（食品科学专业论文）共轭亚油酸的生物转化和异构体分析.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 娥糍轹主】叻彳 肌2 胡辟细细 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌土学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后使用本授权书) 学位论文作者签名：当 吻鲜 签字日期：年月，二日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：i 韵嚣文澎 黼龇：呷镑孵，明影修 电话： 邮编： j 口口妒7 南昌大学博士学位论文 摘要 摘要 共轭亚油酸( c l a ) 是一组位置和几何异构体的十八碳共轭二烯酸的统称， 在自然界，c l a 主要存在于反刍动物的奶、肉及其制品的脂肪中，通常每克脂肪 中c l a 的含量为2 5 1 7 。7 r a g ，其异构体主要是c 9 ，f l l c l a 。体内外实验均表明 c 9 ，t l l c l a 有抗癌活性。通过化学合成或生物转化法可以大量制备c l a ，但化学 合成的c l a 异构体组成复杂，无法获得单一的c l a 异构体，生物转化法在亚油 酸异构酶的作用下，可以获得单一的c l a 异构体，如c 9 ，i 1 1 c l a 、t 1 0 ，c 1 2 一c l a 。 本文通过尿素包合法获得纯度较高的亚油酸，采用紫外光谱扫描和h p l c 方 法筛选到一株高产c l a 的乳酸菌，建立了c d m e k c 分析c i a 异构体的新方法， 通过f t i r 、g c m s 、n m r 确定了产物的组成，对乳酸菌生物转化c l a 的条件 进行了优化和放大，并对其亚油酸异构酶进行了初步研究，主要研究结果如下： 1 尿素、溶剂和脂肪酸配比是影响尿索包合法纯化玉米油中亚油酸的主要因 素，当混合脂肪酸：尿素：乙醇为1 ：3 ：6 ( w w v ) 时，回流1 5 r a i n ，包合2 h ，在 室温下，通过一次包合，亚油酸的纯度从4 4 4 8 提高到9 5 6 8 ，得率为7 2 4 1 。 2 紫外光谱扫描和h p l c 相结合的筛选方法具有快速、准确的优点。通过该 方法从3 3 株乳酸菌中筛选到l a c i d o p h i l u s ( c g m c c1 1 8 5 4 ) 、l c a s e is u b s p c a s e i r c g m c c1 5 7 4 ) 、l p l a n t a r u ml 1 和l h e l v e t i c u sl 7 共4 株乳酸菌能生物转化 c l a ，它们生物转化得到的c l a 均由c 9 ，t l l c l a 和t 9 ，t 1 1 c l a 两种异构体组成。 l h e l v e t i c u sl 7 在m r s 培养基上生成的c 9 ，t l l c l a 的量最高劬 o 0 5 ) 。因此，为节约时间，回流时间选择1 5 m i n 。 1 0 0 9 0 毒 越8 0 鞣 碰7 0 是 摧6 0 5 0 1 53 06 0 回流时问( m i n ) 1 2 0 1 0 0 90 孳 8 0 斛 稚 7 0 艇 是 6 0 崮 5 0 图2 - 3 回流时间对亚油酸纯度和得率的影响 f i g 2 - 3e f f e c t so ft h ec i r c u m f l u e n tt i m eo nt h ep u r i t ya n dy i e i do fl i n o l c i ca c i d 3 2 2 包合时间对亚油酸的影响 尿素包合时尿素与混合脂肪酸之间存在包合与解包合的动态平衡，为了除去 尽可能多的饱和和单不饱和脂肪酸就必须形成尽可能多的包合物，因此本实验研 究了在室温条件下，不同包合时间对亚油酸的影响。由图2 - 4 可见，随包合时间 增加，亚油酸纯度和得率均在小幅范围内波动，这可能是室温波动导致平衡发生 移动所致。包合时间对亚油酸纯度和得率的影响均无显著差异( p o 0 5 ) 。因此， 为节约时间，包合2 h 即可。 直昌盘堂监堂焦盐童簋三重亚油酸曲盔4 鱼 1 0 0 9 0 艺 划8 0 蒙 斑7 0 景 爿6 0 5 0 2461 22 4 包合时间( h ) 1 0 0 9 0 8 0 鐾 7 0 萋 6 0 目 5 0 图2 - 4 包合时问对亚油酸纯度和得率的影响 f i g 2 - 4 e f f e c t so ft h ea d d u c t i v et i m eo nt h ep u r i t ya n dy i e l do fl i n o l e i ca c i d 3 2 3 包合温度对亚油酸的影响 由于脂肪酸包合物的形成是一个放热过程，降低温度时反应向生成包合物的 方向进行，不饱和脂肪酸在低温下才能形成包合物，理论上要包合原料中尽可能 多的油酸，就必需在较低的温度下进行包合，因此本实验研究了包台温度对死油 酸的影响。从图2 - 5 可见，随温度降低亚油酸纯度有所升高，只有包合温度1 5 。