教学目的掌握微生物.doc

第一章 绪论教学目的：掌握微生物、微生物学的概念，微生物的共同特性，以及微生物发展的历程和各阶段有突出贡献的科学家，了解下微生物学的总体概况和微生物学发展的将来。重点和难点： 重点掌握几个基本概念，发展的各个阶段以及有突出贡献的科学家，微生物的共同特性。一、 什么是微生物？有何特点？包括哪些类群？1、 什么是微生物： 一切肉眼看不到或看不清的微小生物都称为微生物。指所有形态微小，构造简单的单细胞、多细胞，甚至是没有细胞结构的低等生物的总称。2、主要特点： 小（个体小）um(光镜下可以看到) nm（电镜下可以看到） 简（构造简单） 低（进化地位低）原核类、真核类、非细胞类 3、主要类群：原核类的细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体和蓝细菌（过去称蓝藻或蓝绿藻）；真核类的真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类；属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等。二、 什么是微生物学（1） 什么是微生物学：生物学的分枝科学，是研究微生物的形态、生理、生态分布、遗传变异及其与生物界、非生物界的相互关系与人类生产和生活利害关系等方面的科学。三、 微生物学的发展史： （一） 形态学发展阶段： 代表人物虎克（Anthony vanleeuwenhoek.1632-1723）。主要贡献：利用显微镜直接观察到了细菌一生制造了419台显微镜或放大镜（50-266倍）发表论文400多篇。（二）、生理学发展阶段： 从1861年至1897年，这一时期主要特点为：建立了一系列研究微生物所必须的方法和技术形成了寻找病原微生物的黄金时代微生物学以独立的学科形式开始形成。代表人物及其主要贡献：1、法国人路易巴斯德：微生物学的奠基人。主要论点：认为只有活的微生物才是传染病、发酵和腐败的真正原因，否定了“自生说” ，即生命只能来自生命的胚种说。其著名的实验是曲颈瓶实验，即将有机营养液放入曲颈瓶中灭菌放置不坏，打破瓶口，则变坏；建立了巴氏消毒法（6065度）；为免疫学作出了重要贡献，首次制成狂犬疫苗。2、科赫：诺贝尔将获得者建立了一系列研究微生物的方法，尤其在分离微生物纯种方面，鞭毛等一系列染色方法、显微摄影等方面利用平板分离到多种传染病的病原菌如：炭疽杆菌、结核杆菌、霍乱弧菌等1884年提出科赫法则：病原微生物存在于患病个体中，不存在于健康个体中。继二人之后，出现了一系列的微生物学的分支科学，如细菌学、消毒外科、免疫学、土壤微生物学、病毒学等。使微生物学作为一门独立的学科出现。中国科学家: 汤飞凡 沙眼衣原体的发现科学家的精神与SARS带给我们的思考. 四、 微生物的共同特点： 由于微生物个体小，构造简单，因而具有以下五个方面的共性：（一） 体积小，面积大：（二） 吸收多、转化快：（三） 生长旺、繁殖快 四） 适应性强，易变异 （五）分布广，种类多： 第二章 原核微生物教学目的：通过本章的学习，使学生掌握原核微生物细菌、放线菌的形态结构及菌落特征，革兰氏染色的重要意义。了解其它原核微生物蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体等的基本特性。重点和难点：重点是细菌和放线菌的形态、结构及其菌落特征。难点是细菌细胞壁的结构特征以及与革兰氏染色的关系。第一节 细菌一、 细菌细胞的形态构造及功能：先介绍一下如何看到微生物（一） 形态及染色情况：1、如何观察单个的细菌（染色情况）：因细菌个体小，细胞透明，因而不宜观察，染色后易观察。染色的方法很多，如：细菌的单染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、荚膜染色法等，其中最重要的是G染色。G染色有十分重要的意义，通过这一染色，几乎可以把所有细菌分成G+和G-两大类。因此它是分类、鉴定菌种时一个重要指标。且能提供不少其它生物学信息。通过各种染色手段和直接观察，可见到微生物的形态有以下几种：2、形态：形态简单，基本上只有三种类型，即：球状、杆状和螺旋状；（1） 球菌：根据其分裂方向可分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌和葡萄球菌。（2） 杆菌：可分为：单杆菌、双杆菌、链杆菌（3） 螺旋菌：根据弯曲程度分为：弧菌（2-6个弯）、螺菌（6个以上弯） 在自然界中，杆菌最为常见。此外，近年来还陆续发现其它形态的细菌。如：柄杆菌（形状不规则，有柄、菌丝和附器等）、球衣菌（能形成衣鞘）等（沈萍P29）。大小：一般以um计。如Ecoli为2um0.5um，1500个头尾相连才3mm，120个肩并肩象头发丝大小。细菌的形态受环境条件的影响，如培养时间、温度、培养基的组成与浓度等均能引起细菌形态的改变。（二） 细菌细胞的构造： 1、一般构造：（1） 细胞壁：功能：固定细胞外形；协助鞭毛运动；保护细胞免受损伤；是正常细胞的必需成分；阻碍有害物质进入细胞（大于800的抗生素）；与细菌的抗原性致病性和对噬菌体的敏感性有关构造：A、 G+细菌肽聚糖的结构：（以金黄色葡萄球菌为例）其厚度约20-80nm，由40层左右网状分子组成，肽聚糖分子由大量小分子单体构成，每一个肽聚糖单体含三个组成部分：双糖单位：即由一个N-乙酰葡萄胺与一个N-乙酰胞壁酸分子通过B-1，4糖苷键连接。