自由基清除剂及其加工技术.ppt

功能性食品,食品营养与工程学院,第六章自由基清除剂及其加工技术,了解自由基的概念和对人体的危害掌握几种常见自由基清除剂的结构和生理功能了解国内外自由基清除剂的种类及作用机理掌握几种常见自由基清除剂制备的方法和要点,第一节自由基清除剂种类和作用机理,一、自由基的概念及其对人体的影响1定义-自由基是指任何包含一个或多个未成对电子并能独立存在的原子或基团。1832年德国化学家Baron和Friedrich发现化学反应中有一小群原子，并未把自己的单个原子放出去，而是与别的分子结合。当时化学家把这种原子叫做“radicals”，源于拉丁文“radix”,意思是“aroot”,表示他们根植在其他分子中。,2种类-包括氢自由基（H）、超氧阴离子自由基（O2-）、羟自由基（OH）、烷氧基（R）、氢过氧基（HO2-）、单线态氧（1O2，属于活性氧，是普通氧3O2的激发态）。过氧化氢（H2O2）是活性氧，有高反应性，可促进自由基生成，称自由基关联物质。,超氧阴离子自由基（O2-）,羟自由基（OH）,3氧的损伤氧分子轨道有两个未成对电子，很易转变为自由基或活性氧。活性氧自由基含量过多，可能产生毒性。4氧化应激生物体内氧化与抗氧化失去平衡。氧化应激原因A营养不良造成膳食抗氧化剂耗竭；B活性氧自由基产生过多。在大多数疾病中，氧化应激是一种续发性原因，所以抗氧化预防显得十分重要。,羟基和超氧自由基,5自由基的利弊利：体内物质和能量的转化都必须有自由基的参与。如，氨基酸的氧化；前列腺素的合成；线粒体内营养成分的氧化磷酸化；吞噬细胞杀灭细菌。自由基处于产生与清除的动态平衡弊：破坏细胞结构；引发脂质过氧化；干扰人体正常代谢活动；引发疾病；加速人体衰老。,DNA受到自由基损伤,蛋白质受到自由基氧化,6自由基的来源（1）环境污染水、空气、农药残留（2）化学物质抽烟、食物添加剂、亚硝胺、化妆品（3）体内自行产生运动、暴饮暴食、喝酒（4）烹饪过程（5）紫外线（6）X光,7自由基引起的疾病（举例）心脏病老年痴呆症帕金森病肿瘤,心脏病,心脏病（heartdisease）是心脏疾病的总称，包括风湿性心脏病、先天性心脏病、高血压性心脏病、冠心病、心肌炎等各种心脏病。加拿大研究人员20日发表报告说，全球大约35%的心脏病发作与油炸食品、盐渍零食和肉类有关。这再次表明，食用垃圾食品和动物脂肪能诱发心脏病。,老年痴呆症,老年痴呆症(Alzheimersdisease,AD)是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。、生活方式是导致该病的原因之一。如吸烟酗酒、不合理饮食、缺乏锻炼、与社会交流少。,帕金森病,帕金森病（Parkinsonsdisease）又称震颤麻痹，巴金森氏症或柏金逊症。该病是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，多在60岁以后发病。主要表现为患者动作缓慢，手脚或身体的其它部分的震颤，身体失去了柔软性，变得僵硬。最早系统描述该病的是英国的内科医生詹母帕金森，当时还不知道该病应该归入哪一类疾病，称该病为“震颤麻痹”。,二、自由基清除剂的种类和作用机理1自由基清除剂：能清除体内自由基或能阻断自由基参与氧化反应的物质。