（食品科学专业论文）L肉碱的提取检测及减肥抗疲劳功能的研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 本文采取三种不同溶剂( 水、高氯酸、盐酸) 提取不同品种肉( 羊肉、 牛肉、猪肉、鸡肉) 的l 一肉碱，并用酶法和高效液相色谱法对采用不同提 取方法及不同品种肉( 羊肉、猪肉、牛肉、鸡肉) 中的l 一肉碱含量进行比 较，得出结论：1 、高效液相法不易受样品中其它物质的影响，且比酶法更 简便、快速、准确的检测出肉中l 一肉碱的含量：2 、羊肉中的肉碱在四种肉 中含量较高，高氯酸的提取效果在三种溶剂中是最好的，考虑到实用性问题， 用盐酸作为提取溶剂，也能得到较好的提取效果。 动物实验用昆明种小鼠，使其口服l 一肉碱溶液剂量为1 0 m g g d 、 3 0 m g g d ( i i ，i v 组分别l 喂养1o m g g d 、3 0 m g g d 的化学合成的l 一肉碱， i i i 组喂养1 0 m g g d 羊肉提取的l 一肉碱) ，采用组间对照的方法：1 、测定小 鼠的体重和游泳时间，数据显示，小鼠体重明显下降( p o 0 1 ) ，游泳时间 显著延长( p 0 0 1 ) ；2 、试剂盒测定血清总胆固醇、甘油三酯、乳酸、尿素 氮生理生化指标，真空冷冻干燥测定肌肉水分，高效液相法测定小鼠腿部肌 肉l 一肉碱含量，实验结果表明，与对照组相比，l 一肉碱对小鼠的生长发育 没有不良影响，却能显著降低体内总胆固醇、甘油二酯的含量( p 0 0 1 ) ， 摄入l 一肉碱的小鼠组血清尿素氮、乳酸含量远远低于对照组( p 0 0 1 ) ：3 、 高效液相色谱法显示，各组小鼠的体内l 一肉碱的含量与游泳时间成正比： 实验结果还显示，减肥、抗疲劳效果：服用3 0 m g g d 小鼠组的效果并不比 服用1o m g gd 小鼠组强：化学合成肉碱不如天然提取的l 一肉碱对小鼠效果 好。 再取三组昆明种小鼠做交叉实验，口服l 肉碱剂量为lo m g g d ，组 为对照组，另两组喂l 肉碱( 1 1 组羊肉提取的l 肉碱，i i i 组化学合成的i 一 肉碱) ，一段时间后，交换喂养。实验结果证明，l 肉碱的作用没有持续性。 e l l r ，同上面方法，测生理生化指标，肌肉水分含量，l 一肉碱含量，结果证 明l 肉碱效果的不持续性。最后，提取小鼠腿部肌肉中的脂舫，甲酯化， 用气相色谱一质谱法分析各个脂肪酸片断，验证l 肉碱帮助运输长链脂肪酸 进入线粒体氧化的作用。 关键词：l 一肉碱，减肥，h p l c ，血清指标，交叉实验，气- 质联用 天津科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h r e ek i n d so fs o l v e n tw e r ea p p l i e dt oe x t r a c tl c a r n i t i n ef r o mm e a t ， t h e nt h ee x t r a c t i o n sw e r ed e t e r m i n e db ye n z y m a t i ca s s a ya n dh p l c t o c o m p a r e t h er e l a t i o nb e t w e e nl c a r n i t i n ec c n t e n ta n dt h es o r t s0 fm e a t ，t h e m u t t o n ，b e e f p o r k ，c h i c k e nw e r eu s e d t h e r e s u l t ss h o w e d ：1 、t h e l c a r n i t i n eo fd e t e r m i n a t i o n o t h e r sh a dl i t t l ee f f e c to nh p l c a n di ti sm o r e s i m p l e f a s t e ra n dm o r ei m m e d i a t et h a ne n z y m a t i ca s s a y 2 、t h em u t t o n c o n t a i n st h eh i g h e s tc o n t e n t so fl c a r n i t i n ei nf o u rk i n d sm e a t ，t h eo f i t i m u m e x t r a c t i o nr a t eo fl c a r n i t i n ec a nb eo b t a i n e db yh c l o d b u tb a s e do nt h e a p p l i c a t i o n ，t h e b e t t e re f f e c ta l s oc a nb e g a i n e db yh y d r o c h l o r i c a c i d s o l v e n t k u n m i n gr a t w a sf e do nl c a r n i t i n es o l u t i