短肽“尾”：即由4个氨基酸按L型与D型交替的方式连接而成。肽“桥”：在金黄色葡萄球菌中，这一肽桥的氨基端与前一肽聚糖单体“尾中”的第四个氨基酸D-丙氨酸的羧基相连接，而它的羧基端又与后一肽聚糖单体肽“尾”中的第三个氨基酸碱性L-赖氨酸相连，从而使两个单体肽聚糖单体交联起来。B、G细菌细胞壁的肽聚糖结构：（以Ecoli为例）其肽聚糖含量占10%以下，一般由1-2层网状分子构成，其单体与G+的基本相同，肽尾的第三个氨基酸为内消旋二氨基庚二酸（M-DAP）没有特殊的肽桥，其前后两个单体的联系仅由甲肽尾的第4个氨基酸-D-丙氨酸的羧基与乙肽尾的第三个氨基酸-M-DAP（二氨基庚二酸）的氨基相连 G细胞壁，由于肽聚糖含量小，网孔大，又由于被乙醇脱水（脂）后，网孔进一步增大，所以在脱色时，结晶紫和碘的复合物被有机溶剂所提取，故只能显示后来的沙黄番红的颜色，而G+恰相反。（2） 细胞膜与间体： 位于细胞壁内，电镜下观察呈现液态镶嵌模型结构。细胞膜的功能： 控制细胞内外物质运送、交换 维持细胞内正常渗透压 合成细胞壁组分的场所和合成荚膜 进行氧化磷酸化或光合磷酸化的产能基地 鞭毛的着生点和为其提供能量。细胞质：细胞膜以内除核质体外的一切透明、胶状、颗粒状物质总称细胞质。其主要成分为：核糖体、，贮藏物、各种酶、中间代谢物、无机盐、质粒、少数细菌细胞还有伴孢晶体和气泡等。2、 细菌细胞的特殊结构： 不是所有细菌都有的，主要包括糖被、鞭毛、菌毛和芽孢。（1）糖被：是某些细菌细胞壁外附着的一层厚度不定的胶状物质。根据厚度不同可分成：微荚膜、荚膜、粘液层。主要成分：多糖、多肽、蛋白质。作用：保护细菌免受干旱损伤，对致病菌来说可保护他们免受宿主白细胞的吞噬。贮存养料，以备营养缺乏时用。堆积某些代谢废物。通过荚膜使菌体附着在物体表面。细菌间的信息识别作用。与生产关系：可产生很多工业产品，利用肠膜明串珠菌荚膜提取聚葡萄糖制备代血浆或葡萄糖凝胶试剂。用甘蓝黑腐病黄单孢菌的荚膜生产黄原胶，可用于石油开采中钻井液添加剂，也可用于印刷、食品等。有些还可于污水处理。破坏作用：有些细胞的荚膜能使糖液、酒、奶、面包等食品发粘变质；增加某些致病菌的致病力等。（2） 鞭毛和菌毛： 鞭毛：某些细菌体表着生的丝状、波状附属物，一般有1-数十根证明鞭毛存在的方法：A、电子显微镜直接观察B、光镜下染色观察C、悬滴片（水浸片）观察其运动D、半固体培养基中穿刺接种，看其周围是否混浊E、菌落边缘不整齐，大而薄，不规则等。鞭毛的着生方式：一端单生、一端丛生、两端单生、两端丛生、周生鞭毛 在各类细菌中，弧菌、螺菌和假单孢菌普遍都长鞭毛，杆菌中，有的长，有的不长；球菌中只有个别属长。 鞭毛是细菌的运动器官，且运动速度很高，20-80um/S。也是菌种分类鉴定中的重要指标。 菌毛：（纤毛、伞毛、绒毛、须毛）是长在细菌体表的一种纤细（直径7-9nm）、中空（直径2-2.5nm）短直、数量较多（250-300）的蛋白质附属物，一般多见于G-中，功能是使细菌较牢固地粘连在物体（呼吸道、消化道、泌尿生殖道粘膜）上。大部分为致病菌。性菌毛：是一种特殊的菌毛，比菌毛稍长，每个细胞有1-4根；其功能是在不同性别的菌株间传递DNA片段；多存于G-中。芽孢：某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体，称为-特性：具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。 肉毒梭菌100。C水中，存活5-9.5小时。121。C，存活10min。 芽孢抗紫外线的能力，比其营养细胞强1-数十倍，芽孢的休眠能力是十分惊人的，在休眠时不能检出任何代谢能力，因此又称“隐生态”。芽孢在普通状态下可保存几年到几十年，德国的几个植物标本上曾分离到200-300年的枯草芽孢杆菌的芽孢。 有些湖底沉积土中的芽孢杆菌经500-1000年仍有活力，甚至有存活2000年的记载。 能产生芽孢的细菌种类并不多，主要是G+杆菌，即芽孢杆菌科的两个属（好氧性的芽孢杆菌属和厌氧性的梭菌属）芽孢的构造： 芽孢之所以耐高温，是因为其含有耐热的吡啶-2，6-二羧酸（DPA）芽孢的形成过程：芽孢的萌发：由休眠状态的芽孢变成营养状态的细菌的过程，称为-过程：活化-出芽-生长活化的方法：短期加热、低PH环境、还原剂处理。活化后要立即接种到合适的培养基中去，否则将恢复到休眠状态。研究芽孢的意义：在鉴定菌种时用芽孢的存在有利于菌种的筛选和保藏可代表灭菌的程度。伴孢晶体：少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双椎形的碱性蛋白质晶体（ 内毒素） 它由18种氨基酸组成，对200多种磷翅目昆虫有毒害作用，因而可制成细菌杀虫剂。（苏云金芽孢杆菌）微生物个体微小，单个微生物只能借助显微镜，其结构甚至要借助电子显微镜才能看到，那么其群体形态又是怎样的呢？二、 细菌群体（菌落）的形态：菌落：是由单个细菌细胞经生长繁殖而成的肉眼可见的子细胞群体。菌苔：多个菌落融合到一起形成- 菌落的形成有种的稳定性和专一性，因此可用于微生物的分离、纯化、鉴定、计数、选种和育种工作中。