c 和2 5 对亚油酸纯度的影响有显著差异( 口 0 0 1 ) ；亚油酸得率在温度低于 5 。c 时迅速下降，一1 5 对亚油酸得率的影响有显著差异( p o 0 1 ) 。由于低温需增 加设备和能耗，因此实际应用时在室温下包合经济可行。 亩昌盘堂簋堂焦：| 金童 簋三童垩油酸曲盔圣 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 5 0 1 55 42 5 包台温度( ) 1 0 0 9 0 苎 8 0 瓣 、咤 7 0 斑 景 6 0 爿 5 0 图2 5 包合温度对亚油酸纯度和得率的影响 f i g 2 - 5 e f f e c t so ft h ea d d u c t i v et e m p e r a t u r eo nt h ep u r i t ya n dy i e l do fl i n o l e i ca c i d 3 2 4 尿素、乙醇和脂肪酸配比对亚油酸的影响 尿素溶解于溶剂，遇到直链脂肪酸时，尿素分子以氢键结合的方式形成中空 的六方晶系，可选择性包合脂肪酸，尿素用量不同，选择性就不同，同时，溶剂 是包合物形成的必要条件，因此必需将两者结合在一起研究其对亚油酸的影响。 本实验研究了在室温条件下，不同的尿素与乙醇比对亚油酸的影响，尿素乙醇为 o 7 5 和1 0 时，对亚油酸纯度的影响无显著差异( p 0 0 5 ) ，其余各组的影响均 有显著差异( p 0 0 1 ) ，其余各组的影响均有显著差异( p 0 0 5 ) ，其余各组的影响均有显著差异( p 0 0 5 ) ，脂肪酸尿素为o 5 和1 o 时， 对亚油酸的得率的影响无显著差异( 口 0 0 5 ) ( 图2 7 ) 。为获得高纯度的亚油酸， 应选择0 2 5 或0 3 3 的脂肪酸尿素，选择o 3 3 的脂肪酸，尿素比0 2 5 的更经济。 因此，选择脂肪酸尿素为0 3 3 。当混合脂肪酸：尿素：乙醇为1 ：3 ：6 ( w w v ) 8v越蠕鞋景爿 直置走芏擅：k 堂鱼诠童 筻三童亚油酸曲剑盔 时，亚油酸的纯度为9 5 6 8 ，得率为7 2 4 1 。 0 2 50 3 30 50 7 5 尿素乙醇( w w ) f i 面蕊甄歪二i 面诱再司 1 0 0 8 0 一 琶 6 0 斛 瞳 4 0 澎 要 2 0 茸 o 图2 - 6 尿素，乙醇对亚油酸纯度和得率的影响 f i g 2 - 6 e f f e c t so ft h er a t i oo fu r e aa n de t h a n o lo nt h ep u r i t ya n dy i e l do fl i n o l e i ca c i d 1 0 0 9 0 誊 划8 0 蒙 键7 0 是 篝6 0 5 0 o 2 50 3 3 o 5l 脂肪酸尿素( w w ) 叵量画亟匿j 面甄 1 0 0 9 0 一 兰 8 0 甜 难 7 0 氍 震 6 0 营 5 0 图2 - 7 脂肪酸，尿素对亚油酸纯度和得率的影响 f i g 2 - 7 e f f e c t so ft h er a t i oo ff a t t ya c i da n du r e ao nt h ep u r i t ya n dy i e l do fl i n o l e i ca c i d 3 2 5 包合次数 包合次数增加，亚油酸的纯度有少许的提高，但是其得率却显著降低( 图2 8 ) ， 且包合次数增加，既量浪费时间，又增加生产成本，因此包合一次即可。 加 0 |6v趟蒙甾舞茸 直昌盘芏监堂位途塞星三重垩池醒曲划垂 1 0 0 笔9 0 莲8 0 基7 0 嚣6 0 善5 0 4 0 im 12 包台次数( 次) 口亚油酸纯度亚油酸得率i 图2 8 包台次数对亚油酸纯度和得率的影响 f i g 2 - 8 e f f e c t so ft h et i m e so fa d d u c t i o no i lt h ep u r i t ya n dy i e l do fl i n o l e i ca c i d 4 小结 4 1 以玉米油作为制备亚油酸的原料，玉米油的脂肪酸中不含亚麻酸，经分 析其脂肪酸组成为：亚油酸4 4 4 8 ，油酸3 3 0 9 ，棕榈酸1 9 6 1 ，硬脂酸2 8 2 ； 4 2 尿素包合法纯化亚油酸的条件为：回流时间( 1 5 1 2 0 m i n ) 、包合时间 ( 2 - 2 4 h ) 对亚油酸纯度和得率的影响均无显著差异( p o 0 5 ) 。因此，选择回流 1 5 m i n ，包台2 h ； 4 3 包合温度一1 5 对亚油酸得率的影响有显著差异( p 0 0 1 ) ；包合温度对亚 油酸纯度的影响均无显著差异( p 0 0 1 ) ；由于低温需增加设备和能耗，因此实 际应用时在室温下包合经济可行： 4 4 尿素、溶剂和脂肪酸配比是影响亚油酸纯度和得率的主要因素，当尿素 乙醇为1 2 ( w v ) 时，亚油酸的纯度和得率均较高，当混合脂肪酸，尿素乙醇为 1 3 6 ( w w v ) 时，在室温下，通过一次尿素包合就能使亚油酸的纯度从4 4 4 8 提高到9 5 6 8 ，得率为7 2 4 1 。 