o n b yo r a l a d m i n i s t r a t i o n 1 0 m g g d ，3 0 m g g d ( i i ，i v f e d0r l 1 0 m g g d ，3 0 m g g d f r o mc h e m i c a l s y n t h e s i s ，i i if e d 0 i i l o m g g d f r o me x t r a c t i o n so f m u t t o n ) u s i n g t h e c o m p a r i s o nb e t w e e ng r o u p s ：1 、t oc o n t r a s tt h eb o d yw e i g h ta n ds w i m m i n g t i m eo fr a t s ，t h e w e i g h t o fr a t s d r o p p e d ( p ( o 01 ) ，t h es w i m m i n gt i m e r i s e n ( p 0 0 1 1 ；2 、a p p l i e dr e a g e n tk i tt om e a s u r et h es e r u mi n d e x ：c h o ， t g ，u r e a ，l a c t i ca c i d ，a n dd e t e r m i n e dw a t e ro fl e gm u s c l eb yf r e e z i n g d r y n e s s 、l - c a r n i t i n eb yh p l p r e s u l t ss h o w e d ：l c a r n i t i n e o nt h eg r o w t h o fr a t sw i t h o u ta d v e r s ee f f e c t d e c r e a s i n gt h ec o n t e n to fc h 0a n dt g d i s t i n c t l y ( p o 0 1 ) ；u r e aa n d l a c t i ca c i dg r e a t l y ( p 0 0 1 ) t h eo t h e rr e s u l t s a l s om a d eo u t ：t h e 3 0 m g d g d o s ei sn o tb e t t e rt h a n 1 0 m g d g d o s e ； e x t r a c t i o n sf r o mm e a th a db e t t e rf u n c t i o no nr a t st h a nc h e m i c a ls y n t h e s i s t h r e eo t h e rr a t g r o u p s s e t u p f orc r o s s e x p e r i m e n t s ，t h e o r a l a d m i n i s t r a t i o n ( 1 0 m g g d ) o n eg r o u pf o rc o m p a r i s o n ，t h eo t h e rt w og r o u p s f e e do n l c a r n i t i n e ( i i f r o m1 1 1 u t t o ne x t r a c t io n i i if r o i l lc h o m ie n l s y n t h e s is ) t h e ne x c h a n g et h em e a n so f f e e d i n ga f t e raw h i l e o p e r a t e da s a b o v e ，t h er e s u l t ss h o w e d ：l c a r n i t i n ed o e s n th a v et h ed u r a b l ee f f e c t a t 1 a s t f a t t y a c i do f1 e gm u s c l ee x t r a c t e da n db a s i f i e di nt h em e t h a n 0 1 a n a l y s e dd r i b sa n dd r a b so ff a t t ya c i db yg c m s ，w h i c hp r o v e dl c a r n i t i n e h e l pt h et r a n s p o r t a t i o no fi o n g - c h a i nf a t t ya c i d k e y w o r d s ：l - c a r n i t i n e ；f a t - d e c r e a s i n g ；a n t i f a t i g u e ；h p l c ；t h es e r u m i n d e x ；c r o s se x p e r i m e r i t ；g c m s 天津科技大学硕士学位论文 1 1 肥胖与疲劳 1 前言 1 1 1 肥胖的起因与脂肪酸的消耗 近年来，肥胖病的发病率明显增加，尤其是一些经济发达的国家，肥胖 者剧增。