菌落在固体培养基上形态的描述：大小、形状、隆起度、边缘、表面状态（光滑、皱褶等）、表面光泽、表面质地（油脂状、湿润）、颜色及透明度。液体培养基中的状态：有无混浊、颜色改变否、沉淀否、有无气泡、菌环等。第三章 真核微生物教学目的和要求：通过本章的学习使学生掌握什么是真核微生物，以及酵母、菌的细胞形态、结构，繁殖方式等。重点和难点：重点是酵母菌、霉菌的细胞形态、结构、繁殖方式、菌落特征。难点是如何区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落。第一节 酵母菌酵母菌是一个俗称，并不是一个分类学上的名词，一般具有以下特点：个体一般以单细胞形式存在多为出芽繁殖，也有裂殖的能发酵糖产能细胞壁含甘露聚糖喜欢在含糖量较高、酸度较大的水生环境中生长。分布：广，主要生长在偏酸含糖环境中，如水果、蔬菜表面，以及果园土壤中和炼油厂附近（分解烃类的）与人类关系：极其密切。千百年来酵母菌及其发酵产品大大改善和丰富了人类生活。如酒类饮料、面包制作，甘油发酵；石油及油品的脱蜡，饲料用、药用及食用单细胞蛋白质等；以及在核酸等的提取中都有用。但也有少数会引起疾病，一般属条件致病，如：鹅口疮、阴道炎、轻度肺炎等。一、 细胞形态及结构：大小：2.510um4.5-21um，比细菌粗10倍。形态：球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状，细胞分裂旺盛，而未断开，形成从而假菌丝。菌落：形态与细菌相似，但比细菌大而厚。多数不透明，表面光滑，湿润，多数呈乳白色。二、 酵母菌的繁殖方式及生活史： 酵母菌的繁殖方式及生活史有多种类型，是鉴定的一个重要指标。（一） 无性繁殖：芽殖、裂殖、产生无性孢子1、芽殖：是无性繁殖的主要方式。是在成熟的酵母细胞表面向外突出形成一个小芽，叫芽体，然后部分核物质和细胞质进入芽体内（一套完整的细胞结构），当芽体长大到一定程度时，从母细胞脱离，成为一个新个体。2、 裂殖：少数酵母菌种类象细菌一样，以细胞分裂方式繁殖，裂殖。即核分裂，继而质分裂，最后形成两个子细胞。3、 无性孢子：少数种类可以此方式繁殖。如掷孢酵母属产生掷孢子，地霉属产生节孢子；白假丝酵母产生厚垣孢子。（二） 有性繁殖：以产生子囊孢子的形式繁殖 邻近的两个性别不同的细胞各自向对方伸出一根管状的原生质突起，相互接触，局部融合并形成一个通道，再质配，核配、减数分裂，最后形成4个或8个子核，每个子核与其相近的原生质一起，在其表面形成一层孢子壁，就是一个子囊孢子，原来的母细胞壁形成子囊。（三） 生活史： 指上代个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部历程，称为该种生物的生活史。酵母菌的生活史可分为三种类型：1、营养体即可以单倍体，也可以二倍体形式存在：如啤酒酵母，其主要特点是： 营养体一般以出芽繁殖营养体可以单倍体又可以二倍体形式存在特定条件下才可进行有性生殖。过程：子囊孢子在合适的条件下产生单倍体营养细胞单倍体细胞不断出芽繁殖两性别不同的单倍体细胞接合形成二倍体二倍体不断出芽繁殖在特定条件下（mcclary培养基或胡萝葡萄块、kleyn培养基上）二倍体转变成子囊，细胞核进行减分，并形成四个子囊孢子子囊经自然或人工破壁释放出单倍体孢子。 2、 营养体只以单倍体形式存在：如：schizosaccharomyces octosporus（裂殖酵母），特点：以无性的裂殖方式进行繁殖二倍体不能独立生活，此阶段很短。特点：单倍体细胞借裂殖进行无性繁殖两个营养细胞接触形成接合管，并质配、核配二倍体核分裂3次，第一次为减数分裂形成8个单倍体子囊孢子子囊破裂，释放孢子。 3、营养体只能以二倍体形式存在：如路德类酵母特点：营养体为二倍体，且不断进行芽殖单倍体的子囊孢子在子囊内发生接合单倍体阶段反以子囊形式存在，不能独立生活。过程：单倍体子囊孢子在孢子囊内接合，并发生质配、核配接合后的二倍体细胞萌发，穿破子囊壁二倍体的营养细胞独立生活，出芽繁殖二倍体细胞内的核发生减数分裂，营养细胞形成子囊，含4个单倍体子囊孢子。第二节 丝状真菌-霉菌 霉菌是一种俗称，意思是“发霉的真菌”，通常是指那些菌丝体发达而不产生大型子实体的真菌。分布：地球上几乎到处有真菌的踪迹，它在物质循环中扮演着很重要的角色，如大量纤维素、半纤维素、动、植物残体的分解。霉菌起很大作用。与人类的关系：对工农业的生产、医疗实践、环保等方面有重要的作用：工业上：可用来生产柠檬酸、葡萄糖酸；淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶；药物：青霉素、头孢、维生素；植物激素（赤霉素）；污水处理；酿造食品：酱油干酪等；纺织品、皮革、纸张、照相胶片等方面植物病害：植物病害（马铃薯晚疫、麦锈病、稻瘟病）动物病害：皮肤癣（脚气、秃疮等）一、 菌的形态结构： 霉菌的菌丝有两种类型：（1） 无隔膜菌丝：即菌丝中无隔膜，整个菌丝为一个长管状单细胞，内含多个细胞核，其生长只表现为核分裂，细胞质增加，菌丝伸长和分枝。（2） 有隔膜菌丝：菌丝有多个细胞成串存在，每个细胞内有一个或多个细胞核，隔膜上有小孔，细胞核、细胞质可以自由流通。补P1-29霉菌的菌丝有一定的分化，在固体培养基上，部分形成营养菌丝（基内菌丝），另一部分伸入空气中，形成气生菌丝。一部分气生菌丝发育到一定阶段，分化成繁殖菌丝。 （4）菌落特征：由于霉菌细胞呈丝状，故其菌落形态较大，质地比放线菌要疏松，外观干燥不透明，呈蛛网状，绒毛状或棉絮状；菌落与培养基连接紧密，不易挑取；菌落正反面颜色经常不一致。二、 霉菌的繁殖方式： 方式多样，除割取片段菌丝即可长成菌丝体外，还可产生无性和有性的孢子进行繁殖。（一） 无性繁殖：是主要繁殖方式无隔菌丝一般形成孢囊孢子；有隔菌丝产生分生孢子。1、孢囊孢子：生在孢子囊内的孢子称为-，是一种内生孢子。菌丝发育到一定阶段，顶端膨大，在下方生出横隔与菌丝分开，即形成孢子囊；孢子囊逐渐长大，囊中形成许多小核，每个核以原生质包裹并形成孢子壁，即成孢囊孢子,原来的细胞壁成为孢囊孢子。带有孢子囊的梗叫孢子囊梗，其伸入孢子囊中的部分叫囊轴；囊破裂后孢子散发出来，发育成新个体。2、 分生孢子： 是生于细胞外的孢子，故又称为外生孢子，分生孢子由菌丝顶端或分生孢子梗出芽或缢缩而成。3、 节孢子：又称粉孢子或裂生孢子。当菌丝生长到一定阶段，菌丝上出现许多横隔，然后从横隔处断裂，产生许多短柱状、筒状或两端钝圆形的节孢子。4、 厚垣孢子：（厚壁孢子） 它是由菌丝中间（少数在顶端）的个别细胞膨大原生质浓缩和细胞壁变厚而形成的休眠孢子。一般呈圆形、纺錘形或长方形。是度过不良环境的一种方式。 （二）、有性繁殖：是经过两性细胞（或菌丝）的结合而形成的一般要经过质配、核配和减数分裂三个阶段。在霉菌中有性繁殖不普遍，仅在特定条件下存在，而且一般培养基上不常出现。常见的形式有卵孢子、接合孢子、子囊孢子。1、 卵孢子：是由两个大小不同的配子结合和发育而成的小的称精子器，。2、接合孢子：是由菌丝生出的形态相同或略有不同的配子囊接合而成的。3、 子囊孢子：同一菌丝或相临的两菌丝上的两个大小不同的性细胞相互接触并缠绕，经受精作用形成分枝的菌丝，称造囊丝，造囊丝经减数分裂产生子囊，每个子囊产生2-8个子囊孢子，在子囊孢子发育过程中，原来的精子囊和藏卵器下面的细胞生出许多菌丝，有规律地将产囊丝包围形成子囊果。子囊果有三种形式：闭囊壳、子囊壳、子囊盘。 第四章 微生物的营养教学目的和要求：通过本章的学习使学生掌握微生物生长繁殖所需的六种营养要素，微生物的营养类型，培养基配制的原则和方法以及培养基的分类方法。重点和难点：重点是微生物生长繁殖所需的六种营养要素及其在微生物生命活动中的重要作用；培养基的配制方法、分类和用途。第一节 生物的营养物质种类繁多，自然界中也有成千上万种物质可被不同微生物利用。根据营养物质的性质和作用可分为：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。一、 碳源： 凡能提供微生物营养所需的碳元素的营养源称为碳源。碳元素是构成机体中有机物分子的骨架。约占细胞干重的50%，同时碳元素也是大多数微生物的能源。微生物能够利用的碳源极其广泛，从无机碳源（CO2或碳酸盐）到复杂的有机碳源都能被微生物利用。 有些微生物能利用几十种，（纤维素分解菌）故可用于菌种鉴定。 微生物利用碳源谱虽然广泛，但对异养微生物来说，最适碳源为“C、H、O”型，其中糖类是最广泛的，其次是醇类、有机酸类和脂类。在糖类中音糖 胜于双糖，已糖胜于戊糖，葡萄糖胜于甘露糖、半乳糖；多糖中，淀粉明显地优于纤维素，几丁质等纯多糖。二、氮源：凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源称-。自然界中能被微生物利用的N源是十分广泛的。从分子态N到有机态N，N元素主要是作为构成微生物细胞物质、或代谢产物。能利用无机N的微生物种类较多，尤其是铵盐，几乎所有微生物都可利用；多数微生物也可利用有机N。（蛋白质、核酸、尿素氨基酸）在实验室和生产实践中常用的有机氮化合物有：牛肉膏、蛋白胨、尿素、酵母膏、玉米浆、饼粘等）三、能源：是指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。由于各种异养微生物的能源就是其C源，因此微生物的能源谱就显得简单多了。化能自养微生物的能源常是一些还原态无机物，如NH+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2-等，微生物可利用其在化学反应中释放的化学能作为能源。四、生长因子：是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。它的需要量一般很少。广泛的生长因子除维生素外，还有碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4C6的分枝或直链脂肪酸等；狭义的生长因子是指维生素。生长因子虽是一种重要的营养要素，但并非任何一种微生物都必须从外界吸收。根据微生物对生长因子的供需程度可分类如下：（1） 生长因子自养型微生物：多数真菌、放线菌和细菌不需要外界提供。（2） 生长因子异养型微生物：需要外界添加生长因子。（3） 生长因子过量合成微生物：微生物在代谢中会分泌出大量的维生素等生长因子，因此可用于生产维生素，如：阿舒假囊酵母，可用来生产维生素B2。在配制培养基时，如果配制天然培养基，可加入富含生长因子的原料（酵母膏、玉米浆、肝浸汁、 芽汁、或其它新鲜的动植物组织液。如果配制的是组合培养基，则可加入维生素溶液。