直昌盘堂谴：匕堂焦造童 簋三童亡基扼堡迪酸里b 酸茸的蕴选 第三章产共轭亚油酸乳酸菌的筛选 1 引言 c l a 生物转化法反应条件温和，异构体组成较单一【6 6 ，7 2 - 7 3 1 ，并且与天然的 c l a 组成相似9 4 1 ，因而有利于产品的开发应用。虽然有些厌氧菌如瘤胃细菌在 生物氢化过程中会形成c l a 9 8 1 ，但由于该菌需要严格厌氧的环境，需要相应的设 备条件，给生产带来了一些困难。近年来发现一些乳酸菌也能形成c l a 6 ”9 1 ，这 些细菌易于培养，又具有g r a s ( g e n e r a l l yr e g a r d e da ss a f e ) 的身份，常常作为益 生菌用于人或动物，作为生产菌有着更好的潜力和安全性。已报道的一些菌株如 路氏乳杆菌等己申报了专利【吲，因此为了开发共轭亚油酸产品，就必需筛选具有 自主知识产权的菌株。国外常采用g c 、，i 方法来筛选共轭亚油酸生物转化的 菌株 6 8 , 7 2 】，该方法可靠但较费时，国内常采用紫外光谱扫描法来筛选生物合成共 轭亚油酸的菌株【6 3 埘】，该方法快速但结果不可靠。本研究建立了紫外光谱扫描和 高效液相色谱联合筛选共轭亚油酸生物转化乳酸菌的方法，该法快速、准确。从 本实验室保藏分离的3 3 株乳酸菌中筛选到一株生物转化共轭亚油酸能力较强的 乳酸菌。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌种 l d e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s ( c g m c c1 1 4 8 0 ) 、s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u s s u b s pt h e r m o p h i l u s ( c g m c c1 1 8 5 5 ) 、la c i d o p h i l u s ( c g m c c1 1 8 5 4 ) 、l c a s e i s u b s pc a s e if c g m c c1 5 7 4 ) ( 以上4 株乳酸菌是从中国普通微生物菌种保藏管理 中心购买) 、lc a s e il 1 4 、l 1 a c t i ss u b s pc r e m o r i sl 1 5 、l ，l a c t i ss u b s p 1 a c t i sl 1 6 、 l 1 a c t i sl 1 7 、l p l a n t a r u ml 1 、l p l a n t a r u ml 2 、l p l a n t a r u ml 3 、l m a l t a r o m i c u s 亩昌盔兰监生焦迨室箍三童芒基堑亚迪酸里l 醒鹫鳆缝逞 l 4 、l m a l t a r o m i c u sl 5 、lm a l t a r o m i c u sl 6 、l h e l v e 石c u s l 7 、l h e l v e “c u sl 8 、 三h e l v e t i c u sl 9 、l h e l v e t i c u sl i o 、l h e l v e t i c u sl l l 、三d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s l 1 2 、l d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u sl 1 3 、l v a c c i n o s t e r c u sl 1 8 、l v a c c i n o s t e r c u s l 1 9 、l v a c c i n o s t e r c u sl 2 0 、l v a c c i n o s t e r c u sl 2 1 、lv a c c i n o s t e r c u sl 2 2 、l v a c c i n o s t e r c u sl 2 3 、l a m y l o p h i l u sl 2 4 、l a m y l o p h i l u sl 2 5 、la m y l o p h i l u sl 2 6 、 l f r u c t o s u sl 2 7 、l b r e v i sl 2 8 、l ，b r e v i sl 2 9 ( 以上2 9 株菌是本实验室分离鉴定 的乳酸菌) 。 2 1 2 培养基【1 0 9 】 m r s 培养基：蛋白胨1 0 0 克、牛肉提取物1 0 0 克、酵母提取物5 0 克、葡 萄糖5 0 克、乙酸钠5 0 克、柠檬酸二胺2 0 克、t w e e n8 01 0 克、磷酸氢二钾2 0 克、硫酸镁0 2 克、硫酸锰o 0 5 克、碳酸钙2 0 0 克、蒸馏水1 , 0 升、p h 6 8 ，1 2 1 。c 灭菌2 0 m i n 。 脱脂牛奶培养基：脱脂奶粉1 0 0 0 克、蒸馏水1 0 升，1 0 5 c 灭菌1 5 r a i n 。 