即使在发展中国家，随着饮食条件的逐渐改变，肥胖患者也在不断 增多。肥胖症( a d i p o s i s ) 是指机体由于生理生化机能的改变而引起体内脂 肪沉积量过多，造成体重增加，导致机体发生一系列病理生理生化的病症。 肥胖通常可分为单纯性肥胖( s i m p l eo b e s i t y ) 与继发性肥胖( s e c o n d a r y o b e s i t y ) 两种。单纯性肥胖的内分泌系统正常，机体代谢基本正常。继发性 肥胖是由于内分泌或代谢异常引起的。临床所见的以单纯性为主，约占9 5 以上。 正常情况下，人体能量的摄入与消耗保持着相对的平衡，体重也保持相 对稳定。一旦平衡遭到破坏，摄入的能量多于能量的消耗，则多余的能量在 体内以脂肪的形式贮存起来，肥胖者的食物生热作用的能力低于正常人，与 其体内褐色脂肪的量不足或褐色脂肪功能障碍有关，因为褐色脂肪细胞的线 粒体能氧化局部贮存的脂肪，产生能量。但大部分肥胖患者系摄食过多、活 动量较少而造成肥胖。此外，肥胖有一定的遗传因素，往往父母肥胖，子女 亦容易发生肥胖。还有些肥胖是由于体内某些疾病或代谢紊乱所引起的，像 内分泌失调等都有可能造成继发性肥胖。 肥胖是一种全身性代谢疾病，除引起身体外观的改变外，过多的体脂不 仅可带来物理性的负荷，还是各种成人疾病的“培养箱”。据调查，肥胖人群 的平均寿命明显低于正常体重人群i lj 。肥胖可以引发高血脂、高血压、心肌 梗塞、糖尿病等疾病。近来的研究还发现，肥胖还能增大患癌的危险性。 肥胖者脂肪代谢异常。主要特征表现为血浆甘油三酯( t g ) ，总胆固醇 ( c h o ) 和游离脂肪酸( f f a ) 较正常人高。肥胖时，内源性t g 的合成大大增 加，这与肥胖者高胰岛素水平相关。高胰岛素促进了脂肪的合成；另一方面， t g 的降解速率降低也是其升高的原因之一。血浆中的f f a 有两个来源，其中 大部分来源于脂肪细胞中所贮存的甘油三酯的水解，还有一部分来源于富含 甘油三酯的酯蛋白。f f a 主要为肌肉组织和肝脏摄取、代谢，有些f f a 能被肝 脏完全氧化，有些f f a 则被氧化为酮体( 图1 卜1 ) ，酮体在肝外组织代谢并供 能，亦可为脑提供另一种燃料来源，即替代脑所需葡萄糖量的四分之三。且 酮体在肌肉中的活化较脂肪酸更快1 2 j 。还有些f f a 则再被脂肪细胞利用，重 新合成t g 。由于肥胖者脂肪的利用受到抑制，血中f f a 水平较正常者高，而 前言 酮体水平降低，肥胖患者体内脂肪组织中f f a 的释放及利用受到抑制。 ；氧化破+ ，k 织、 栅体( 肝) 图1 1 1 游离脂肪酸的来源与利用 肥胖者的另一个特征是存在高胰岛素和外周组织对胰岛素敏感性降低。 胰岛素对支链氨基酸( b r a n c h e d c h a i na m i n oa c i d ) 的降解作用减弱，造成 血浆支链氨基酸水平升高。同时肝脏对部分生糖氨基酸的摄取增多，糖元异 生增加，引起血和尿部分生糖氨基酸水平升高。一般认为，血浆支链氨基酸 主要在骨骼肌中代谢和转化，胰岛素通过促进骨骼肌细胞摄取支链氨基酸， 使血浆支链氨基酸水平降低。而肥胖者骨骼肌细胞胰岛素受体相对不足，对 胰岛素的敏感性，导致胰岛素对氨基酸的降解作用减弱。肥胖者体内脂肪合 成加强，能量过剩，使支链氨基酸和谷氨酸参与三羧酸循环代谢的速度下降， 而组氨酸和精氨酸转变为谷氨酸的代谢途径不变，会引起支链氨基酸和谷氨 酸水平升高，组氨酸和精氨酸含量下降【3 a 1 1 2 疲劳的起因与运动过程中的能量消耗 人类每日都要从摄入的食物中获得以维持生命与健康，保证生长和从事 劳动与运动所必需的各种营养索。劳动及运动与机体能量的储存、释放、转 移和利用过程密切相关，而能量代谢过程又与糖、脂肪、蛋白质这些营养素 有关。所以，各类能量物质的摄入及代谢产物，都会对从事劳动与运动过程 的有一定的影响。 疲劳( f a t i g u e ) 是一个涉及许多生理生化因素的综合性的生理过程，是人 体脑力或体力活动到一定阶段时必然出现的一种正常的生理现象，它既标志 着机体原有工作能力的暂时下降，又可能是机体发展到伤病状态的一个先兆。 1 9 8 2 年在第五届国际运动生化学术会议上，将疲劳定义为：机体生理过程不 能持续其机能的特定水平上和( 或) 不能维持预定的运动强度【4 1 口 产生疲劳的基本原因可概括为：( 1 ) 能源的消耗，肝糖原等过量消耗， 血糖下降。( 2 ) 运动代谢产物在体内积聚，乳酸和蛋白质分解物大量存留在 体内。( 3 ) 体内环境的变化，包括体液的酸碱平衡、离子分布、渗透压平衡 2 天津科技大学硕士学位论文 等的变化或破坏。( 4 ) 不能完全适应各种应激反应。短时间极限强度导致的 疲劳与a t p 、磷酸肌酸的大量消耗有关，肌肉中a t p 、磷酸肌酸含量显著下降， 乳酸浓度明显增加，肌肉p h 值降低，肌糖原含量减少，血液中的血糖和乳酸 的含量增加，大脑中a t p 、磷酸肌酸和y 一氨基丁酸含量明显下降；较长时间 进行中等劳动强度的工作不易引起明显的疲劳肌肉、血液和大脑的生化变 化很小，只有肌肉中糖原下降最明显，与糖和有氧代i 身f 有关的酶活性有所升 高；而长时间进行中等劳动强度工作导致明显疲劳时，肌肉中糖原含量极度 降低，乳酸中等程度增加，肌肉p h 降低，血液中出现低血糖，肝糖原含量减 少，大脑中a t p 和磷酸肌酸水平明显降低，y 一氨基丁酸水平增加，大脑和肌 肉中的酶活性降低。 