（遗传学专业论文）沙门菌pcr检测方法的建立及其初步应用.pdf

刘蓓蓓沙门菌p c r 检测方法的建立及初步应用 沙门菌p c r 检测方法的建立及其初步应用 研究生：刘蓓蓓 导师：焦新安教授 潘志明副教授 中文摘要 沙门菌( s a l m o n e l l a ) 是一种重要的食源性病原菌，可引起人和动物肠胃炎、伤寒、 菌血症、肠道之外定殖感染( 骨髓炎，血管内的感染或是病灶性脓肿) 、r e i t e r s 综合症等 多种疾病。人和动物常因摄入被沙门菌污染的食物、水，或是与患者接触而感染。目前许 多发达国家己建立起完善的监测和控制体系，并对该菌进行了较为深入的研究。本研究的 目的是：( 1 ) 建立沙门茵p c r 检测新方法；( 2 ) 使用不同类型的样品评价p c r 方法；( 3 ) 对本研究获得的分离株应用2 0 0 7 年美国临床实验室标准化研究所( c l s i ) 推荐使用的琼脂 扩散法进行耐药分析。 一、沙门菌p o r 检测方法的建立 以沙门菌肠毒素s t n 基因作为靶基因，建立沙门菌的p c r 检测方法。对沙门菌属a - f 群1 7 株沙门菌进行特异性检测，1 7 株沙门菌经p c r 扩增，在2 6 0b p 处分别出现属特异性 条带，说明该方法无假阴性。对埃希氏菌属的大肠杆菌标准株( a t c c2 5 9 2 2 ) 、肠出血性 大肠杆菌e h e c 、肠致病性大肠杆菌e p e c 、肠侵袭性大肠杆菌e t e c ，克雷伯氏菌属的 肺炎克雷伯杆菌，志贺氏菌属痢疾杆菌、福氏2 a 志贺氏菌，变形杆菌属的普通变形杆 菌、奇异变形杆菌，柠檬酸杆菌属的弗氏柠檬酸杆菌，肠杆菌属的阴沟肠杆菌，普罗威 登菌属的普罗威登斯菌，假单胞菌属的铜绿假单胞菌，粪链球菌，葡萄球菌，蜡样芽孢 杆菌，乳酸杆菌共1 7 种非沙门菌进行了特异性检测，均无特异性条带出现。这表明该p c r 方法具有良好的特异性。该方法可以直接检出人工污染的样品，可检测到4 3 8 5 p g 沙门菌 d n a ，增菌后p c r 最低检测限为1 c f u 。综上所述，本研究建立了沙门菌的p c r 检测方 法，该方法具有良好的特异性、敏感性，适合沙门菌的检测，为沙门菌监测提供了新方法。 扬州大学硕士学位论文 二、p c r 方法的初步应用 2 一 在2 0 0 8 年7 月2 0 0 9 年1 月，随机采集禽源的肛拭、肝脏病料和鸡蛋样品共1 0 8 2 份， 猪源的肛拭、肉类和淋巴结样品共4 6 6 份，扬州地区环境和游泳池水样共5 8 份。用p c r 方法检测这三种来源的样品，并进行沙门菌的分离。结果显示：1 0 8 2 份禽源样品检出4 l 份阳性，4 6 6 份猪源样品检出1 5 份阳性，5 8 份水源样品检出2 份阳性，共获得5 8 株分离 株，经国标方法验证为沙门菌。通过大量样本验证了本研究建立的p c r 方法适用于禽源、 猪源、水源样品的检测，而且适用于不同类型的样品检测如：肛拭、肝脏、水样、肉类样 品等。 沙门菌分离株的耐药性分析 采用2 0 0 7 年美国临床实验室标准化研究所( c l s i ) 推荐使用的琼脂扩散法对10 0 株沙门 菌的耐药性进行了研究。 药敏结果显示，沙门菌的耐药性较高，而且多重耐药状况不容乐观。结果表明，1 0 0 株沙门菌对头孢类抗生素敏感，但是对萘啶酸、四环素和链霉素产生了较强的耐药性。耐 药谱的分析结果显示，1 0 0 株分离株的多重耐药主要集中在2 耐到5 耐和1 3 耐，占7 8 1 3 。 这些数据表明，在我国，沙门菌的多重耐药的现象十分严重，耐药谱也比较宽，有4 株沙 门菌分离株对1 3 种抗生素同时产生了耐药性。本研究中不同样品来源的分离株对不同种 类抗生素的敏感性存在一定的差异，因此在临床上应用抗生素防治沙门菌病时，必须结合 药敏试验结果选择高敏药物或配合用药，并且做到定期更换药物、合理用药才能起到预期 的效果。多重耐药沙门菌的出现应引起重视，这些细菌将对人群的健康构成严重的威胁， 因此，在医学和兽医学临床，都必须谨慎和科学使用抗生素药物。 关键词：沙门菌；p c r ；禽源；猪源；水源；药敏试验 刘蓓蓓沙门菌p c r 检测方法的建立及初步应用 3 d e v e l o p m e n ta n dp r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o no f ap c r a s s a y f o rt h ed e t e c t i o no fs a l m o n e l l a s p p m s c a n d i d a t e ：b e i b e il i u a d v i s o r s ：p r o f x i n a nj i a o a s s o c i a t ep r o f z h i m i n gp a n a b s t r a c t s a l m o n e l l ai sa l li m p o r t a n tf o o d b o r n ep a t h o g e nw h i c hc a nc a u s es o m eh u m a na n da n i m a l