五、无机盐： 无机盐主要为微生物提供除碳源、N源以外的各种重要元素，是必需和不可缺少的。根据微生物对化学元素需要量的大小，又可分为大量元素（生长所需浓度在10-3-10-4M）和微量元素（10-6-10-8M）大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co等无机盐的作用非常重要：P105 在配制细菌培养基时，对于大量元素来说，可以加入有关化学试剂，其中首先K2HPO4及MgSO4，因为它们可提供四种需要量最大的元素，对于少量元素，一般可在化学试剂、天然水、玻璃器皿或是其他天然成分中都可得到，故在配制培养基时不用单独加入。但在研究营养代谢时，因需要精细，要根据需要加入。六、水： 除少数微生物如兰细菌能利用水中的H作为还原CO2时的还原剂外，其它微生物都不能利用水作为营养物质，但由于水在微生物的生命活动过程包括营养过程中的重要性，它仍应属于营养要素之一。水是生命的基础物质之一，它不仅是微生物细胞的组成成分；是最好的溶剂和在细胞中进行各种生化反应的良好介质；水还可以维持细胞的膨压；维持生物大分子的稳定。第二节 微生物的营养类型 关于微生物的营养类型，由于学者们认识的角度不同，因而分类方法十分繁杂，我们就不一一介绍了，在这里我们根据微生物需要的碳源和能源这两大要素进行分类，可分为：光能无机营养型、光能有机营养型、化能无机营养型和化能有机营养型。一、 光能无机营养型： 这类微生物具有光合色素（叶绿素和细菌叶绿素）通过光合磷酸化产生ATP。此外还以还原性无机物作为供氢体，还原CO2而合成细胞物质。如兰细菌、绿硫细菌等。二、光能有机营养型：（化能异养型）这一类微生物具有光合色素，能利用光能，以有机化合物作为碳源和供氢体。如红螺菌，能利用有机酸、醇等有机物。三、化能无机营养型：（化能自养型）这一类微生物能利用无机化合物氧化时释放的能量作能源，利用CO2或碳酸盐作为碳源合成细胞物质，如氧化亚铁硫杆菌，通过氧化硫代硫酸盐及含铁硫化物得到能量（即将Fe2+-Fe3+），这种细菌常在含铁量高的酸性水中存在。四、化能有机营养型：（化能异养型）这类微生物以有机化合物作碳源，利用有机化合物氧化过程中的氧化磷酸化产生ATP为能源而生长。在许多情况下，同一物质即是碳源又是能源。N源可以是有机N化合物，也可以是无机N，大部分生物都属于这种类型。化能异养微生物又可根据它们获得养料的方式而分为腐生和寄生两大类。腐生菌以无生命的有机物作营养，寄生菌则只能从活体中吸取营养物质，寄生和腐生之间又存在中间类型，称兼性寄生或兼性腐生。第三节 微生物对营养物质的吸收方式 微生物在吸收营养物质的时候，细胞壁不起什么作用，它仅能阻止分子量过大（7600D）的物质，而营养物质的吸收过程中，细胞膜起很大作用。一般认为细胞膜以4种方式控制物质的运输。即：单纯扩散、促进扩散、主动运输和基团移位。一、 单纯扩散：（Simple Diffusion） 又称被动扩散，是一个物理扩散过程。被运送的物质靠细胞内外的浓度梯度为动力，溶质分子从浓度高的区域向浓度低的区域扩散，直到深度平衡这个过程不需要消耗能量，运送的物质是气体、水及某些脂溶性物质。二、促进扩散：（Facilitated Diffusion）促进扩散与单纯扩散一样，也是以物质的浓度梯度为动力，不需要代谢能量。不同之处是促进扩散有膜载体（通透酶）参加，膜载体是位于膜上的蛋白质，把物质从膜外运至膜内。物质在细胞外和膜载体的亲合力高，易结合，进入细胞后，亲和力降低，释放。由于膜载体的参与，促进扩散速度大于单纯扩散（但当被运输的物质浓度过高，而载体蛋白饱和时，速率就不再增加）。另外膜载体具有较强的特异性，如葡萄糖栽体只能运输葡萄糖。三、主动运输：（Active Transport）特点是被吸收的物质不受物质浓度梯度的制约而进入细胞。被运输的物质在细胞膜的外侧与膜载体的亲和力强，能形成载体复合物，当进入膜内侧时在能量的参与下，载体发生构型变化，与结合物的亲和力降低，营养物质便被释放出来，这样物质可以从低浓度向高浓度输送。在主动运输过程中，被运输的物质不发生任何化学变化。主动运输必须有能量参与。四、基团移位：（Group Translocation）基团移位是一种即需特异性载体蛋白又须消耗能量的运输方式。但溶质在运送前后会发生分子结构的变化，这点不同于主动运输。基团移位主要用于运送葡萄糖分子、果糖、甘露糖、核苷酸、丁酸和腺嘌呤等物质。以葡萄糖为例说明一下，其特点是每输入一个葡萄糖分子，要消耗一个ATP的能量，运送机制是依靠磷酸转移酶系统，即磷酸烯醇式丙酮酸一已糖磷酸转移酶系统，其运送步骤为：（1） 热稳载体蛋白（HPR Heat-Stable Canier Protein）的激活：细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPR激活。Pep+Hpr 丙酮酸+P-HprHpr一种低分子量的可溶性Pr，结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用。酶I一种可溶性细胞质Pr（2） 糖被磷酸化后运入膜内：膜外环境中的糖先与外膜表面的酶II结合结合，再被运到内膜表面。这时，糖被P-Hpr上的磷酸激活，通过酶II的作用把糖磷酸释放到细胞内。P-Hpr+糖 糖-P+Hpr（细胞外） （细胞内）酶II一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶II。