,2自由基清除剂的分类非酶类清除剂抗氧化剂（VE、VC、胡萝卜素、还原型谷胱甘肽）。酶类清除剂抗氧化酶（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶）。,（一）抗氧化酶能清除活性氧的酶统称为抗氧化酶。如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等。O2-O2H2O2-H2O2过氧化脂LOOHLOH醇,（二）非酶类清除剂1抗氧化剂：食品和药物中的抗氧化成分；2自由基清除剂：能清除自由基实现抗氧化作用的物质；3抗氧化剂作用机理：一是降低活泼自由基中间体的浓度，从而降低自由基链反应传播阶段的速率；二是抑制自由基引发剂的产生，从而达到清除自由基的作用。,4自由基清除剂与抗氧化剂的三种关系（1）抗氧化剂即为自由基清除剂氧化变质包括自由基连锁反应的各个阶段（2）抗氧化剂不一定是自由基清除剂有些抗氧化剂通过抑制自由基引发剂（如某些金属元素）的产生起作用（3）自由基清除剂不一定是抗氧化剂有些系统可能并未进行氧化作用,5自由基清除剂应用注意事项（1）自由基清除剂只有在足够浓度时才起作用；（2）清除剂只有在产生自由基的位置附近才能起作用；（3）清除剂与自由基反应后本身会成为新自由基，这个新自由基的毒性应小于原来的才能起防护作用。,第二节黄酮类化合物,黄酮类化合物是优良的活性氧清除剂和脂质抗氧化剂，它是广泛存在于自然界的一大类化合物，多具有艳丽的色泽，是许多中草药中主要活性成分之一。,一、黄酮类化合物的结构及生理功能（一）黄酮类化合物的结构基本母核：2-苯基色原酮类化合物；黄酮、黄酮醇，人体每天从食物中摄取可达1g；二氢黄酮、二氢黄酮醇类、异黄酮、二氢异黄酮、双黄酮类、查尔酮类、橙酮类、黄烷醇类、花青素、新黄酮类。,（二）黄酮类化合物的生理功能1清除自由基机理：与超氧阴离子反应阻止自由基反应的引发，与铁离子络合阻止羟基自由基的生成，与脂质过氧化基反应阻止脂质过氧化过程。,2调节免疫功能增强巨噬细胞吞噬能力和自然杀伤细胞活性；增加抗体产量，调节体液免疫功能和细胞免疫功能；通过血脑屏障吸收活性自由基，起抗衰老作用。,3保护心血管系统能影响血管的脆性和渗透性，改善血液循环状态，增加冠脉流量；选择性地与血管壁上的血栓结合，起抗血栓形成作用；防治血管老化和脑血管供血不足作用；,4抗癌作用致癌物(苯、苯并芘、亚硝基化合物)，是由惰性物经生物转化成的高活性物质，能破坏细胞结构，引发疾病，转化中产生一些自由基中间物，进一步形成活性很强的羟基自由基和单线态氧，引发癌症。黄酮类化合物可以作为寻找有效抗癌活性物质。,5抗炎作用黄酮类化合物具有抗病原微生物、抗炎症、抗感染作用。据研究，黄酮类化合物的抗炎作用可能与前列腺素生物合成过程中的脂氧化酶受到抑制有关。,6保护肝脏作用能促进组织再生，修复内脏器官的病变组损伤。临床上用以治疗急、慢性肝炎，肝硬化以及多种肝损伤等。,7调节内分泌功能国外流行病因学研究证明，东方人的乳腺癌、结肠癌和大肠癌的发病率远低于西方人，其重要原因是东方人的食物中含有大量的植物雌激素。,植物雌激素,植物雌激素主要有3类：异黄酮类、木酚素类和香豆素类，均含在植物及其种籽里。