d i s e a s e s ，s u c ha sg a s t r o e n t e r i t i s ，e n t e r i cf e v e r ，b a c t e r a e m i a ，e x t r a - i n t e s t i n a ll o c a l i s e di n f e c t i o n l i k eo s t e o m y e l i t i s ，e n d o v a s c u l a ri n f e c t i o no rf o c a la b s c e s sa n dr e i t e r ss y n d r o m e s a l m o n e l l o s i s i so f t e nc a u s e db yi n g e s t i n gc o n t a m i n a t e df o o do rw a t e r ，o ro c c a s i o n a l l yb yc o n t a c tw i t hi n f e c t e d p e r s o n so ra n i m a l s a tp r e s e n t ，m a n yd e v e l o p e dc o u n t r i e sh a v eg a i n e ds u b s t a n t i a li n s i g h ta b o u t t h ee c o l o g y , e p i d e m i o l o g ya n dp a t h o g e n i c i t yo fs a l m o n e l l aa n ds e tu pc o m p l e t em o n i t o r i n ga n d c o n t r o ls y s t e ma g a i n s ti t t h eo b j e c t i v e so ft h i ss t u d yw e r e ：( 1 ) d e v e l o pap c ra s s a yf o rt h e d e t e c t i o no fs a l m o n e l l a ；( 2 ) e v a l u a t et h ep c ra s s a yb yt e s t i n ga b u n d a n c ed i f f e r e n tt y p e so f s a m p l e s ；( 3 ) d e t e c tt h ea n t i m i c r o b i a ls u s c e p t i b i l i t yo ft h ei s o l a t e si nt h i ss t u d yw i t hd i s kd i f f u s i o n m e t h o dr e c o m m e n d e db yc l i n i c a la n dl a b o r a t o r ys t a n d a r di n s t i t u t ei n2 0 0 7 1 d e v e l o p m e n to fa p c r a s s a yf o r t h ed e t e c t i o no fs a l m o n e l l as p p ap c ra s s a yt a r g e t i n gs a l m o n e l l ae n t e r o t o x i ns t ng e n ew a sd e v e l o p e di nt h i ss t u d y s p e c i f i c i t yo ft h ea s s a yw a se v a l u a t e db yt e s t i n g17s t a n d r a ds t r i a n so fs a l m o n e l l a t h ep c r r e s u l t ss h o w e dt h a t ，t h e2 6 0b pg e n u s s p e c i f i cb a n da p p e a r e df r o ma l lt h e17s t r a i n s ，w h i c h i n d i c a t e dt h e r ew e r en of a l s en e g a t i v er e s u l t s a n d17r e f e r e n c es t r a i n ss u c ha se s c h e r i c h i ac o l i ( a t c c2 5 9 2 2 ) ，e n t e r o h e m o r r h a g i ce s c h e r i c h i ac o l i ，e n t e r o p a t h o g e n i c e s c h e r i c h i ac o l i ， e n t e r o i n v a s i v ee s c h e r i c h i ac o l i ，k l e b s i e l l ap n e u m o