因此，疲劳是防止肌体发生威胁生命的过度机能衰竭而产生的一种保护 性反应，它的产生提醒工作者应降低工作强度或终止运动以免肌体损伤。 如果机体进行短时间极限强度的运动或劳动( 如短跑、举重等) ，由于在 短时间内对能量的需要量极大，因此只有肌细胞内的磷酸原系统能够承担这 样的供能任务。这个系统是以储存在肌肉的高能磷酸化合物a t p 及磷酸肌酸 释放能量来使肌肉运动的。a t p 和磷酸肌酸通过裂解分子内的高能磷酸键释放 能量，因此输出功率极大，这样就能实现快速供能。随着肌细胞内的a t p 减 少，磷酸肌酸迅速将高能磷酸键转给a d p 使之转变为a t p 继续为肌细胞供能， 直到肌肉中磷酸肌酸的储备不能满足能量的需要时，供能停止。肌细胞内磷 酸原系统参与供能的比例随肌肉活动的强度增加而增加，对于极限强度运动， 大约能够连续供能6 8 s 左右。 如果剧烈的运动或强度极大的劳动时间超过8 s ，肌肉中磷酸肌酸基本上 被消耗尽。为了继续在合成a t p 以保持肌肉的活动能力，储存在肌肉中的糖 原便大量分解。由于这是机体处于剧烈的运动之中，尽管呼吸和吸氧循环加 快，但仍不能满足细胞对氧的需要，肌细胞处于高度的缺氧状态。所以此时 肌糖原是靠无氧酵解产生乳酸的代谢途径供能。这个供能系统从启动开始约 0 5 - l m i n 可达到最大速率，并可持续供能2 - 3 m i n ，超过3 m i n 后，糖酵解代 谢速率明显减慢，甚至停止。 人们在进行长时间强度较大的活动( 如拔草、行军、3 0 0 0 m 以上长距离 跑、1 5 0 0 m 以上游泳等) 时，随着肌肉活动时间的延长，肌细胞需要长时间不 问断的获得能量供应。如果运动速度较慢，劳动的强度也不大，经过机体对 心脏、脑的血流量的调整之后，细胞中氧基本上能够满足能量供应的需要。 此时机体主要通过氧化糖和脂肪酸产生的a t p 来获得能量。因此脂肪的储存 量可供长时间的活动。图1 卜2 反映了这个过程： 输 出 功 率 血d t m i a ) 图1 1 - 2 人体骨骼肌中能量供应生化的顺序和数量关系 5 】 从上面所述的各种活动的能量代谢特点可知，增加体内磷酸肌酸的储备 量以及磷酸肌酸与a t p 相互间的代谢能力，将会使极限强度的肌肉活动能力 提高。提高机体糖酵解的能力，减少乳酸在肌肉中的堆积将会使高强度的肌 肉活动时间延长。提高呼吸、循环系统功能，增加血红蛋白在血液中的含量， 对加速糖、脂肪的有氧分解十分有利。 1 1 3 肥胖、疲劳与健康饮食l b j 随着人们生活节奏的加快，人们生活水平的提高，膳食结构的改变，全 球肥胖人口数量迅速增多。有资料显示，美国肥胖人口已达总人口的5 5 ，并 且有继续增长的势头。在我国，据国家卫生部公布的资料显示，至2 0 0 0 年底， 全国肥胖人口已占城市总人口的3 5 以上，北京超过4 0 ，部分沿海城市高达 5 0 以上，基本相当于西方发达国家水平。更为重要的是随着医学科技的进步， 各种疾病的“解码”显示：肥胖至少与数十种疾病有关，如糖尿病、高血压、 心血管疾病等 ”。因而使人们逐渐意识到肥胖也是一种病。除此之外，在当 今社会经济的迅猛发展过程中，人们的工作压力大，精神长期处于紧张状态， 容易加剧疲劳，从而影响到人体内环境( m i l i e ui n t e r i e u r ) 的各系统、各 组织之间的平衡，使得在体内存在种种不适的亚健康状态的人群越来越庞大， 据统计，全国约有4 5 的人处于亚健康状态。不论是肥胖还是疲劳，都是长期 以来，影响人们健康，为人们所关注的个重要问题。因此，研究抗疲劳与 减肥的作用机理和开发功能性物质是保健食品研究领域的热门课题。 减肥是目前全世界生命科学领域普遍重视与要解决的问题，要研制减肥 食品应首先注意到减肥的原则就是要限制能量的摄入，增加其消耗，或两者 兼有之。就不能仅仅停留在高营养、高膳食纤维、低能量方面，还要加速脂 肪的动员，促进脂肪酸进入线粒体氧化分解，增加产热等方面的深入研究； 对于疲劳来说，各种各样的运动、劳动是引起机体疲劳的主要原因。任何形 4 天津科技人学硕士学位论文 式的运动都以能量的消耗为基础，所以了解能量供给过程，摄入充足的营养 物质并在体内得到充分的利用，是保障提高机体运动能力，不易疲劳的重要 条件。 在摄入体内的营养物质中，糖在人体内的个重要功能是作为燃料氧化， 为其他代谢过程提供能量供给生命活动的需要。i m o l 葡萄糖如果完全氧化可 产生2 6 9 2 k j 热能。体内糖氧化时所释放出的自由能大部分储存在a t p 的高能 磷酸键中，在以a t p 的形式参与各种生理活动以提供能量，只有小部分能量 直接以热的形式用以维持体温【8 j 。研究证明，当机体处于安静状态时脂肪是 主要供能物质，而劳动或运动时随着劳动及运动强度的增加和缺氧程度的提 高，糖供能比例大。当摄氧能力相同时，以糖作为氧化基质的脂肪氧化供能 可得到更大的输出功率，即表现为可承担更大的劳动及运动强度。