植物雌激素的分子结构与哺乳动物雌激素结构相似，是一类具有类似动物雌激素生物活性的植物成分，可以起到模拟、干扰、双向调节内分泌水平的生理化作用。它们对激素相关疾病有广泛作用，尤其对乳腺癌、前列腺癌、绝经期综合征、心血管病和骨质疏松有一定的预防作用。,8抗菌及抗病毒作用木犀草素、黄芩甘、黄芩素均有一定程度的抗菌作用。,9解痉作用解除平滑肌痉挛（抽搐）作用，如异甘草素、黄豆苷原。,10其他作用缓解高血压患者的头痛-大豆苷、葛根素；止咳、祛痰；抑制酪氨酸酶活性，减少皮肤黑色素生；成，吸收紫外线，消除黄褐斑。,二、黄酮类化合物的制备工艺黄酮类在植物中以游离黄酮和黄酮苷两种形式存在，溶解度差别较大，提取溶剂不同有水提法、醇提法、混合溶液提法、碱提酸沉淀法、超声提取法、超临界萃取法等。其分离的方法有沉淀法、层析法等。,（一）原料1豆类：大豆等;2水果类：山楂、葡萄柚、蔷薇果、柑桔、柠檬、红桔、樱桃、李;,葡萄柚,蔷薇果,3蔬菜类：花茎甘蓝、洋葱、番茄;,甘蓝,4中草药类：杜仲、黄芩、红花、金银花、菊花、甘草、陈皮、射干、地锦、淫羊藿、蒲黄等;,杜仲,黄芩,金银花,甘草,射干,射干,地锦,淫羊藿,蒲黄,5其他：沙棘、茶叶、葡萄酒、蜂蜜、啤酒、咖啡等。,沙棘,（二）减压蒸馏法黄酮类化合物在水中有一定溶解度，易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯等有机溶剂。用热水浸提出多糖、脂类及黄酮类化合物等可溶性成分，再用有机物溶剂进一步提纯。,减压蒸馏法制备黄酮类化合物工艺流程,原料破碎热水提取过滤收集滤液醇提静置弃沉淀减压浓缩浸膏,NaOH水溶液,淀粉、果胶、蛋白质,（三）树脂柱纯化法离子交换树脂是一种不溶性高分子物质，对溶液中的离子具有选择吸附能力;选择适宜的树脂，极性相近的黄酮类被吸附在树脂柱内，得到富集、纯化，然后用洗脱剂洗脱出来。,树脂柱纯化法制备黄酮类化合物工艺,原料破碎石油醚回流提取过滤水浸泡滤渣过滤乙醇提取过滤滤液回收乙醇黄酮粗提液上树脂柱水洗乙醇洗脱减压浓缩黄酮精制液喷雾干燥成品,？,脱脂,？,去除色素等水溶性成份,大孔树脂吸附法,大孔树脂吸附分离技术是以采用特殊的吸附剂从混合液中有选择地吸附其中的有效成分，除去无效成分的一种提取精制的新工艺。近年来，大孔吸附树脂法已广泛地应用于中药有效成分的分离与精制。有报道研究发现，用大孔树脂吸附法可分离黄酮，其中HZ-841大孔吸附树脂是一种大孔弱极性吸附剂，其应用是借助范德华力，从极性溶剂中吸附非极性的有机物。目前，该技术已在国内广泛用于纯化苷类、黄酮类、生物碱类成分。,喷雾干燥,应用于物料干燥的一种方法。于干燥室中将稀料经雾化后，在与热空气的接触中，水分迅速汽化，即得到干燥产品。该法能直接使溶液、乳浊液干燥成粉状或颗粒状制品，可省去蒸发、粉碎等工序。,（四）碱提取酸沉淀法黄酮苷类不溶于酸性水，易溶于碱性水;采用碱液提取，再在提取液中加酸，黄酮苷类即可沉淀析出。简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷的提取。,碱提取酸沉淀法,原料混匀煮沸调酸度抽滤取残渣水煎抽滤合并滤液调酸度抽滤水洗干燥重结晶成品,碱液提取,碱提物、水提物,使黄酮苷沉淀,Ca(OH)2,水提取,HCl,（五）超声波提取破坏植物细胞壁，使细胞内有效成分大量溶于有机溶剂，提高提取效率。