n i a ，s h i g e l l ad y s e n t e r i a e ，s h i g e l l a f l e x n e r i2 a ， p r o t e u sv u l g a r i s ，p r o t e u sm i r a b i l i s ，c i t r o b a c t e rf r e u n d i i ，e n t e m b c i c t e rc l o a c a e ，p r o v i d e n c i a b a c t e r i a ，p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ，f e c a ls t r e p t o c o c c u s ，s t a p h y l o c o c c u s ，b a c i l l u sc e r e u s ，l a c t i c a c i db a c t e r iw e r ef u r t h e rd e t e c t e d t h e r ew a sn os p e c i f i cb a n da m p l i f i e df r o mt h e s e17 n o n s a l m o n e l l as t r a i n s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h i sm e t h o dw a ss p e c i f i cw i t hn of a l s ep o s i t i v e 扬卅i 大学硕士学位论文 4 r e s u l t s i tw a ss h o w nt h a tt h ep c r a s s a yc o u l dd e t e c ta r t i f i c i a ls a l m o n e l l ac o n t a m i n a t e ds a m p l e s ， a n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s 4 3 8 5 p gd n a o r1 c f ua f t e rc u l t i v a t i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a t as p e c i f i ca n ds e n s i t i v ep c rm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d ，a n dt h i sn e wm e t h o dp r o v i d e d au s e f u lw a yf o rt h ed e t e c t i o na n dm o n i t o r i n go fs a l m o n e l l a 2 p r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o no ft h ep c ra s s a yf o rt h ed i f f e r e n tt y p e so fs a m p l e s f r o mj u l y2 0 0 8t oj a n u a r y2 0 0 9 ，10 8 2s a m p l e so fa n u ss w a b ，l i v e ra n de g g sf r o ma v i a n ， 4 6 6s a m p l e so fa n u sm o p ，m e a ta n dl y m p hn o d ef r o ms w i n e ，5 8w a t e rs a m p l e sf r o mp o o la n d e n v i r o n m e n ti ny a n g z h o ur e g i o nw e r ed e t e c t e db yt h ep c ra s s a y , a n ds a l m o n e l l aw a si s o l a t e d f r o mt h ep o s i t i v es a m p l e s r e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h e r ew e r e41p o s i t i v e so u to fa v i a ns a m p l e s ，15 p o s i t i v e so fs w i n es a m p l e s ，2p o s i t i v e so u to fw a t e rs a m p l e s w et o t a l l yg a i n e d5 8i s o l a t e so f s a l m o n e l l a t h ep c rm e t h o dw a sv e r i f i e db ya b u n d a n c es a m p l e s ，w h i c hi n d