2 1 3 仪器 紫外可见分光光度计( 4 3 0 0p r o ) 高效液相色谱仪( $ 1 1 2 1 ) 电子精密天平( p b 6 0 2 e ) 电子分析天平( e r 一1 8 2 a ) 手提式压力蒸汽灭菌器( s g 4 6 2 8 0 s ) 洁净工作台 冰箱( b c d 2 4 1 ) p h 计( p b l 0 ) 电热恒温培养箱( b h 4 2 0 b s ) a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h ，s w e d e n s y k n m 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 a & d c o m p a n y , 、j a p a n 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 上海淀山湖净化设备厂 广东容声 北京赛多利斯 上海跃进医疗器械厂 直昌盍堂蝗堂焦迨塞差三童彦基趣堡油酸雯l 醮萱盟短选 电热恒温鼓风干燥箱( 1 0 1 ) 旋涡混合器 台式离心机( t g l l 6 b ) 超纯水制备器 超声波脱气机( r k 5 1 0 s ) 移液器 上海跃进医疗器械厂 上海跃进医疗器械厂 上海安亭科学仪器厂 m i l l p o r e b a n d e f i n ，g e r m a n y f i n l a n dl a b s y s t e m 2 1 4 试剂 亚油酸( 自制，纯度 9 5 ) 、亚油酸标品( s i g m a ) 、c l a 混合样品( s i g m a ) 、 c 9 , c l l c l a 、c 9 , t c l a 和t 9 , t l l c l a ( m a t r e y a ，p l e a s a n tg a p ，p a ，u s a ) 、蛋 白胨( 生物试剂) 、牛肉提取物( 生物试剂) 、酵母提取物( 生物试剂) 、葡萄糖、 乙酸钠、柠檬酸二胺、t w e e n8 0 、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙、脱脂 奶粉、氯仿、甲醇、正己烷( h p l c 纯) 、7 , n ( h p l c 纯) ，未注明试剂均为国 产分析纯。 2 2 方法 2 2 ，1 菌种的活化 将所有保藏菌种分别接入m r s 培养基中培养，连续传代3 次。 2 2 2 培养方法 将配好的培养基分装于2 0 m l 试管中，每管4 6 m lm r s 培养基或4 6 m l 脱 脂牛奶培养基，灭菌后，冷却，在无菌间分别接入待筛选菌株的菌种，每管接种 2 0 叭l ，同时加入2 0 叽l 1 2 5 ( v v ) 的亚油酸溶液，混匀，在恒温培养箱中静 置培养2 4 h ，l c a s e is u b s p c a s e i ( c g m c c1 5 7 4 ) 、l c a s e il 1 4 、l 1 a c t i ss u b s p c r e m o r i sl 1 5 、l 1 a c t i ss u b s p 1 a c t i sl 1 6 、l p l a n t a r u ml 1 、l p l a n t a r u ml 2 、l p l a n t a r u ml 3 、l b r e v i sl 2 8 、lb r e v i sl 2 9 在3 0 。c 培养，其余均在3 7 。c 培养。 壶昌盘坐熊堂僮堡塞箍三望芒基攫堡擅醒弛醒重鲍压堂 2 2 3 亚油酸溶液的配制 用移液器分别量取1 2 5 m l 亚油酸和1 5 m l t w e e n8 0 加入到9 7 2 5 m l 超纯水 中，经旋涡混合器混合均匀，即得1 2 5 ( v v ) 的亚油酸溶液。4 c 冷藏备用， 保质期3 天。 2 2 4 培养基中脂肪酸的提取 添加亚油酸的培养基接种培养后，每管分别加入2 5 m l 萃取溶剂，经旋涡混 合器混合均匀，在台式高速离心机上5 , 0 0 0 x g 离心5 m i n ，吸出下层溶液，重复 萃取一次，将两次的萃取液合并，并定容至5 0 m l ，即得培养基中脂肪酸的提取 物。 2 2 5c l a 回收率试验 以待筛选的一株乳酸菌为研究样本，按2 2 2 方法培养三份，其中一份作本 底，另两份分别加入已知量的标品，按2 2 4 方法提取后，平行测定，根据加入 量与检出量计算回收率，重复进样测定考察精密度。 2 2 6 萃取溶剂的配制 将氯仿和甲醇按2 ：1 ( v v ) 混匀【“o 】，密闭存放。 2 2 7 紫外光谱扫描 培养基中脂肪酸的萃取液在1 9 0 3 0 0 n m 处进行紫外光谱扫描，以不接种培养 基的萃取液做参比，超过量程的样品经稀释后再测，扫描步长0 1 n m ，扫描速度 2 0 4 n m m i n 。 2 2 8i - i p l c 分析 色谱柱：c h r o m s p h e r 5l i p i d s ( 4 6n l l ni d x 2 5 0m m ，粒度5 u m ，c h r o m p a c k ) ， 实验前先用流动相平衡色谱柱3 0 m i n ，至基线平稳后进样。 