但脂肪的 摄入量必须有一定限度，高脂肪饮食会使运动效率降低，运动的耐力衰减。 因此要提高运动耐力，抵制疲劳的发生，主要解决的问题不是增加机体的脂 肪储备而是如何提高利用脂肪的能力，这对于供氧充足的长时间运动或劳动， 增强脂肪分解代谢，将无疑会提高机体抗疲劳的能力。而在考虑蛋白质的供 给量时，机体热能需要量必须充分满足。如果热能供给不足，则摄入的蛋白 质就不能有效地被利用，甚至不能维持氮平衡状态。当机体摄入的氮少于体 内排出的氮，使机体的氮平衡出现负值时，在组织细胞蛋白质分解的同时， 就不能进行相应的合成，以维持组织细胞的更新。于是，机体就会出现蛋白 质缺乏症状，重者将出现水肿、肌肉萎缩、中枢神经系统功能紊乱、肝脏坏 死等，轻者也会使各种酶活力下降，使机体容易疲劳。因此我们在研究蛋白 质与运动( 劳动) 能力的关系时，不是将其作为能源物质，而是通过改变蛋 白质的生理活性提高机体在劳动或运动中的生理机能。所以对八体只有供给 充足的热量，才能发挥蛋白质应有的作用i 9 1 。 1 2 肉碱的化学结构及生物学特性 肉碱有3 种光学异构体，即l 一肉碱、d 一肉碱和消旋体肉碱，但只有l 一肉 碱在动物体内具有生物活性，为天然成分，并广泛存在于微生物、植物和动 物组织中；d 一肉碱和消旋体都是合成物质，不存在于生物系统中，并能抑制 l 一肉碱的利用，而且在大剂量的情况下对人和动物有害。其中d 一肉碱主要对 肉碱乙酰转移酶( c a t ) 和肉碱脂酰转移酶( p t c ) 有竞争性抑制作用，因此美国 f d a 于1 9 9 3 年禁止销售d 一肉碱和消旋型肉碱。 l 肉碱( l - c a r n i t i n e ) 又称肉毒碱，或称维生素b t ，化学名为l b 一羟 基一y 一三甲铵丁酸( p h y d r o x y y b u t y r o b e t a i n e ) ，分子式为 ( c h 。) 。n c h ：c i ( o h ) c h 。c o o h ，分子结构为： 5 前言 h ，c o ho h h ；c 7n 弋吒0 0 n 3 l 相对分子量为1 6 2 2 1 。是一种水溶性氨基酸，性能稳定，能耐2 0 0 。c 以上高 温，它的饱和键与极性宫能团有良好的溶水性和吸水性。 l 一肉碱是一种小分子量的类蛋白质分子，存在于机体的细胞中，在肌肉 中的含量尤为丰富，人体的肝、l 旨、脑是合成的主要部位，合成原料主要是 两种必需氨基酸赖氨酸和甲硫氨酸。各食物均含有不同量的l 一肉碱，通 常植物性食物中肉碱含量低，动物性食物中肉碱含量高。这是由于大多数植 物缺乏肉碱合成的前提物质赖氨酸和蛋氨酸的缘故。在动物性食品中， 肉类中含量最高，内脏次之，蛋类中极少。一般情况下，哺乳动物骨骼肌、 心肌和附睾中存在大量l 一肉碱。人体约有5 0 以上的肉碱来自于膳食，体内 肉碱9 0 存在于骨骼肌和心肌中。而植物性和动物性脂肪中组织均不合成 l 一肉碱。 动物体本身能在肝脏、肾脏中合成l _ 肉碱。赖氨酸和蛋氨酸是其前体物。 在分子中，赖氨酸作骨架、蛋氨酸提供甲基f 二者为1 ：3 ) ，在v c 、尼克酸、 v b 6 及二价铁参与下合成。赖氨酸通过甲基化合成肉碱，然而游离的赖氨酸不 能直接接收甲基，只有与蛋白质结合才能作为肉碱的前体物。因为三甲基赖 氨酸不能被重新结合进入体蛋白，它进入血液不是被排泄就是被进一步在l 肾 和肝脏内代谢和酶解产生肉碱。最后的合成途径是在肝脏中进行y 一三甲基丁内 脂的羟基化作用，增加了羟基，使包括脂肪酸在内的各种有机酸的羧基碳都 可以被酯化。因此肉碱的合成可以认为是一种“营救”赖氨酸降解的过程 1 2 , 1 3 】。 动物体内l 一肉碱的生物合成经过5 步反应，其中最后一步为限速反应， 严格限制在肝、肾组织中，肌肉中含量高，但肌肉中不能合成l 肉碱，要依 赖肝、肾的血液运输。l 广肉碱的合成过程可见表1 2 1 。 表1 2 il - 肉碱的合成步骤 l - 1 鸯3 碱的体内生物合成比较复杂，要求条件也较苛刻。如果蛋氨酸、赖 6 天津科技大学硕土学位论文 氨酸、v c 、尼克酸和v b 中任何一种不足都会产生合成障碍。哺乳动物骨骼肌、 心肌和附睾中存在大量l 一肉碱。体内肉碱的9 0 以上是存在于骨膈肌中。而 植物性和动物性脂肪中均不合l _ 肉碱。 哺乳动物l _ 肉碱来源广义上分为内源合成和外源摄入两种途径。内源合 成的l - 肉碱可直接被组织细胞吸收利用或转供其它组织细胞。外源摄入l _ 肉 碱在消化道中由小肠绒毛吸收，吸收率约为5 0 一8 0 。被吸收的l 肉碱约 5 0 在小肠细胞中乙酰化，以乙酰基形式或游离形式进入血液，然后被运送 到全身各组织器官。因细胞能主动吸收肉碱，细胞内的肉碱含量是细胞外液 的1 0 一1 0 0 倍。口服l 肉碱后，血浆、肌肉中含量显著上升。进入组织器官 的l - 肉碱便参与生理生化反应。仅很少量的l 肉碱在体内分解代谢。肉碱不 能被哺乳动物体内的菌降解，只能作为游离肉碱或短碳链的肉碱脂类，多以 乙酰肉碱形式，在乳中分泌或经肾脏随尿排出。大量l - 肉碱到达肾脏后又被 重吸收。不同品种动物其能力各异，草食动物比肉食动物重吸收能力强【1 4 】。 