第四节 培养基培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质。为了研究微生物的生命活动规律和生产微生物制品，配好培养基是取重要的基础工作。一个好的培养基要能充分保证微生物生长繁殖和积累代谢产物，为此在配制培养基时，针对微生物的不同营养类型，满足其六大营养要素，且比例合适。别外要注意：培养基一旦配成，必须立即灭菌，否则很快引起杂菌丛生。一、 选用和设计培养基的原则和方法（一） 四条原则：1、 明确目的： 在设计之前，首先要明确目的，如要培养何菌？获何产物？用于研究还是生产？作“种子”还是发酵？如果用于研究则不必过多计较成本，但必须明确使用目的，即作一般培养还是作精细的生理、代谢或遗传等用。对前者要求不高，对后者则要精细。如果用于工业生产中的种子，则要其营养成分丰富些，菌体生长快些，应要求较低的C/N，如果用于发酵，则C/N可高一些，便于积累代谢产物。2、 营养协调：通过菌体成分的分析知，在各种微生物的细胞中，不同成分或元素间有较稳定的比例，要根据不同的培养目的和不同种类的微生物，调节好各种营养成分的比例，尤其是C/N，C/N是指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子的摩尔数与N源子的摩尔数之比。不能简单地理解为某碳源与氮源的重量之比，这是因为不同物质，其含C或N的量不一致。3、 物理化学条件适宜：（1）PH：各类微生物都有其合适的生长PH范围，如细菌PH在78，放线菌在7.58.5, 酵母菌在3.86.0, 而霉菌在4.05.8间, 对具体微生物来说,都有特定的最适PH。在微生物的生长繁殖过程中，由于代谢产物的生成，会改变原来的PH，因此会影响或杀死微生物，因此在配制培养基时应考虑到培养基的PH调节能力，那么怎样实现PH的自我调节呢？有两种方法：（1）采用加入磷酸缓冲液的方式：通过调节K2HPO4和KHPO4两者之间的浓度比就可获得从PH6.07.6之间的一系列稳定的PH。如当两者为等摩尔浓度比时，PH可稳定在6.8，其原理如下：K2HPO4+HCI KH2PO4+KclKH2PO4+Kcl K2HPO4+H2O（2）采用加入CaCo3作“备用碱”的方式：CaCo3在水中的溶解度极低，加入培养基中，不会使PH升高，当微生物产酸时，就会被溶解，其原理如下：CO3-2 HCO3-1 H2CO3 CO2+H2O4、 透压和Aw（水分活度）渗透压过高或过低都不利于微生物的生长，过高造成质壁分离，过低造成细胞吸水膨胀。等渗溶液最适宜微生物的生长。微生物在长期的进化过程中，形成了一套高度适应渗透压的特性，尤其是通过体内大分子贮藏物的合成和分解方式来适应。比渗透压更有生理意义的是aw（Water Acticity）。其含义为：在同温同压下，某溶液的蒸汽压P与纯水蒸汽压P0之比。也等于溶液的百分相对湿度（ERH） P ERHaw= = _ P0 100各种微生物生长繁殖所需aw一般在0.9980.6之间。 5、 经济节约：主要是指在生产实践中使用大量培养基时应遵循的原则，如果下功夫，这方面的潜力是极大的，大致可从这样几个方面考虑：以粗代精，以野代家，以废代好，以简代繁，以烃代粮，以纤代糖，以国代进。（二） 四种方法：1、 生态模拟：在自然条件下，凡有微生物大量生长繁殖的地方，认为是具备微生物适应生长的条件。可据此利用生态模拟的方法，配制一些初级、天然培养基，如：用肉汤、鱼汁培养多种细菌；水果汁培养酵母；米糠培养霉菌，用米饭面包培养根霉；用肥土培养放线菌等。2、 查阅文献：参阅文献中的现有资料、数据等。3、 精心设计：借助优选法或正交试验工具。4、 试验比较：小试-中试-生产。二、培养基的种类： 培养基名目繁多，种类各异，为了便于系统化，对其进行分类。（一） 按对培养基成分的了解程度分：1、 天然培养基：利用一些天然材料制成的培养基，对其成分无法确定。如用肉汤、 芽汁等制成的。 适合作实验室用的基本培养基及大生产中的种子培养基。优点：取材广泛，营养丰富，种类多样，配制方便。缺点：成分不稳定，不清楚，因而无法作精细的定量分析。如：肉汤培养基等。2、组合培养基：（合成培养基、化学限定培养基或综合培养基）是用化学成分及其数量都很清楚的物质配制的培养基。如：培养放线菌的高氏一号培养基等。优点：成分精细，重演性高缺点：价格较贵，配制复杂用途：一般用作营养、代谢、生理、生化、遗传、育种、菌种鉴定和生物测定等较高的研究工作。3、组合培养基：既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基称-。如土豆糖培养基，严格讲凡是未经严格处理的琼脂的培养基都属-。（二） 按物理状态分：1、固体培养基：外观呈固态的培养基。根据固体的性质又可分为四种（1） 凝固培养基：在液体培养基内加入12%琼脂或512%的明胶，可遇热熔化、遇冷凝固，适合实验室用。（2） 非可逆性凝固培养基：指由血清凝固或无机硅胶配制的凝固后不能再融化的培养基（3） 天然培养基：由天然基质配制的培养基，如米糠、木屑、纤维、稻草粉等。（4） 滤膜：是一种醋酸纤维素薄膜，如果把它覆盖在琼脂或浸有培养液的纤维素衬垫上，可将液体内的微生物过滤下来。常用来计算水样中的含菌量。