,超声波提取原理,在容器中加入提取溶媒（水、乙醇或其他有机溶剂等），将原料根据需要粉碎或切成颗粒状，放入提取溶媒中；容器的外壁连接换能器振子或将振子密封于不锈钢盒中投入容器中；开启超声波发生器，振子向提取溶媒中发出超声波，超声波在提取溶媒中产生的空化效应和机械作用一方面可有效地破碎原料的细胞壁，使有效成分呈游离状态并溶入提取溶媒中，另一方面可加速提取溶媒的分子运动，使得提取溶媒和药材中的有效成分快速接触，相互溶合、混合。,（六）超临界CO2提取在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界流体萃取过程是由萃取和分离组合而成的。,研究酶法与溶剂提取相结合提取罗汉果中黄酮类化合物的工艺条件；通过正交试验找出纤维素酶法及溶剂提取的最佳工艺条件。,例酶解-溶剂法提取罗汉果中黄酮类物质,罗汉果的果实和叶含有罗汉果三萜皂苷，还含有大量的果糖、黄酮类化合物、十多种人体必需氨基酸、脂肪酸、维生素C、微量元素等。酶法提取：根据植物药材细胞壁的构成，利用酶反应所具有的高度专一性等特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁的结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶于溶剂中，达到提取细胞内有效成分的目的的提取方法。,提取工艺流程罗汉果粉碎、过目一定量的原料加溶剂酶解过滤一次提取物浓缩乙醇沉淀石油醚萃取乙酸乙酯萃取罗汉果黄酮类物质,除去多糖、蛋白质等,除去脂溶性色素等,对酶解温度、酶解时间、酶的浓度及pH等影响因素进行四因素三水平的正交试验。,纤维酶酶解条件的正交因素表,酶解温度影响最大。各影响因素的作用强度依次为：ACDB。即酶解温度pH酶解时间酶的浓度,提取物的紫外光谱分析,在250nm、320nm处均有吸收峰，在黄酮类化合物紫外吸收范围内，所得的产物为罗汉果黄酮类化合物。该方法的提取率要比一般的提取方法的提取率高。,传统的提取方法，温度高，收率低，成本高，消耗大量的溶剂，会造成对环境的污染。酶制剂具有专一性、特异性，在常温、常压条件下就能起催化作用，能有效地提高植物药中的有效成分的含量，减少污染物的排放，能真正实现“绿色中药工业”。,三、黄酮类化合物的应用黄酮类化合物的两种利用方式1植物提取液直接制取功能食品。2提取液经浓缩、分离纯化、干燥，制取高纯度的黄酮化合物，用于食品抗氧化剂和制造功能食品。,（一）在饮料中的应用1水提取的黄酮类化合物葛根黄酮功能饮料、桑叶汁饮料等。2黄酮的植物提取液经精制后的产品，添加入果汁中，再调配。3黄酮的植物提取液与奶粉混合，接种发酵,（二）在焙烤食品中的应用面包、桃酥等。,（三）在小吃食品中的应用冰淇淋、绿豆羹、黑米粉、营养糊等。,（四）在其他食品中的应用奶粉、水果和蔬菜、坚果、土豆粉和土豆片、饮料、风味物质、糖果制品、猪油、植物油等。,第三节茶多酚,茶多酚是茶叶中酚类及其衍生物的总称，又称茶鞣质、茶单宁。茶多酚在茶鲜叶中含量一般为干物质的1020%。