i c a t e dt h a ti tw a s s u i t a b l ef o rd e t e c t i o no fs a m p l e sf r o ma v i a n ，s w i n e ，w a t e r , e t c ，a n da p p l i c a b l ef o rd i f f e r e n tt y p e s o fs a m p l et e s t ss u c ha st h ea n u sm o p ，l i v e r , w a t e rs a m p l e s ，m e a t 3 a n t i b i o t i cr e s i s t a n c eo fs a l m o n e l l ai s o l a t e s 10 0s a l m o n e l l ai s o l a t e sw e r et e s t e df o rt h e i rs e n s i t i v i t yt o18a n t i m i c r o b i a la g e n t sb yt h e d i s kd i f f u s i o nm e t h o dr e c o m m e n d e db yc l i n i c a la n dl a b o r a t o r ys t a n d a r di n s t i t u t ei n2 0 0 7 t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h el e v e lo fa n t i b i o t i cr e s i s t a n c eo fs a l m o n e l l ai sh i g h ，a n dt h es i t u a t i o no f m u l t i p l ea n t i b i o t i cr e s i s t a n c eo fs a l m o n e l l ai sn o to p t i m i s t i c a l t h o u g h10 0s a l o m n e l l ai s o l a t e s w e r eh i 曲l ys e n s i t i v et oc e p h a l o s p o r i n s ，t h e yw e r es t r o n g l yr e s i s t a n tt on a l i d i x i c a c i d ， t e t r a c y c l i n ea n ds t r e p t o m y c i n s t u d i e so nd r u g - r e s i s t a n ts p e c t r u ms h o w e dt h a tt h em u l t i - d r u g r e s i s t a n c eo f10 0i s o l a t e sr a n g i n gf r o m2r e s i s t a n c et o13r e s i s t a n c e ，m a i n l yc o n c e n t r a t e di nt h e2 r e s i s t a n c et o5r e s i s t a n c ea n d13r e s i s t a n c e ，w h i c ha c c o u n t e df o r7 8 13 t h e s ed a t as h o w e d t h a ti no u rc o u n t r y , t h ep h e n o m e n o no fm u l t i - d r u gr e s i s t a n c eo fs a l m o n e l l ai sv e r ys e r i o u s t h e i s o l a t e sw e r eh i g h l yr e s i s t a n tt oab r o a ds p e c t r u mo fd r u g si no u rs t u d y , e s p e c i a l l yf o u r s a l m o n e l l ai s o l a t e sr e s i s t a n c et o13k i n d so fa n t i b i o t i c s i nt h i ss t u d y , i s o l a t e sf r o md i f f e r e n ts o u r c e ss h o w e dd i f f e r e n ts e n s i t i v i t yl e v e lt od i f f e r e n t t y p e so fa n t i m i c r o b i a l t h e r e f o r e ，i ti si m p o r t a n tt oc h o o s er a t i o n a ld r u g so rm e d i c a t i o nb a s e do