用途：广泛，可用于菌种的分离、鉴定、菌落计数等。可用于菌种保藏、生物活性物质测定等。2、半固体培养基：在液体培养基内加入少量琼脂（0.5%左右），当培养基倒放时会流动，这种培养基称-用途：细菌运动观察（穿刺接种）噬菌体的效价；厌氧菌的培养及菌种保藏。3、液体培养基：不加入凝固剂呈液体状态的培养基即-用途：广泛，在实验室中作各种生理、代谢研究和获得大量菌体，生产上绝大多数用液体培养基。4、脱水培养基：（dehydrated culture media）又称商品脱水培养基或预制干燥培养基，指含有除水以外的一切成分的商品培养基，用时只需加水和灭菌即可。（三） 按培养基的功能分：1、基础培养基：含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。如：牛肉膏蛋白胨培养基是培养细菌的基础培养基。2、选择性培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或对某些化学、物理因素的抗性而设计的培养基叫-。它的目的是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。混合样品中某种数量很少的微生物，用直接平板划线或稀释分离，难以秦效，这时根据该菌的“嗜好”，专门加入某种营养物，使它成为一种“加富培养基”而得到某菌种；另外一种办法是在混合菌液中，加入能抑制优势菌生长的物质，使其变成劣势菌，而原来的劣势菌相对变成优势菌，从而得到分离。3、加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。如加入血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。一般是用来培养营养要求苛刻的微生物。一定意义上有选择的作用。它可以增加所要分离微生物的数量，达到富集，从而形成优势，淘汰其它菌种。4、鉴别培养基：是在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可与培养基中的特殊化学物质发生反应，产生明显的变化，这样可将该种微生物与其它微生物区分开来，这种培养基叫第五节 微生物的纯培养人类对微生物的应用研究在大多数情况下是利用微生物的纯培养物。在自然界中，微生物一般是群居的，因此需要我们把所需要的微生物从混杂的群体中将其分离出来。我们把只有一种微生物的培养物称为纯培养物。这一过程称为微生物的纯培养。根据纯培养过程中所用的技术不同，可大致分成如下几类。一、 固体培养基分离纯培养：即利用微生物在固体培养基中生长可形成肉眼可见的菌落而进行培养。（重复解释一下菌落的定义）1、 稀释平板法：（pour plate method）无菌水稀释样品取不同稀释度的样液与50。C的固体培养基混合倒置培养挑取菌落重复纯种2、 平板划线法（spread plate method）：以无菌接种环沾取少量样品，在平板上划线。3、 稀释摇管法(dilution shake culture)： 此法是用固体培养基来培养严格厌氧的微生物。如果微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后放在封闭的容器中，采用化学、物理或生物的方法清除。对于哪些对氧气敏感的微生物，纯培养分离可采用稀释摇管法。它是稀释平板法的一种变通形式。熔化固体培养基并冷却到50。C左右将待分离的材料用此培养基梯度稀释（同稀释平板法似）迅速摇匀凝固后在试管中倒一层固体石蜡和液体石蜡的混合无菌液培养在琼脂柱中形成菌落用无菌无氧的空气将琼脂柱吸出用无菌刀将琼脂柱切成段观察或移植。二、液体培养基分离纯培养：大多数细菌和真菌用平板法分离是完全可以的，因为它们能在固体培养基是很好的生长。但有一些微生物不能在固体培养基上生长，如细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等。通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。原理是：接种物在液体培养基中进行顺序稀释，使一支试管中分配不到一个微生物，如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能是纯培养物。采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（95%以上）表现为无微生物生长。三、单孢子分离法：此法是用显微分离法从混杂的群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。主要用具是显微镜、解剖镜或显微操作仪等。一般在专业化较高的实验进行。四、选择培养基分离：根据某种微生物的特殊营养要求，配制培养基，那么这种微生物能在此培养基上很好的生长，而其它微生物不能生长或生长受到抑制，这样可将微生物分离出来。这种方法非常适合于含量低的微生物，如某一微生物在土壤中的含量仅为102103则用平板稀释法就难以分离。通常采用选择培养基使之数量得到增加，再用平板稀释法分离。常用如下两种方式：1、 利用选择培养基直接分离：主要是根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。