流动相：正己烷：乙腈= 9 9 9 ：0 1 ，按比例混匀，经超声波脱气后备用【8 6 】。 体积流量：1 0 m l m i n 进样量：2 0 m l ， 直邑盘堂蠖堂焦监塞 一苤三童亡基垣垩迪酸丑酸茴曲篮选 检测波长：2 3 3 n m 数据处理：中文色谱工作站 2 2 9 c 9 ，t l l c l a 和t 9 ，t l l - c l a 标准溶液的配制 每毫克c 9 ，t 1 1 c l a 和r 9 ，t l l c l a 分别用l m l 无水乙醇溶解混匀，现配现用。 2 2 1 0c l a 标准曲线的绘制 c l a 紫外吸收的标准曲线：取c 9 ，t l l c l a 的标准溶液，配制成0 1 4 0 b g m l 的浓度梯度，用正己烷作参比，在2 3 3 n m 处测定其吸光值，以吸光值为纵坐标， c 9 ，n 1 一c l a 的浓度为横坐标绘制标准曲线，对吸光值和浓度进行一元回归分析。 c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，t l l c l a 和t 9 ，t l l c l a 的h p l c 标准曲线：c 9 ，c l l c l a 、 c 9 ，t 1 1 c l a 和t 9 ，t 1 1 c l a 的标准溶液，分别取不同的进样量，以峰面积为横坐标， c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，t l l - c l a 和t 9 ，t l l c l a 的进样量为纵坐标，绘制c 9 ，c l l c l a 、 c 9 ，t l l c l a 和f 9 ，t l l c l a 标准曲线，对峰面积和进样量进行一元线性回归分析。 2 2 1 1h p l c 方法的确认 线性范围：c 9 ，c 1 1 c l a 、c 9 ，t l l c l a 和t 9 ，t l l ，c l a 标准溶液，分别取不同的 进样量，以峰面积为横坐标，c 9 ，c 1 1 一c l a 、c 9 ，t l l c l a 和t 9 ，t l l c l a 标准溶液的 进样量为纵坐标，绘制c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，t l l c l a 和f 9 ，t 1 1 c l a 标准曲线，对峰面 积和进样量进行一元线性回归分析。 检出限( l o d ) ：信噪比( s n ) 为3 。 精密度：以相同的进样量连续进行5 次分析，计算其峰面积和保留时间的相 对标准偏差( r s d ) 。 2 2 1 2 共轭亚油酸生物转化乳酸菌的筛选 将发酵后培养基中脂肪酸的萃取液经紫外光谱扫描，若2 3 3 n m 处有共轭双键 的特征吸收峰，则再次进行h p l c 分析，测定c l a 的组成和产量，从中筛选出 高产菌株。 2 2 1 3 数据处理 亩昌点堂盥土芏焦监塞蓥三童亡基趣垩油酸丑酸茴鲍篮凿 每组实验重复3 次，采用单因素完全随机设计，通过s p s s i o 0 ( s p s si n c ) 进行方差分析，用d u n c a n s 法进行多重比较，显著水平取a = o 0 5 。 3 结果与讨论， 3 1 紫外光谱扫描分析c l a c l a 含有共轭双键，在2 3 3 n m 处有特征吸收峰，c j c 一、咖一、t , t - c l a 的最大 吸收波长稍有不同，随反式双键的增加，异构体的最大吸收值会紫移。乳酸菌生 物转化亚油酸得到的c l a 主要由c 9 ，t l l t 9 ，c 1 1 c l a 组成，因此本实验选用 c 9 , t l l c l a 进行紫外光谱扫描分析。c 9 ，t l l c l a 的最大吸收波长是2 3 3 n m ( 图 3 1 ) ，分别测定不同浓度的c 9 ，t l l c l a 在2 3 3 n m 处的吸光值，以c 9 j l l c l a 的 浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线( 图3 2 ) 。对吸光值( y ) 和浓度 ( x ) 进行一元回归分析，线性回归方程为y = 0 1 0 1 5 x + 0 0 0 1 2 ，舻= o 9 9 6 5 ，线 性范围为0 1 4 叭g m l 。 图3 - 1c 9 ，t l l c l a 标品的紫外扫描图 f i g 3 - 1 u l t r a v i o l e tw a v cs c a no fs t a n d a r dc 9 ，t l l c l a 直昌盍堂攫堂焦监塞 差三童芒基蜒垩油酸乳酸萱鲍篮选 1 - 6 1 2 s 蚓p 8 景 督 0 4 o o 5 c l a 浓度( t lg m 1 ) 图3 - 2c 9 ，t l l c l a 的紫外吸收标准曲线 f i g 3 - 2 u l t r a v i o l e ta b s o r b a n c ec h i v eo fs t a n d a r dc 9 ，t l l c l a 3 2h p l c 分析c l a h p l c 具有分离度高，定性定量准确的优点。