,一、茶多酚的结构及其生理功能（一）茶多酚的结构儿茶素类、黄酮、黄酮醇、花青素、酚酸、缩酚酸。儿茶素类化合物，占茶多酚总量70%。,（二）茶多酚的生理功能1清除自由基、增强机体免疫力茶多酚可广泛地消除体内的自由基，且所具有的羟基越多，抗氧化能力越大。当L-表没食子儿茶素没食子酸酯浓度为0.006mg/ml，对超氧阴离子消除率达98%；当浓度为0.1mg/ml，对羟自由基消除率达99.9%。,2抗衰老作用茶多酚能提高GSH-Px和SOD活性，减低细胞的脂质过氧化物，延缓肌脂褐素形成，起抗衰老延寿作用。,3抗辐射作用茶多酚具有抗放射性损伤的效果。,4抗癌作用茶多酚能抑制致癌基因和人体DNA的共价结合，从而降低了诱变和致癌活性。,5消炎、抑菌及抗病毒作用没食子儿茶素和没食子酸酯有抑制伤寒、副伤寒、霍乱和痢疾的作用，只要浓度达到510mg/mL，就有抑菌作用。,6维持正常血管功能茶多酚能保持人体微血管的正常坚韧性和通透性，对于微血管脆弱的糖尿病患者，可以恢复其正常生理功能，有利于糖尿病的治疗。,7防龋齿作用茶多酚具有杀死龋齿细菌，抑制葡聚糖聚合酶活性的作用，使葡萄糖不能在牙表明聚合，病原菌便无法在牙表明着床，龋齿形成便中断。,茶多酚是茶叶中酚类及其衍生物的总称。从茶叶中提取茶多酚，并加以纯化，可广泛用于医疗、保健、日用化工及食品等领域。,二、茶多酚的制备工艺,（一）沉淀萃取法提取水溶液将茶多酚浸提出来；利用茶多酚能与Bi2+、Ca2+、Hg2+、Sb3+等金属离子产生络合沉淀，将茶多酚从含茶多酚的水浸提液中分离出来；用酸转溶，最后用乙酸乙酯抽提。,沉淀萃取法提取茶多酚工艺流程,原料预处理浸提压滤沉淀转溶萃取有机相浓缩干燥成品,沸水冲泡,Ca2+沉淀,稀盐酸或磷酸,乙酸乙酯,提高浸出率,（二）溶剂萃取法利用茶多酚及其杂质在不同溶剂中溶解度的不同，分别用溶剂去杂或抽提而得到茶多酚粗制品。,溶剂萃取法提取茶多酚工艺流程,原料预处理浸提压滤浓缩转溶萃取真空干燥成品,乙醇,氯仿萃取，除去色素、咖啡碱等杂质,水相，用乙酸乙酯萃取,（三）粗制品的纯化将茶多酚粗制品溶于水，用乙醚萃取，乙醚层减压回收，干燥即得较纯茶多酚；水层用乙酸乙酯反复萃取，除去水层，收集乙酸乙酯层；将乙酸乙酯溶液层减压低温浓缩，干燥，得茶多酚初级氧化聚合物。,茶多酚的纯化工艺流程,茶多酚粗制品溶于水乙醚萃取乙醚层水层减压回收乙酸乙酯萃取干燥减压低温浓缩茶多酚真空干燥茶多酚初级氧化聚合物,（一）在饮料中的应用茶叶软饮料、发酵酒饮料等。茶叶软饮料是一种以茶叶为主要原料，不含酒精的饮料，茶叶经沸水萃取后，可不加调料，直接过滤杀菌后制成罐装茶水，或分别加入香精、CO2、中草药制成多味饮料、碳酸饮料、保健型饮料等。茶多酚添加量为250mg/mL。,三、茶多酚在功能食品中的应用,（二）在小吃食品中的应用冷冻制品（雪糕、冰淇淋）；糖果（硬糖、奶糖、水果糖、口香糖）。,（三）在糕点食品中的应用用于糕点，如月饼、饼干、蛋糕等，加入茶多酚不仅可保持其原有的风味，防腐败，延长保鲜期，防止食品退色，抑制和杀灭细菌，提高食品卫生标准，延长食品的销售寿命。另外，还可使甜味“酸尾”消失，味感甘爽。添加量：茶多酚150200mg/mg食品。,（四）在茶膳中的应用以茶当菜-龙井虾仁、毛峰熏鸭、绿雪鳊鱼、鸡丝碧螺春。