n t h er e s u l t so fs e n s i t i v i t yt e s ti nt h ec l i n i c a la p p l i c a t i o no fa n t i b i o t i ct op r e v e n ta n dc o n t r o lo f 刘蓓蓓沙门菌p c r 检测方法的建立及初步应用 5 s a l m o n e l l o s i s m o r ea t t e n t i o ns h o u l d b ep a i dt ot h ee m e r g e n c eo fm u l t i d r u gr e s i s t a n c e s a l m o n e l l a ，w h i c hw o u l dc a u s es e r i o u sh e a l t ht h r e a t st ot h ee n t i r ep o p u l a t i o n s o ，i nc l i n i c a l m e d i c i n ea n dv e t e r i n a r ys c i e n c e ，a n t i b i o t i c sm u s tb ec a r e f u l l ya n d s c i e n t i f i c a l l yu s e d k e yw o r d s ：s a l m o n e l l a ；p c r ；a v i a nb o r n e ；s w i n eb r o n e ；w a t e rb r o n e ；a n t i m i c r o b i a l s u s c e p t i b i l i t yt e s t 扬州大学硕士学位论文 8 缩写 h g “l l a m m g m l m m g l m m o l n g p g r p m s v b p d h m m w c f u p c r p h d n a d n t p s w p b s n a c l 英文 m l c r o g r a m m i c r o l i t e r m i c r o m e t e r m i l l i g r a m m i l l i t e r m i l l i g r a m g r a m l i t r e m i l l i m o l n a n o g r a m p l c o g r 锄 r o t a t i o np e rm i n u t e s e c o n d v o l t b a s ep a i r d a y h o u r m i n u t e w e e k c o l o n yf o r m i n gu n i t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n h y d r o g e n i o nc o n c e n t r a t i o n d e o x y r i b o n u c l e o t i d ea c i d d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s u p e r p u r ew a t e r 符号说明 中文 微克 微升 微米 毫克 毫升 毫米 克 升 毫摩尔 纳克 皮克 辕| 食 秒 伏特 碱基对 天 小时 分钟 周 菌落形成单位 聚合酶链反应 氢离子浓度 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 超纯水 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 s o d i u mc h l o r i d e 氯化钠 刘蓓蓓沙门菌p c r 检测方法的建立及初步应用 9 n a 2 h p 0 4 d i s o d i u mh y d r o g e np h o s p h a t e k c n s c e l l s a l s o f d a c l s i u s d a c d c n c t c a t c c w h o e f s a s e l e n i t ec y s t i n eb r o t h 磷酸氢二钠 氰化钾 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附试验 i n t e r n a t i o n a ls t a n d a r d i z a t i o no r g a n i z a t i o n f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o n c l i n i c a la n dl a b o r a t o r ys t a n d a r di n s t i t u t e u n i t e ds t a t e sd e p a r t m e mo f a g r i c u l t u r e c e m e mf