c l a 异构体组成复杂，通常选 用专用的色谱柱来分析。采用流动相正己烷：乙腈= 9 9 9 ：0 1 ，在c h r o m s p h e r5 l i p i d s 色谱柱上实现了c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，t l l c l a 和f 9 ，f 1 1 一c l a 的完全分离( 图 3 3 ) 。 时间：1 1 ：1 9 ：3 0 电平：9 5 1 图3 - 3c 9 ，c 1 1 c l a 、c 9 ，t 1 1 c l a 和f 9 ，t 1 1 c l a 的h p l c 图谱 3 9 直昌盎堂谴堂焦搀塞釜三室主基堑堡渔酸至l 鳇簪鲤压遣 ( 1 ，t 9 ，t l l - c l a ，2 ，c 9 ，t l l c l a ，3 ，c 9 ，c l l - c l a ) f i g 3 - 3 h p l c c h r o m a t o g r a m o f c 9 ，c 1 1 1 - c l a , c 9 ，t l l c l aa n d t 9 ，t l l - c l a ( 1 ，t 9 , t 1 1 c l a ，2 c 9 ，t i l c l a ，3 ，c 9 ，c l l c l a ) c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，t l l c l a 和9 ，t l l c l a 的标准溶液，分别取不同的进样量， 以峰面积为横坐标，c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，t l l c l a 和t 9 ，t 1 1 c l a 的进样量为纵坐标， 绘制c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，t l l c l a 和t 9 ，t l l c l a 标准曲线，对峰面积( x ) 和进样量 ( y ) 进行一元回归分析。c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，t l l c l a 和f 9 ，t 1 1 c l a 的检出限，峰 面积和保留时间的相对标准偏差如表3 1 。结果表明，h p l c 方法可用于c l a 异 构体的初步定性和定量分析。 表3 - 1h p l c 分析c l a 异构体的线性回归方程、线性范围、检出限和相对标准偏差 t a b l e3 - 1l i n e a re q u a t i o n ，l i n e a rr a n g e , l i m i t so fd e t e c t i o na n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no fc l a i s o m e r sa n a l y z e db yh p l c 4c 9 , c l l - c l a 、c 9 , t l l c l a 和r 9 ，f 1 1 一c l a 的浓度为1 0 m g m l ，n = 5 3 3c l a 回收率试验 有研究表明不同培养基对生物转化c l a 有影响，l i n ( 1 9 9 9 ) 1 6 1 】对6 株乳酸 菌的研究发现，6 株菌在脱脂牛奶培养基上均能转化亚油酸得到c l a ，而在m r s 培养基上不产c l a ，l i n ( 2 0 0 0 ) 6 2 对6 株乳酸菌的研究还发现，向脱脂牛奶培 养基中添加乳糖和果糖可以提高c l a 的产率。j i a n g ( 1 9 9 8 ) 【5 8 】发现丙酸菌在乳 酸钠培养基上生成的c l a 很少，而在脱脂牛奶培养基和m r s 培养基上生成的 直昌盍堂墟土芏焦逭塞簋三重芒基墅变地酸丑酸苴的箍选 c l a 较多。因此，在筛选生物转化c l a 菌株时，必须考虑到培养基对筛选结果 的影响。乳酸菌常用的培养基有m r s 和脱脂牛奶培养基，为能从乳酸菌中筛选 到生物转化c l a 的菌株，减少培养基对菌株筛选的影响，本研究选用m r s 和脱 脂牛奶培养基同时来筛选生物转化c l a 的乳酸菌。 为了准确测定发酵后培养基中c l a 的组成和含量，必须建立可靠的提取方 法。考虑到本研究使用了两种培养基，而有时不同的培养基会影响产品的提取， 因而首先进行了c l a 回收试验。结果发现这两种培养基中添加的低浓度和高浓 度的异构体都有很好的回收率( 表3 - 2 ) ( 表3 3 ) ，回收率大于9 9 4 。m r s 培养 基和脱脂牛奶培养基中c 9 ，c 1 1 c l a 、c 9 ，t l l c l a 和t 9 , t 1 1 c l a 三种异构体的回 收率没有显著差异( p 0 0 5 ) ，且在这两种培养基间三种c l a 异构体的回收率也 没有显著差异( p o 0 5 ) ，因此采用氯仿和甲醇按2 ：1 ( v v ) 的萃取溶剂提取2 次可以很好的满足本研究的需要。