1 3l - 肉碱的生理功能及应用 1 3 1 促进线粒体长链脂肪酸的氧化及应用 生物体内十碳以上的长链脂肪酸，氧化供能时必须先在肌细胞浆中同辅 酶a ( c o a ) 在a t p 参与下活化生成脂酰c 。a ，然后再转入线粒体才能氧化分解。 但长链脂酰c o t 必须在l 一肉碱的参与下才能透过线粒体内膜进行氧化供能。 其作用机理是l 一肉碱的3 一羟基接受脂酰c 小的酰基而转入线粒体内膜，再由 肉碱脂酰基转移酶i i 催化，使肉碱与脂酰c 。a 分开，再重新形成脂肪酰c 0 a 。 后者在线粒体间质中进行不断的1 3 一氧化，生成的乙酰c o a 通过三羧酸循环分 解成h 。0 和c o 。，同时释放出能量。 脂肪酸的氧化部位在线粒体，长链脂酰c 。a 不能直接进入线粒体，但l 一 肉碱可以携带酰基进入线粒体从而完成脂肪酸的氧化供能。所以如果能维持 l 一肉碱适当浓度，可以完成长链脂酰基转运，从而促进脂肪酸代谢，消耗多 余的脂肪，达到减肥的目的。因此，l 一肉碱可作为比较理想的减肥物质，且 长期服用无副作用。 中老年人合成l 一肉碱能力的降低是导致心血管疾病的重要因素。心脏的 6 0 一8 0 能量来源于肉碱，l 一肉碱在分解脂肪、降低血脂的同时增加心肌能量， 对保护心脏具有理想的双重功效。目前已将l 一肉碱补充用于治疗心血管疾病、 高血脂症、肾脏病、糖尿病及脂肪肝。尤其是中老年人长期坚持补充l 一肉碱 对预防这些疾病功效显著i l ”。 婴幼儿自身生物合成肉碱的能力尚未发育完全，其体内合成肉碱的速度 仅为成人的2 0 ，仅靠母乳供应是不够的，加上婴幼儿发育较快，需要大量的 r u 禹 能量与脂肪，l 一肉碱需求量增加，缺乏外援性l 一肉碱可导致儿童血浆内物质 浓度严重降低，发育不良，易患肥胖症、肌肉乏力、感觉迟钝等，补充l 一肉 碱就易避免人生中第一个发胖时期( 刚出生到两岁) 。 1 3 2 抗疲劳作用及应用 机体为了供给运动所需要的大量能量，分解碳水化合物、脂肪和蛋白质。 碳水化合物的酵解产物乳酸，蛋白质的代谢产物氨类物质和脂肪分解的中间 产物脂肪酸、酮体大量存在血液和组织中，使机体产生疲劳感。l 一肉碱有促 进脂肪氧化供能、改变呼吸链酶的活性进而促进机体的有氧氧化供能作用。 有氧氧化占优势，则碳水化合物的酵解降低，所产生的乳酸就少；脂肪氧化 充分蛋自质的分解代谢减慢，产生的氨类、尿素就少。由于肌肉主要以脂肪 酸作为能量来源，当肌肉中肉碱缺乏时，长链脂肪酸不能充分作用，从而导 致肌纤维间脂质沉积。表现为肌肉中出现大量甘油三脂，同时体力下降易疲 劳；补充肉碱能促进脂肪氧化供能，缓解疲劳症状。可见肉碱具有抗疲劳作 用，同时由于肉碱能促进机体的能量供给，在抗疲劳功能性食品和运动医学 中有较好的应用前景。 l 一肉碱能提高病人的在练习中的耐受力，包括练习持续时间的延长、最 大氧吸收( v 0 ：) 、乳酸阈值( l t ) 、氧吸收闽值( v t ) ，口服l 一肉碱能提高8 0 的最大氧吸收时的肌肉的耐受力 1 6 】。还可以帮助机体在锻炼疲劳后迅速恢复， 有助于提高运动员的成绩。研究还发现：l 一肉碱的摄入决定肌肉产生的能量， 增加心肌和骨骼肌的能量供应，增加心肌收缩力和耐氧量，增加骨骼的肌力 和耐力；可以保持运动员竞技时的神经兴奋度，明显减少二氧化碳的产生和 血浆中的乳酸浓度；在马拉松长跑运动员中l 一肉碱多半是以脂酰l 一肉碱的形 式从尿中排出而消耗其在体内的储量而延长身体的恢复期，而在这个时候补 充一定量的l 一肉碱增加其血浆中l 一肉碱的量，能节约糖原的消耗，增加精力 和耐力，这一点也被证实内源性l 一肉碱不足以维持能量转化中的极度效应。 因此，补充l 一肉碱可以用来提高运动员的比赛成绩【i ”。 1 4 l 一肉碱的检测方法【1 8 i ( 1 ) 酶法测定法( d t n b 法) 【1 9 】 根据e 1 1 m a n 2 0 l 原理以5 ，5 - d i t h i o b i s ( 2 - n i t r o be n z o i ca c i d 二硫 一2 一硝基苯甲酸，简称d t n b ) 作为s h 巯基的定量试剂。试剂中的二硫键在d h 值为8 时能定量的分解与其共存的日目肪族巯基化合物，从而生成4 一硝基苯酚 化合物，它的离子呈黄色，在4 1 2 n m 处有强烈的吸收峰。而d t n b 本身在4 0 0 n m 以上j l 乎没有吸收峰。因此，在试样s h 基化合物的溶液中加入少量的d t n b ， 可以在4 1 2 n m 处测定生成物的浓度，求得试样中s h 的含量。反应原理式为： 天津科技大学硕士学位论文 e n z s h + d t n b e n z s t n b + t n b + h 据此原理，m a r q u i s 和f r i t z 于1 9 6 4 年建立了l 一肉碱的酶测定法，原理如下： u k f a c e t y l s c o a 十l - c a r n i t i n e ；= ：= a c e t y l l c a r n i t i n e + c o a s h ( 1 ) c o a s h + d t n b t n b 一+ c o a s n b + h + ( 2 ) 此外，用该法测定肉碱必须具备两个前提条件：首先必须有足够量的乙 酰辅酶a 参与反应( 1 ) ，其次两步反应中须加入恒定量的c a t 与d t n b 。 ( 2 ) 高效液相色谱法 d t n b 法易受样品中硫醇物质的影响，因此可采用高效液相色谱( h p l c ) 紫外检测法测定l 一肉碱的含量。正向柱和o d s c ，。反相柱相比，正向柱分离 不出肉碱，即肉碱峰与杂质峰重叠，而反向柱肉碱出峰时间较早( 3 m i n 以 内) ，且分离效果好【2 1 】。对于流动相的选择，流动相取双重蒸馏水1 9 0 0 m l ， 加入l o m l 磷酸，l m o l l n a o h 摇匀，调p h 值为2 4 ，再加2 0 0 m g b 7 离子 对试剂，1 0 4 0 m l 甲醇，分离效果好。波长的选择，根据文献参考，从4 0 0 n m 到2 0 0 n m ，选择全波长扫描，在2 2 5 n m 处有最大吸收峰【2 2 】。 1 5 本文的研究目的、内容及创新 1 5 1 研究现状和意义 在本世纪初，两位俄国科学家( g u l e w i t s c h 和k r i m b e r g ) 就从肉浸汁中发 现肉碱。但直至1 9 5 2 年美围伊利诺斯州大学的研究人员c a r t e r 等人才确证 了维生素b t 即为肉碱。早期的研究文献也有称肉碱为维生素b 。从1 9 5 3 年 开始，肉碱列在美国化学文摘中v i t a m i n b ，索引栏目下。1 9 5 9 年f r i t z 发现 肉碱能提高脂肪代谢速率( 称之p 一氧化) ，1 9 7 3 年e n g e l 报道首例肉碱缺陷症 荠开始用肉碱进行治疗。直至1 9 8 4 年才明确l 一肉碱是一种很重要的营养剂 2 3 l 。 l 一肉碱作为一种新型的功能性食品添加剂和药品已为世界各国普遍接 受，从各国的研究报道看，l 一肉碱的应用主要是作为功能性食品添加剂和饲 料添加剂，在作为治疗用药物的临床应用上也有广泛研究。作为功能性食品 添加剂，因l 一肉碱本身为人体内存在的天然物质，在人体能量代谢中有明确 的生理功能，所以它作为一种人体营养强化和补充物质已经被人们接受。l 一 肉碱的有关应用方面，主要是添加于婴儿用奶粉、运动员饮料以及减肥健美 营养食品中。 婴儿体内l 一肉碱生物合成能力较弱，不能满足其正常的代谢需要。必须 从外源摄取肉碱，加上婴儿生长发育较快，不断合成新组织，因此需要的l 一 肉碱的量也增加每曰给婴儿补充l 肉碱是必需的。l 一肉碱的生热作用对需 要保持足够的体温新生儿的存活很重要，因此，在完全胃肠外营养液中添加 l 一肉碱，既能改善脂肪酸氧化，也对供能、生热、生酮、改善代谢平衡、降 低血氨水平、有机酸分泌等方面有益。目前国内已有添加肉碱的母乳化奶粉 上市。 早在7 0 年代，就有d l 一肉碱用于治疗肥胖症的专利报道。由于体内l 一肉 碱缺乏，脂肪类代谢紊乱，一方面会造成肌肉供能不足，产生肌体疲劳及导 致相关的心血管疾病，另一方面还会造成脂类物质在肌纤维和肝脏中积聚产 生肥胖、脂肪肝等。运动不足的肥胖类型的人蓄积脂肪多，体内l 一肉碱生物 合成能力低下。加人l 一肉碱的运动员饮料可有效地将体内蓄积的脂肪转变成 能量，提高运动的持久力，也有防止肥胖的效果。据报道，以l 一肉碱为主成 分的降脂健美食品在美国和欧洲市场上十分受欢迎，产品畅销不衰，我国卫 生部也将l 一肉碱列入营养强化剂。广州等地也推出了用进口l 一肉碱配制的“康 丽亭”等营养品上市。 l 一肉碱作为新型功能性食品添加剂已经得到广泛应用，有相当大的市场 前景，而且作为饲料添加剂及临床用药，也有潜在的广阔市场。但目前l 一肉 碱还仅有瑞士、意大利、日本等少数国家能够生产，国内需求全靠进口，价 格昂贵( 3 0 0 0 元k g ) ，国内对该产品的研究开发甚少。数年前曾有合成法制 备卜肉碱的报道，但由于成本及安全性等方面原因，离产业化尚有距离，而 l 一肉碱的产业化、大量廉价供应，以及在食品、营养、饲料以及医药等领域 广泛应用，正是我们目前所要解决的问题。 l 一肉碱的生理功能表现在六个方面【2 4 j ：作为载体以脂酰的形式将长链 脂肪酸从线粒体膜外转运到它氧化的部位线粒体膜内，起到促进脂肪酸 b 氧化的作用；将乙酰c o a 从线粒体内转运到线粒体外的长链脂肪酸合成 的部位，使乙酰c o a 可用于脂肪酸和胆固醇的合成，起到调节线粒体内a c c o a c o a 的比率作用，有利于能量的代谢；将体内过量的酰基排出体内，消除 机体因酰基积累而造成的代谢毒性；还能促进乙酰乙酸的氧化，在酮体的降 解和利用中起作用；参加支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸等代谢产物的运 输，从而有利于这些氨基酸的正常代谢；肉碱对脂溶性维生素及c a 、p 的 吸收也有一定的促进作用。此外，l 一肉碱具有一定的抗疲劳作用，可通过增 加氨与尿素的结合，促进氨从尿中排出，解除氨的毒性；还能有效防止运动 后血液中乳酸浓度的升高，以降低高浓度乳酸引起的疲劳效应瞄j 。 l 肉碱和其衍生物能增强人体的免疫系统，提高人体的免疫力。大多数 动物有能力自己合成l 一肉碱，它的体内合成需要赖氨酸、甲硫氨酸、烟酸、 维生素c 、维生素b 。