o rd i s e a s ec o n t r o la n dp r e v e n t i o n n a t i o n a lc o l l e c t i o no ft y p ec u l t u r e a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n e u r o p e a nf o o ds a f e t ya u t h o r i t y 国际标准化组织 食品与药品管理局 美国临床实验室标准化研究所 美国农业部 疾病预防控制中心 英国的国家典型菌种保藏所 美国菌种保藏中心 世界卫生组织 欧洲食品安全局 刘蓓蓓沙门菌p c r 检测方法的建立及初步应用 5 9 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：划穆萑 签字日期： o 阳矿年歹月5 7 e l 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名：支d 萑霭 签字日期：2 0 0 ? 年5 月乡日 谯。幼 期：力7 年厂月列日 扬州大学硕：l 学位论文 1 0 第一章文献综述 沙门菌( s a l m o n e l l a ) 是一种重要的人兽共患病原菌，是全球范围内引起人胃肠道感 染最常见的病原菌，也是引起旅行者腹泻的主要致病菌。特定血清型沙门菌可引起急性的 威胁生命的伤寒症( t y p h i o df e v e r ) 。人类感染沙门菌的主要途径是食入被沙门菌污染的食 品、水，以及与感染的病人接触【l 】。因此采取合理的食品安全措施可阻断沙门菌的传播， 控制腹泻的流行以及降低沙门菌病的发病率。本文对沙门菌的分类及命名、病原学、流行 病学、危害、污染情况、检测方法及耐药性作一综述。 1 概述 沙门菌是引起人类腹泻和伤寒症的主要致病菌。少数感染了沙门菌的病人，会出现关 节痛、眼睛刺激及排尿疼痛，这一现象称为r e i t e r s 综合症，可持续数月或数年，并可导致 难以治疗的慢性关节炎。沙门菌能够感染人和动物，每年会引起1 3 亿人类疾病1 2 j 。m i l l e r l 3 j 等调查研究显示，每年大约1 0 万例沙门菌病病例与猪肉消费有关，相应的每年社会损失大 约8 0 0 0 万美元。另外，受一些因素影响，人类中沙门菌病例的数目很可能被低估【4 ，5 1 。沙门 菌病的暴发流行己受到社会的关注，相关部门也采取了相应的防控措施，但其年发病率还 未得到有效控制。沙门菌病的主要传染源是家禽、家畜、宠物以及鼠类，因此减少家禽家 畜中沙门菌的携带率，有助于控制沙门菌病的发生。本文将从沙门菌的病原性、流行病学、 危害、污染情况、检测方法以及沙门菌耐药性的研究进展作一综述。 沙门菌一一食源性病原菌 2 1 分类及命名 根据w h i t e ，k a u f f m a n n 等早期研究工作确定的沙门菌抗原表，将沙门菌分为2 个种 和7 个亚种，即s e n t e r i c a ( 该种又分为6 个亚种：s e n t e r i c as u b s p e n t e r i c a ，s e n t e r i c a s u b s p s a l a m a e ， s e n t e r i c a s u b s p a r i z o n a e ， s e n t e r i c a s u b s p , d i a r i z o n a e ， s e n t e r i c a s u b s p h o u t e n a e ，s e n t e r i c as u b s p i n d i c a ) 和s b o n g o r 【6 ，7 1 沙门菌血清型是基于菌体抗原和 鞭毛抗原来区分【8 】。肠道沙门菌肠道亚种的血清型通常根据初次分离时的地理位置命名， 首字母大写，名字使用罗马字母书写。其他亚种的血清型命名方式是亚种名后加上抗原式。 k a u f f m a n n w h i t e 抗原表中列出了沙门菌血清型的简化抗原式1 9 。 刘蓓蓓沙门菌p c r 检测方法的建立及初步应用 w h i t e ，k a u f f m a n n 等早期研究工作确定的沙门菌抗原表，现由设在法国巴斯德研究 所的世界卫生组织( w h o ) 沙门菌标准和研究协作中心，每年根据全球研究结果公布一次 【1 0 1 。并且随着科学技术的发展，新的沙门菌型不断被发现，对沙门菌抗原研究的不断深入， 此抗原表也在做相应的修改。最新一期抗原表中共收录沙门菌2 5 4 1 个血清型【l l 】。 2 2 病原学 沙门菌属于肠杆菌科，革兰氏阴性直杆菌，大d , o 7 1 5 x 2 0 5 0 岬，菌落直径2 4n l l l 。 兼性厌氧，还原硝酸盐为亚硝酸盐，利用葡萄糖产气，能利用柠檬酸盐为唯一碳源，不发 酵蔗糖、水杨苷、肌醇及苦杏仁苷；精氨酸和赖氨酸脱羧酶阳性；苯丙氨酸和色氨酸脱氨 酶阴性；不产生尿素酶、脂酶和脱氧核糖核酸酶。沙门菌最适生长温度为3 5 3 7 。c ，最适p h 为7 2 7 4 。不能耐受较高盐浓度，n a c l 浓度在9 以上会致死。