研究还发现采用待处理样品1 2 体积的萃取溶 剂提取1 次，回收率达9 5 ，因此实际工作中也可根据研究的需要选择提取次数。 表3 - 2m r s 培养基中c l a 异构体的回收结果 t a b l e3 - 2r e s u l t s o fr e c o v e r yd e t e c t i o no f c l a i s o m e r s i n m r sc u l t u r e m e d i u m 直昌态堂按雯僮监窑蓥三童亡基题堑迪酸乳酸萱曲碰韭 表3 - 3 脱脂牛奶培养基中c l a 异构体的回收结果 t a b l e3 - 3 r e s u l t s o f r e c o v e r y d e t e c t i o no f c l a i s o m e r s i ns k i m m i l k c u l t u r e m e d i u m 3 4 生物转化c l a 乳酸菌的筛选 本实验室从土壤、泡菜、酸面团和水果蔬菜中分离鉴定了多株乳酸菌，并从 中国普通微生物菌种保藏管理中心购得一些乳酸菌，研究中主要以这些乳酸菌作 为研究材料。添加亚油酸的培养基经接种培养后，提取出发酵物中的脂肪酸，样 品进行紫外光谱扫描，若在2 3 3 n m 处无吸收峰，则该样品中无c l a ，相对应的 乳酸菌没有生物转化c l a 的活性。若在2 3 3 n m 处有吸收峰( 图3 4 ) ，则测定其 在2 3 3 n m 处的吸光值，计算出样品中c l a 的浓度( 表3 - 4 ) ，同时进行h t l c 分 析，测定c l a 异构体的组成和含量( 表3 - 5 ) 。 l h e l v e t i c u sl 1 0 等一些菌株的样品紫外扫描时在2 3 3 n m 有吸收峰，而h p l c 分析却发现其样品中并没有c l a ，而是一些未知物，这是由于微生物代谢过程十 分复杂，在培养过程中生成了一些在2 3 3 n m 处有吸收峰的其他物质，而非c l a ， 这也是紫外吸收测得的c l a 浓度比h p l c 测得的普遍都高的原因，因此单纯用 紫外光谱扫描筛选菌株往往会出现假阳性，选到一些没有生物转化c l a 能力的 菌株。 直昌左堂盟堂焦逾童蓥三童亡基趣垩迪酸乳酸茧鲍篮选 、l 九 i d 量日姜 n ! 臻蠹一陌 、 r弋 薅j 善芬 、o 卜 j d ：5 0 0 、 、 hl !1 ， x o i o o o ： 一撼i ； ：2 0扭搏0 一-。i 甜l，0 ： i f ho 弛! 黼。；# 菇2 8 h 班一一一“* ”3 0 口 ： 。1 陆1 图3 4 样品的紫外光谱扫描图 f i g 3 - 4 u l t r a v m e tw a v es c a no fas a m p l e 图3 - 5 样品的t t p l c 图谱 ( 1 ，t 9 ，t l l c l a ，2 ，c 9 ，t l l c l a ) f i g 3 - 5h p l cc h r o m a t o g r a mo fas a m p l e ( 1 ，t 9 ，t l l 。c l a ，2 ，c 9 ，t l l - c l a ) 直昌盔兰盟坐焦监塞蓥三童芒基巍垩地酸呈l 酸萤艘嘘垂 表3 - 4 紫外扫描法分析乳酸菌生物转化生成c l a 的结果 t a b l e3 - 4y i e l d so fc l ai s o m e r sb i o s y n t h e s i z e db yl a c t i ca c i db a c t e r i aa n a l y z e db yu vs c a n h p l c 能将样品中的c l a 与其他物质分开，因此能准确测定样品中的c l a 量。h p l c 还能将样品中的主要c l a 异构体分开( 图3 5 ) ，可初步确定样品中 c l a 异构体的组成，因此i - i p l c 的结果更准确。通过紫外光谱扫描进行初筛，排 除一些不能生物转化c l a 的菌株，再通过h p l c 进行复筛，排除一些紫外扫描 的假阳性结果，同时测定c l a 异构体的组成和含量，确保筛选结果准确。本研 究通过紫外光谱扫描和h p l c ，从3 3 株乳酸菌中分离到4 株能生物转化c l a 的 菌株( 表3 5 ) ，它们生物转化得到的c l a 均由c 9 , t l l 和t 9 ，t l l 两种异构体组成。 直墨友堂墁堂僮量皇差三童彦基趣垩油酸乳酸苴曲篮垂 由于c 9 ，f 1 1 c l a 具有很强的抗癌活性，有很好的应用前景，因此本研究把生成 c 9 ，t l l c l a 的量作为筛选菌株的指标。