茶叶食品-茶叶挂面、茶叶汤面、茶叶馒头、茶叶紫菜浇饭、芥末海鲜汤、茶末烤马铃薯、茶末豆腐、茶末肉制品。,四、茶多酚的使用限量,根据我国食品添加剂使用卫生标准（GB2760-2011）规定，用于复合调味料和植物蛋白饮料时最大使用限量为0.1g/kg；用于油炸面制品、即食谷物、方便米面制品时最大使用限量为0.2g/kg用于肉制品(除腌腊肉制品)、水产品时最大使用限量为0.3g/kg；用于基本不含水的脂肪和油时最大使用限量为0.4g/kg；用于蛋白型固体饮料时最大使用限量为0.8g/kg。备注以油脂中儿茶素计,第四节超氧化物歧化酶,1969年Mccord和Fridivich首次从牛血红细胞中发现并分离出超氧化物歧化酶。超氧化物歧化酶可以专一清除超氧自由基（O2-）。,超氧物歧化酶(SuperoxideDismutase简称SOD)是一种新型酶制剂,它在生物界的分布极广,几乎从人到细胞,从动物到植物,都有它的存在。医学界研究发现，SOD对各种疾病均有一定的疗效,尤其治疗类风湿关节炎、红斑痕疮,皮肌炎等均有明显效果。此外,在防辐射,防衰老,抗肿瘤等方面也已进入临床。,一、超氧化物歧化酶的基本特性及生理功能,（一）超氧化物歧化酶的组成、分类和性质1超氧化物歧化酶的组成和分类Cu,Zn-SOD，绿色；Mn-SOD，紫色；Fe-SOD，黄褐色。,2超氧化物歧化酶的主要理化特性等电点pH46，偏酸性，酸性蛋白；对热、pH和蛋白水解酶的稳定性好。,（二）超氧化物歧化酶的物化特性和生理功能1延缓由于自由基侵害引起的衰老现象人之所以会衰老，老化迹象一点一滴出观，如色素沉淀、体力衰退、是因为体内产生氧化作用，所谓氧化作用就类似于生锈反应，抗氧化剂的补充有助于降低氧化的速度，减慢衰老的脚步。自由基引起机体衰老的机制：生物大分子的交联聚合和脂褐素积累；器官组织细胞的死亡和癌变；免疫力降低。,2治疗由自由基损伤而诱发的疾病SOD已被用于治疗因O2-所引起的各种疾病，如关节炎和风湿性关节炎、自身免疫性疾病（如进行性硬结、红斑狼疮）、组织缺血重灌流损伤、老年退化性疾病等。,3消除肌肉疲劳过多的自由基在体内残存，就犹如毒素蓄积体内一样，会让人：容易疲劳、厌倦、注意力不集中、常常昏昏沉沉、打哈欠。在军事、体育和救灾等超负荷大运动量过程中，机体中部分组织细胞会出现暂时性缺血及重灌流现象，引起缺血后重灌流损伤，加上大量乳酸的作用，导致了肌肉的疲劳与损伤。肌肉注射SOD可有效地解除疲劳与损伤。,4提高人体的抵抗力提高人体对自由基侵害而诱发疾病的抵抗力。提高人体对自由基诱发因子损害的抵抗力。,（一）原料1动物：牛血、猪血、马血、兔血、蛋黄、鸭血、猪肝、牛乳等；,二、超氧化物歧化酶的制备工艺,2植物：刺梨、大蒜、小白菜、饭豆等；,刺梨,饭豆,3微生物：酵母菌。,（二）沉淀法制备超氧化物歧化酶原理1SOD热稳定性好，温度低于80，短时间热处理酶活力损失不大，一般杂蛋白在高于55易变性沉淀。2酶蛋白在等电点时，溶液中的静电荷为零，酶蛋白的溶解度最小而沉淀下来。,3在超氧化物歧化酶粗酶溶液中加入一些弱极性有机溶剂（丙酮），改变溶液的介电常数，使不同种类的蛋白质的溶解度产生不同程度的下降，把超氧化物歧化酶和其他的杂蛋白分开。