沙门茵在1 0 0 水中立即死 亡，在8 0 水中2m i n 死亡，6 0 水中1 5m i n 死亡。 沙门菌属细菌抗原结构相当复杂，目前共发现2 5 4 1 个血清型【l n ，其中绝大部分血清型 是以温血动物作为宿主。其中伤寒沙门菌( s a l m o n e l l at y p h i ) 和副伤寒沙门菌( s a l m o n e l l a p a r a t y p h i ) 是人类伤寒病的主要致病菌。在肠道沙门菌i 亚种( 肠道沙门菌肠道亚种) 中， 最普通的o 抗原血清群有a ，b ，c 1 ，c 2 ，d 和e 。在人类和温血动物中大约9 9 的沙门菌 感染是由这些血清群的菌株引起的1 1 2 j 。其他亚种的血清型通常从冷血动物和环境中分离 到，很少从人类中分离到【1 2 ，13 1 。 2 3 流行病学 无论在发达国家还是发展中国家，沙门菌是引起人胃肠道感染最常见的病原菌，也是 引起旅行者腹泻的主要病原菌。在美国，沙门茵是引起食源性疾病的最常见细菌【14 1 。沙门 菌病在非洲、亚洲、南美洲等发展中区域更加普遍。萘啶酸耐药性或多重耐药( 如，耐氨 苄西林、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶磺胺甲嗯唑等抗生素) 沙门菌的出现，使得该病在南亚的 发生率最高【1 5 】。w h o 已将沙门菌病列为最常见传染病之一，2 0 0 0 年我国国家食源性疾病 监测网也将沙门菌列为监测对象。 沙门菌主要寄生于动物肠道中，其宿主范围广泛如：禽、猪、人、食物和环境。本病 的主要传染源是家禽、家畜、宠物及鼠类。病人及无症状带菌者亦可作为传染源。鼠伤寒 沙门菌和肠炎沙门菌是常见的血清型，2 0 0 1 年，在美国的沙门菌病例中大约6 0 是由：鼠 伤寒( s t y p h m u r i u m i ) ( 2 2 1 ) 、肠炎( s e n t e r i t i d i s ) ( 1 7 7 ) 、纽波特( s n e w p o r t ) 扬州大学硕士学位论文 1 2 ( 1 0 o ) 和海德尔堡( s h e i d e l b e r g ) ( 5 9 ) 这四种血清型引起的【1 6 1 。2 0 0 6 年，美国的沙门 菌病的病例中1 9 是由鼠伤寒血清型弓l 起的【1 7 1 。 2 4 沙门菌的危害 伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌以人类为宿主，可引起全身感染和伤寒。而其他的沙门菌 如鼠伤寒沙门菌会引起人类肠胃判1 引。沙门菌感染会引起明显的临床症状：肠胃炎，伤寒， 菌血症，肠道之外定殖感染( 骨萌炎、血管内的感染或是病灶性脓肿) 以及无症状的慢性 携带状态【1 1 。 2 4 1 肠胃炎 在美国非伤寒沙门菌是引起人类肠胃炎的重要原因，据估计每年有1 4 0 万人感染，大 约4 0 0 例死亡1 1 9 。感染非伤寒沙门菌最常见的表现是肠胃炎。在摄入污染的食物或水后 2 4 4 8h 出现症状，如发热、头疼、腹泻、腹痛【1 4 1 。疾病的严重性和发作时间与摄入的细菌 量( 感染剂量) 相关1 2 。腹泻常是自限性的，病程通常3 7d 。5 以下的肠胃炎病例中会 并发沙门菌菌血症【2 。菌血症的并发症有：心内膜炎、霉菌性动脉瘤和骨髓炎。尽管肠胃 炎是自限性的，但是血管感染的风险会随着年龄增长而增大，5 0 岁以上的概率为1 0 t 2 2 1 。 2 4 2 伤寒 伤寒是由伤寒沙门菌或甲、乙、丙型副伤寒沙门菌引起，产生的临床症状分别是伤寒 症和副伤寒。伤寒沙门菌和甲、乙、丙型副伤寒宿主只限于人类。该病的特征是发热和腹 部病症，大多集中在1 0 1 4d 发病( 持续范围是3 2 1d ) 【1 4 】。人感染该病后会寒战、发汗、 不舒服、头疼、干咳、肌痛和关节痛，随后就会发热。严重时会引发肠出血，肠穿孔等并 发症【1 】。伤寒引起的菌血症通常会引起肠外的疾病，包括：肝脏、脾、淋巴结、皮肤、骨 头、关节、心内膜或是中枢神经系统【2 3 】。伤寒通常需要住院治疗，密切监控并发症并进行 抗生素治疗。伤寒症状是高变的，任何从有发热地方病的国家回来的病人都可能感染伤寒。 及时通知相关卫生部门可以加速调查，阻止后发的案例( 在澳大利亚的许多州是强制性 的) 。 综上所述，沙门菌相关疾病繁多，发病形式多样。虽然沙门茵病以自限性为主，但发 病率高、接触率高、并发症严重且愈后差。沙门菌感染给社会公共安全带来了重大影响。 因此，在加强对流通食品中沙门菌的监测时，必须切断沙门菌在食物链中的传播，从储存 刘蓓蓓沙门菌p c r 检测方法的建立及初步应用 1 3 宿主的源头上进行控制才能有效防控沙门菌病及其并发症的发生。 3 沙门菌在禽，猪和水中的污染状况 3 1 禽及蛋类 家禽是沙门菌的重要宿主，该菌通过人与活禽接触可以传播给人类，这是公认的公共 卫生问题 3 5 , 3 6 】。最近几例沙门菌感染暴发的根源是雏禽，主要由雏鸡和雏鸭引起 3 7 1 。2 0 0 7 年两例不同的沙门菌病的暴发很可能是由邮购或是从农业食品商店购买的活禽引起的【3 8 】。 儿童中感染沙门菌与复活节购买的宠物鸟相关，成人患沙门菌病与成年鸟接触有关 3 a 】。