如在土壤中筛选蛋白酶产生菌，可有培养基中加牛奶或酪素，微生物生长时若产生蛋白酶，则会水解牛奶或酪素产生蛋白质水解圈，这样可将大量非产蛋白酶的微生物淘汰。也可用高温、抗生素等分离一些特定的微生物。2、 富集培养：原理：是利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易分离出特定的微生物。富集的条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综合因素等多个方面进行选择。如温度、PH值、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。如在土壤中分离能降解对羟基苯甲酸的微生物，可用下列方法。配制只含对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基接种少量土样培养取少量培养物转接到另一新鲜的培养基培养如此重复多次，使该种微生物得到富集再在平板上涂布，得菌落挑取菌落分别培养在没有该底物的培养基中和有该底物的培养基，在有底物的能生长，则为该种微生物。第五章 微生物的代谢教学目的和要求：通过本章的学习使学生掌握微生物的合成代谢和分解代谢的方式及发酵、呼吸等的概念。重点和难点：重点是微生物合成代谢和分解代谢的方式及发酵和呼吸的概念；难点是微生物代谢的方式和途径。第一节 微生物的能量代谢 大家都知道，生物的一切活动都是耗能的，因此，能量代谢就成了新陈代谢中的核心，能量代谢的中心任务是把外界环境中多种形式的最初能源转换成生物的通用能源ATP。对微生物来讲，它们可利用的最初能源不外乎三种，即有机物、日光、及还原态无机物。因此研究能量代谢的机制实际上是追踪这三类能源如何一步步转化并释放出ATP。一、 异养微生物的生物氧化和产能生物氧化就是发生在活细胞内的一系列产能氧化反应的总称。生物氧化与非生物氧化即燃烧有着若干相同点和不同点。 （一）底物脱氢：主要有四条途径：EMP、HMP、ED途径和三羧酸循环（1）EMP途径（Embdem-Meyerhof-Patnas Pathway）： EMP途径又称糖酵解途径或已糖二磷酸途径，它是经10步反应而产生2分子丙酮酸和2分子ATP的过程， EMP途径是绝大多数生物所共有的基本代谢途径。由以上途径可知，在无氧条件下整个EMP途径的产能效率是很低的，每个葡萄糖分解产生2个ATP，但其中产生的多种中间代谢物不仅可为合成反应提供原材料，而且起着连接许多有关代谢途径的作用。从微生物发酵生产的角度来看，EMP途径与乙醇、乳酸、甘油、丙酮、丁醇和丁二醇等大量重要发酵产物的生产有密切关系。（2）HMP途径：（Hexose Monophos Phatp Patgway）： 即已糖磷酸途径，又称戊糖磷酸途径，WarburgDickens途径，或磷酸葡萄糖酸途径。 该途径是一条葡萄糖不经EMP和TCA途径而得到彻底氧化，并产生大量的能量。一般认为HMP途径不是产能途径，而是为生物合成提供大量还原力（NADPH）和中间代谢产物。HMP途径在微生物的生命活动中有重要意义：（1） 为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖磷酸（核酮糖-5-磷酸是合成核酸、某些辅酶和组氨酸的原料）（2） 产生大量的NADPH2还原剂，它不仅为合成脂肪酸、固醇等重要细胞物质所需要，而且可以通过呼吸链产生大量能量，（但这不是代谢中的主要方式，不能把HMP途径看作是产生ATP的有效途径）这些都是EMP和TCA过程无法完成的，因此凡存在HMP途径的微生物，当它们处在有氧条件下时就不必再依赖TCA循环获得所需的NADH2。（3）EDP途径（Enter-Doudoroff Pathway） 又称2-酮脱氧-6磷酸葡萄糖酸裂解途径。（KDPG） ED途径是在研究嗜糖假单胞菌时发现的，是少数缺乏完整EMP途径的微生物所具有的一种替代途径，如在革兰氏阴性菌中分布较广，特别是假单胞菌和固氮菌的某些菌株较多存在，在其它生物中还未发现。其特点是葡萄糖只经4步反应即可获得EMP途径须经10步才能获得的丙酮酸。进入三羧酸循环。（4）三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycly）又称TCA循环，Krebs循环或柠檬酸循环。该循环在绝大多数异养微生物的氧化性（呼吸）代谢中起着关键性的作用。从微生物的物质代谢中可以看出TCA循环是处于枢纽的地位，工业中生产的柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸和谷氨酸等，都可在这个循环中看到。递氢和受氢：在生物体中，贮存在葡萄糖等有机物中的化学能，经上述的多种途径脱氢后，经呼吸链（或称电子传递链）等方式进行递氢，最终与受氢体CO2、无机物结合，以释放其化学潜能，根据递氢特别是受氢过程中氢受体性质不，可把生物氧化区分成呼吸（有氧呼吸）、无氧呼吸和发酵三种类型。1、 呼吸（Respiration）呼吸链是指位于原核细胞膜上或真核细胞线粒体膜上的，由一系列氧化还原势不同的氢传递体（或电子传递体）组成的一组链状传递顺序，它能把H或电子从低氧化还原势的化合物传递给高氧化还原势的分子氧或其它无机、有机氧化物，并使它们还原。在H或电子传递过程中