制 剂 0.25L, MLV 反转录酶 0.25L,42 水浴 1 h,72 水浴 15 min 冰浴至冷却。 PCR 体 系 : ddH2O 32.5L,10MLV buffer 5L, dNTPs 4L,F 2L,R2L, cDNA 4L,rTaq 0.5L。 反应条件为 94 5 min,94 30 s,52 30 s,72 30 s,30Cycles ,72 7 min,PCR 反应产物于 1.0% 琼脂 糖凝胶电泳。 1.6 克隆 将阳性 PCR 产物经纯化回收后与 PMD-18T 载体连接, 转化到大肠杆菌 DH5 感受态细胞中,培养后挑单个菌落进 行 PCR 鉴定,鉴定成功的重组质粒送往睿博兴科生物技术有 限公司进行测序。 1.7 序列分析 将 RT-PCR 扩 增 获 得 的 N 基 因 进 行克隆、测序,利用 MEGA6 软件处理,与 GenBank 上已公布的 PDCoV 毒株的 N 基因 序列(表 1)进行同源 性比对分析,并绘制 系统进化树。 2 结果与分析 2.1 病猪症状和病变 该 集 约 化 猪 场 5 表 1 PDCoV 参考毒株 N 基因序列信息 序号毒株名称时间来源 1CHJXNI2-20152015中国 2CH-Sichuan-S27-20122012中国 3HKU15-1552010中国 4HKU15-442009中国 5KNU14-042014韩国 6USA-Illinois121-20142014美国 7USA-Illinois133-20142014美国 8USA-Illinois134-20142014美国 9USA-Illinois136-20142014美国 10USA-Ohio137-20142014美国 11IN2847-20142014美国 12OH1987-20142014美国 138734-USA-IA-20142014美国 772015年32卷第10期 SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科学 主题策划 FEA T URE 猪场兽医 VETERINARY 天 康 天 蓝 净 专 防 蓝 耳 病 至 15 日龄乳猪发生传播迅速的严重腹泻,迅脱水死亡,死淘 率高达90%以上。 症状见剖检病变见图1和图2。 主要在小肠, 肠管明显扩张 , 内充满黄色液体 , 肠壁变薄、松弛、小肠黏 膜充血 , 肠系膜呈索状充血。 2.2 4 种病毒 N 基因扩增 应用 RT-PCR 方法对样品进行了 PEDV/TGEV/RV/ PDCoV 检测,结果显示 PEDV/TGEV/RTV 未能扩增出目 的条带,而 PDCoV 扩增出与预期大小一致片段,约 482 bp, 电泳图见图 3。检测结果显示该病料 PEDV/TGEV/RTV 为 阴性, PDCoV为强阳性, 说明该猪场可能存在PDCoV的感染。 2.3 PDCoV N 基因序列分析 由测序结果可知,Ch-A 测序的 N 基因中间存在一个 核苷酸的缺失、几个突变。 运 用 DNAstard 软 件 将 测 序 正 确 PDCoV N 基 因 序 列 与 GenBank 上已发表的国内外 毒株 N 基因参考序列进行同 源性比对分析,结果显示获 得 PDCoV 毒株 N 基因之间的 核苷酸序列同源性为 98.3% 到 100%,氨基酸序列同源性为 95.0% 到 100% ; 其中 TX 与中国已公布毒株相比核苷酸同源 性为 98.3% 到 99.0%,氨基酸同源性为 95.0% 到 96.9%,显 示与中国香港毒株 HKU15-155 同源性最低 ; 与韩国和美国 毒株相比核苷酸同源性为 98.8% 99.0%,氨基酸同源性为 96.2% 到 96.9%(结果见图 4、图 5) 。 2.4 PDCoV N 基因遗传进化分析 运用 MEGA 6.06 软件绘制 N 基因系统进化树,结果表 明我国新出现的猪丁型冠状病毒(Ch-A)与国内外报道的 猪丁型冠状病毒亲缘关系较远,它单独在一个新的分支上。 说明这是在我国新发现的一个新毒株(结果见图 6) 。 3 讨论 自 2013 年至今, 新出现的 PEDV 和 PDCoV 已遍布美国, 造成大量猪死亡。目前国际上正在形成该病毒相关研究热点, 也发表了少量的报告。但国内至今未见该病毒为主因在猪场 暴发和流行的报道。 我们首次报道了国内集约化猪场暴发猪丁型冠状病毒病。 通过设计 4 对冠状病毒引物,在检测 PEDV、TGEV 和 RTV 为阴性后,进一步设计引物扩增 PDCoV,显示为强阳性。对 PDCoV HN 株的 N 基因进行测序,并与国内外已公布的序 列进行系统进化树分析,结果显示: 该 PDCoV 毒株(Ch-A) 与 GenBank 上公布的美国株及中国株不在一个分支上,是新 发现的一株新型冠状病毒病。该分支的毒株是否与本次发病 的高致病力有关值得深入研究。仍然未知该病毒是怎么传入 我国及其在我国各地的感染情况。 老病未消除、新病涌现,需高度重视和立即加强研究对 猪丁型冠状病毒的监测和系统性研究,降低给养猪业带来的 损失和威胁。 参考文献 1 Opriessnig T.Re-emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the global pig populationJ. The Veterinary Journal, 2015.204(2):131. 2 Lee S,Lee C.Functional characterization and proteomic analysis of the nucleocapsid protein of porcine deltacoronavirusJ. Virus Research, 2015.208:136-145. 3 Wang L,Byrum B,Zhang Y.Detection and Genetic Characterization of Deltacoronavirus in Pigs,Ohio,USA, 2014J. Emerging Infectious Diseases, 2

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