和铁的参与瞄1 。人体中的l 一肉碱合成主要在肝脏中进行。 肌肉中l 肉碱的含量虽然高，但是肌肉并不能合成l 一肉碱，而要依赖于肝肾 的合成以及血液输送。大量研究表明，老年人和婴儿易发生l 一肉碱缺乏症。 另外许多病症如心脏病、高血脂症、肾病、肝硬化、营养不良等的病人l 一肉 1 0 天津科技大学硕上学位论文 碱水平低下2 7 。正常人依靠体内合成和膳食来源，虽然能维持基础代谢所需 的l 一肉碱浓度，但很难达到最理想的水平。而体内l 一肉碱缺乏将造成机体脂 质代谢紊乱，影响能量供应，导致许多疾病，引起生长缓慢、抗应激能力降 低、繁殖力低下等【2 8 j 。 因此，许多专家相信，补充l 一肉碱与补充其它维生素及矿物质一样重要。 1 9 8 5 年芝加哥国际营养学会将l 一肉碱定为多用途营养剂，1 9 9 3 年美国食品及 药品管理局专家委员会确认l 一肉碱为g r a s ( 公认安全无毒) ，其原料及 制剂均被美国药典第2 2 、2 3 版收载。1 9 9 5 年1 0 月2 6 日，来自1 9 个国家的 百余位生化专家会聚美国纽约，相互交流了他们在l 一肉碱研究中所取得的成 果。与会专家一致认为，l 一肉碱是人体必需营养，具有重要的生化功能和临 床营养价值川。 1 5 2 研究内容 ( 1 ) l 一肉碱的提取与检测 应用酶法和高效液相色谱法两种方法检测l - 肉碱，选择出一种最合适的 方法； 采用不同提取液( 高氯酸、盐酸、水) 提取肉中的l 一肉碱，确定最佳提 取溶剂； 检测不同肉组织中( 猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉) l 一肉碱的含量，确定含 l 一肉碱最多的肉的品种。 ( 2 ) 动物实验 l 一肉碱是一种低分子、水溶性营养素，广泛存在于肉类食品中。为了验 证l 广肉碱在抗疲劳、参与脂肪代谢以及减肥中的作用，本试验通过利用羊肉 提取肉碱、化学合成肉碱和无肉碱添加饲养的几组小鼠的对比实验，对l - 肉 碱的抗疲劳与减肥功能性进行评价。 减肥常用的评价指标有体重、体脂、脂肪细胞数目及大小等。体重是个 直观的值，体脂含量则是评价是否肥胖及减肥功效如何的最确切指标。脂肪 在体内的主要功能是贮存能量和供给能量。作为体内能量的贮存形式来看， 脂肪的储存量比糖原要多得多。一个正常成人全身糖原的贮存量只有 3 0 0 4 0 0 9 ，但贮存的脂肪可有数公斤至十多公斤，甚至更多。而且1 克糖或 蛋白质完全氧化释放出4 1 千卡的能量，而1 克脂肪在体内完全氧化却可以 释放出9 3 千卡的能量，要比糖或蛋白质多一倍以上。机体的脂肪主要蓄积 在皮下，腹腔内及肠系膜上，将上述部位的脂肪剥离称重，作为机体的体脂 重量。将实验动物处死后，剥离出全身脂肪称重，体腊重与体重的比值是体 脂百分数。也可以只测动物生殖器周围脂重。 肥胖症患者血浆甘油三脂、胆固醇等水平增高。尤其是腹腔脂肪多者， 由于b 一肾上腺素能受体占优势，又对胰岛素的抗脂解作用敏感性下降，使该 部位的脂肪细胞水解增加导致产生更多的游离脂肪酸。因此，测定以上化学 成分在血浆中的含量变化可以间接评价肥胖程度。 正常成人的脂肪含量约占体重的i 0 2 0 ，在供氧充足时，脂肪是人体主 要的能量来源。要提高运动的耐力，抵制疲劳的发生，主要要解决的问题就 是如何提高利用脂肪的能力。对于短跑、短距离游泳等那些靠无氧供能的运 动，提高脂肪分解代谢能力的意义不是很大，而对于供氧充足的长时间运动 或劳动，增强脂肪分解代谢，充分动员脂肪供能无疑会提高机体抗疲劳的能 力。 本实验通过测定小鼠的体重和游泳时间及各种生化指标，来评估l 一肉碱 的减肥和抗疲劳功能。 ( 3 ) l 一肉碱功能性通过小鼠指标的验证 本文通过测定小鼠体重和游泳时间，从表观指标上验证了l 一肉碱的功 能性作用促进线粒体长链脂肪酸氧化，促进脂肪代谢，具有能使体重降 低的减肥功效，同时还有显著的抗疲劳的功能。 动物体内甘油三酯绝大部分分布在脂肪组织( 脂库) 中。实际上它是脂酸 的贮备形式，分子中的甘油是酯化脂酸的载体。动用时，在酶的催化下，水 解甘油三酯释放出脂酸经血循环运往各种组织中去。人体脂质含量一般占体 重的1 0 一2 0 ，其中大部分是贮存在脂肪组织( 脂库) 中的甘油三酯( 称为可变 脂或可动用脂) ，少部分是分布在生物膜中的磷脂、糖脂、胆固醇( 称为固定 脂或基本脂) 。生物膜脂约占体重的5 ，其数量基本恒定，不受营养等因素影 响，脂库是机体最主要的能源贮备，当人体的能量摄入大于消耗时，超出的 部分就会以脂肪形式贮存，造成组织增多导致肥胖。 l 一肉碱在体内具有调节机体内、特别是肌肉组织中长链脂肪酸的代谢作 用，通过促进其运输、氧化供能、以及改变呼吸链酶的活性，进而改善机体 的有氧氧化作用途径。肉碱是一种与动物体内脂肪酸代谢有关的化合物，由 于线粒体膜对酰基c o a 衍生物的不透过性，所以长链脂肪酸只有与l 一肉碱酯 化后才能进入线粒体内进行b 一氧化。组织内只有具备足够浓度的l 一肉碱， 长链脂肪酸的酯化与0 一氧化才能顺利进行，否则将严重破坏细胞的长链脂肪 酸的分解代谢，造成长链脂肪酸蓄积、导致肥胖。反之，l 一肉碱含量多，动 用长链脂肪酸供能，就会使碳水化合物的酵解降低，产生的乳酸少；蛋白质 的分解代