小 于2w 的雏鸡会发生高死亡率的急性暴发3 0 1 。携带者通过肠道内容物污染环境从而促进沙 门菌在群体内的传播 3 1 , 3 2 】。屠宰前的鸡被认为是食物处理链后期鸡体沙门菌污染的主要来 源【3 9 1 。 禽和禽产品是最常见的传染源，大量沙门菌病例的病源是没煮熟的或生的鸡蛋【2 4 1 。部 分研究者认为肠炎沙门菌是由啮齿动物引入禽群的，主要是因为使用了肠炎沙门菌作为灭 鼠剂【2 5 2 6 1 。1 8 9 5 年旧金山耶尔森鼠疫暴发时，人们第一次使用肠炎沙门菌来控制啮齿动 物的数量，直至u 1 9 6 0 年，欧洲有些地区也使用肠炎沙门菌作灭鼠剂 2 7 1 。禽类中沙门菌的 污染与沙门菌在小鼠中的出现有关。肠炎沙门菌污染蛋产品可归因于损坏蛋的使用，以及 损坏前后的污染。肠道携带沙门菌可使蛋壳被污染，沙门菌经卵巢污染鸡蛋内容物2 8 , 2 9 1 。 荷兰的流行病学调查表明蛋类直接从农场环境获得和经垂直传播途径获得感染的概率很 小【3 3 】，但是w a r d 等表示上世纪8 0 年代早期英国肠炎沙门菌的流行与引入感染了噬菌4 型 的禽类饲养线有关瞰】。 3 2 猪 食用污染的猪肉是人类感染沙门菌的重要原因。据估计在欧洲不同国家沙门菌病 1 5 2 3 的病例与猪肉的消费相关 4 3 - 4 5 j 。猪肉相关的鼠伤寒沙门菌和德尔卑沙门菌多重耐药 性的出现可能对人类的健康带来严重的威胁。在2 0 世纪5 0 至6 0 年代期间，从猪体内分离到 的沙门菌菌株的主要血清型是猪霍乱和k u n z e n d o r f 变异株【4 1 1 。猪霍乱沙门菌是从猪体内分 离到的首个沙门菌血清型4 0 1 。欧洲食品安全局( e f s a ) 认为从猪体内分离到的所有血清 型的沙门菌对公共安全都存在风斟4 2 1 。政府尝试着去预见猪肉中非伤寒沙门菌可能引起的 问题，启动沙门菌监控机制并调整管理措蒯引。2 0 0 7 年j a n s e n 等【4 6 峙艮道猪肉相关的非伤寒 扬州大学硕上学位论文 1 4 沙门菌病会造成致命的结果。消费污染的猪肉引起沙门菌传染的公共卫生风险因素包括： 猪群感染的水平 4 7 , 4 8 】，屠宰场畜体处理时的卫生状况【4 4 1 ，肉类储存和分发的情况【4 9 1 ，以及 消费者食用未煮熟的猪肉【4 刀。 3 3 水环境 在不同种类的水源中均能检测到沙门菌。多种不同类型血清型的沙门菌可从被人和动 物粪便污染的水环境中分离到，特别是在一些河水、河口水和海水中【5 0 】。1 9 9 5 至2 0 0 2 年， 法国塞纳河口分离n 5 3 种沙门菌血清型，最常分离到的3 种血清型是，鼠伤寒沙门菌、婴 儿沙门菌和维尔肖沙门菌【5 0 1 。在自然水环境中，v b n c 状态的病原菌能够保持毒力因子， 当进入人体内复苏后，会对人类健康产生潜在的威胁【5 0 l 。沙门菌可在水中常年存在，饮用 了未经处理或处理后再次污染的水可导致沙门菌病的暴发。 4 沙门菌检测技术 4 1 常规分离鉴定方法 沙门菌常规分离鉴定方法包括前增菌培养，选择性增菌培养，选择性平板分离，生化 鉴定和血清学鉴定。这些程序费时费力，确定阴性结果通常要用4 5d ，确定阳性结果至少 需要1w 。常用的液体培养基包括，蛋白胨缓冲水( b p w ) 和亚硒酸盐胱氨酸增菌液( s c ) ； 增菌后，沙门菌在固体选择性培养基( 表1 1 ) 上进行分离培养。 三糖铁琼脂、蛋白胨水靛基质、尿素、氰化钾( k c n ) 、赖氨酸脱羧酶生化试验等可 将沙门菌鉴定到属水平，而更细致的种特异性鉴定则需要进行血清型试验，包括o 抗原、h 抗原以及抗原的鉴定。 近年来出现了一些商业化的鉴定系统，女n a m s 、v i d a s 、a p l 2 0 e 等。a m s 为美国v i t e k 厂 产品，属于自动化程度高的仪器。法国梅里埃生物公司研制开发的a p i2 0 e 方法，对生化试 验做到了微型化和集约化，在一个试剂条上集中了2 0 种生化反应，一次性可完成所有的生 化试验，鉴定可以达到沙门菌种的水平。v i d a s 法运用了现代的酶联免疫荧光技术( e l f a ) ， 它运用的是结合抗体的荧光化合物，当用荧光标记的高度专一性单克隆抗体与沙门菌抗原 反应，形成的荧光物质可通过仪器检测出来，从而达到对沙门菌进行快速筛选的目的，但 其仪器设备和耗材都较昂贵。 目前，我国出入境检验检疫行业标准中的沙门菌检验方法( s n0 1 7 0 一9 2 ) 是依靠生化 刘蓓蓓沙门菌p c r 检测方法的建立及初步应用 1 5 反应和血清学反应对沙门菌进行检验鉴定，它是一种传统的沙门菌鉴定方法，在国际上被 广泛承认，是鉴定沙门菌的基准方法，如出现争议，应以此法为基准【5 2 1 。 表1 1 沙门菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 t a b l el - 1c o l o n yc h a r a c t e r i s t i c so nv a r i e t ys e l e c t i v ea g a ro f s a l m o n e l l as u b g r o u p 幸