l h e l v e t i c u sl 7 在m r s 培养基上生成的 c 9 ，t 1 1 c l a 的量最高，且与其他三株乳酸菌生成的量有显著差别( p 0 0 5 ) n = 3 4 株能生物转化c l a 的乳酸菌在m r s 培养基和脱脂牛奶培养基上生成 c 9 ，t l l c l a 的量有所不同，l a c i d o p h i l u s ( c g m c c l 1 8 5 4 ) 和厶p l a n t a r u m l l 两株 菌在不同培养基上的c 9 ，t 1 1 c l a 的产量相差不多，lh e l v e t i c u sl 7 在m r s 培养 基上比脱脂牛奶培养基上生成的c 9 , t l l ，c l a 的量要高近2 倍，l c a s e is u b s p c a s e i ( c g m c c1 s 7 4 ) 在脱脂牛奶培养基上比m r s 培养基上生成c 9 ，t 1 1 c l a 的量要高2 倍多，这些都表明培养基的组成对乳酸菌生物转化c l a 有较大的影响。 本研究筛选到的能生物转化生成c l a 的4 株乳酸菌来自4 个不同的种，尚 不清楚c l a 的生物转化与细菌种属有无关联和规律。因此必须进行广泛的筛选， 才有可能得到高产特定c l a 异构体的菌株，而紫外光谱扫描和h p l c 相结合的 筛选方法具有快速、准确的优点，特别适合大范围的筛选。 直昌盔堂谴芏焦诠塞噩三童芒基堑垩油醒呈l 酸苴曲箍选 4 小结 4 1c l a 在2 3 3 n m 处有特征吸收峰，c 9 ，t 1 1 c l a 标品在2 3 3 n m 处的紫外吸收 线性回归方程为y = 0 1 0 1 5 x4 - 0 0 0 1 2 ，萨= 0 9 9 6 5 ，线性范围为0 - 1 4 0 z g m l ； 4 2 在c h r o m s p h e r5l i p i d s 色谱柱上采用流动相正己烷：乙腈= 9 9 9 ：0 1 ， 实现了c 9 ，c l l - c l a 、c 9 ，t l l - c l a 和t 9 ，t l l c l a 三种异构体的完全分离。 c 9 ，c l l c l a 、c 9 ，n 1 一c l a 和f 9 ，t l l c l a 标品的线性回归方程分别为y = 3 8 9 7 4 x 一 0 0 2 7 6 ，y = 3 8 5 9 8 x 一0 0 1 8 5 ，y = 3 9 1 4 x 一0 0 2 2 1 ，线性范围均为o 5 2 0 叩g ， 检出限( s 肘= 3 ) 均为0 1 , u g ，保留时间的相对标准偏差均为0 6 ，峰面积的相对 标准偏差均小于5 o 。因此，h p l c 方法可用于c l a 异构体的初步定性和定量 分析； 4 _ 3 氯仿和甲醇按2 ：1 ( 玑，v ) 配成萃取溶剂，按待处理样品等体积的萃取溶 剂分两次萃取，在m r s 培养基和脱脂牛奶培养基中都有很好的回收率，回收率 大于9 9 4 。两种培养基中c 9 ，c 1 1 c l a 、c 9 ，t 1 1 c l a 和t 9 ，t 1 1 c l a 三种异构体 的回收率没有显著差异( p o 0 5 ) ，且在这两种培养基问三种异构体的回收率也 无显著差异( p 0 0 5 ) 。采用待处理样品1 2 体积的萃取溶剂提取1 次，回收率 达9 5 ： 4 4 紫外光谱扫描具有简便快速的优点，通过紫外光谱扫描进行初筛，可以 除去不产c l a 的菌株，再通过h p l c 复筛，排除紫外扫描时的些假阳性结果， 同时测定c l a 异构体的组成和含量，筛选结果准确可靠。因此，紫外光谱扫描 和h p l c 相结合的筛选方法具有快速、准确的优点，特别适合大范围的筛选； 4 5 从3 3 株乳酸菌中筛选到l a c i d o p h i l u sf c g m c c1 1 8 5 4 ) 、l c a s e is u b s p c a s e i ( c g m c c1 5 7 4 ) 、l p l a n t a r u ml 1 和l h e l v e t i c u sl 7 共4 株能生物转化产生 c l a 的乳酸菌，转化得到的c l a 由c 9 ，t l l c l a 和t 9 ，t 1 1 c l a 两种异构体组成。 l h e l v e t i c u sl 7 在m r s 培养基上生成的c 9 ，t l l c l a 的量最高如 0 0 5 ) 。培养基 对乳酸菌生物转化有影响。 直昌盍堂盟堂焦迨童星四童壁盔电动鱼螫盆蚯尘坠显趋佳直选曲班塞 第四章胶束电动色谱分析c l a 异构体方法的研究 1 引言 c l a 是指一组位置和几何异构体的十八碳共轭二烯酸，至少含有1 6 种异构 体。现已发现一些异构体具有特定的生理活性，而且提出了异构体特异性的观点， 因而建立快速、准确的异构体分析技术，是进行c l a 生理活性研究和特定异构 体生产的必需条件。 g c 是目前常用的分析方法之一，为了使尽可能多的c l a 异构体分离，需使 用长的极性毛细管色谱柱( c p s i l8 8 ，1 0 0 m x 0 2 5 m mi d x o 撕m ，c h r o m p a c k i n c ，r a r i t a n ，n j ，u s a ) ，每个样品的分析时间超过5 0 m i n ，尽管如此，其中的 一些异构体仍然不能完全分离【8 8 】。此外，g c 分析时，样品需进行甲酯化，甲酯 化既费时，又会使顺反异构体转变成反，反异构体，造成分析结果不准确 8 1 】。另 一种目前常用的分析方法是h