,沉淀法制备超氧化物歧化酶工艺流程,原料清洗破碎浸提热变性高速冷冻离心调整pH高速冷冻离心加丙酮沉淀高速冷冻离心溶解沉淀透析冷冻干燥成品,SOD热稳定性好，使杂蛋白沉淀,去掉热不稳定的杂质蛋白,pH3.5,沉淀杂蛋白；SOD等电点46,沉淀为部分杂质蛋白,1%丙酮使杂蛋白沉淀；上清液中加入丙酮使SOD沉淀,透析（dialysis）：通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。,（三）离子交换层析法离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行。SOD等电点在46之间，pH7.0时带负电，能被阴离子交换剂吸附，根据离子交换剂对蛋白质结合力差异，用具有一定离子强度流动相进行洗脱，就可和其他杂蛋白分开。经透析，冷冻干燥。,离子交换层析法制备SOD,采取血清加入抗凝剂低温离心除血红蛋白丙酮沉淀SOD透析纤维素柱上DEAE洗脱收集活性部分透析冷冻干燥成品,柠檬酸钠,分离出红细胞,乙醇-氯仿使之沉淀,（四）盐析法和金属螯合亲和层析法盐析（盐溶）盐的浓度增高到一定数值时，水活度降低；蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏；引起蛋白质分子间相互聚集从溶液中析出。一定浓度范围的盐浓度(如1%25%饱和度硫酸铵)，使部分杂质呈“盐析”(沉淀)状态。有效成分呈“盐溶”(溶解)状态。离心分离得上清液，选择一定浓度范围的盐浓度(如25%60%饱和度的盐溶液)，使SOD呈盐析状态，另一部分杂质呈盐溶状态，离心收集的沉淀为初步分离制备的SOD。,亲和层析把对SOD具有识别能力的配体Cu2+以共价键的方式固化到含有活化基团基质如壳聚糖上，然后装入层析柱。SOD粗酶液通过该柱量，由于静电引力，结构互补效应等作用使其被吸附，而无亲和力或非特异吸附的物质被起始缓冲液洗涤出来。,盐析法和金属螯合亲和层析法制备SOD,原料清洗破碎浸提第一次盐析离心第二次盐析离心透析上柱洗脱透析冷冻干燥成品,SOD盐溶；杂蛋白盐析,55%饱和度的硫酸铵,上清液为SOD,SOD盐析；杂蛋白盐溶,95%饱和度的硫酸铵,沉淀为SOD,（五）酵母发酵法将酵母菌种进行摇瓶培养，离心收集菌体，悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声波破壁，离心除去残渣，得粗酶提取液，经盐析和柱层析得酵母SOD。,酵母发酵法制备SOD,菌体培养超声波破壁离心盐析透析上柱洗脱浓缩冷冻干燥成品,二次盐析,酵母菌,除去残渣,三、超氧化物歧化酶的修修饰工艺为了提高SOD的稳定性，有必要对SOD分子进行修饰改造。途径有1对SOD氨基酸残基进行化学修饰2用水溶性大分子对SOD氨基酸残基进行共价修饰3对SOD进行酶切修饰,（一）硬脂酸修饰法将硬脂酸活化成硬脂酰氯，在一定条件下对SOD分子中的赖氨酸氨基进行修饰，提高了其稳定性。,硬脂酸修饰法工艺流程,SOD的制备硬脂酸活化SOD修饰反应加入丙酮沉淀离心洗涤冷冻干燥硬脂酰-SOD成品,（二）糖酯修饰法一定条件下，将葡萄糖酸内酯与超氧化物歧化酶上赖氨酸的氨基结合，提高其稳定性。,糖酯修饰法工艺流程,SOD的制备糖酯的合成SOD的修饰反应离心洗涤冷冻干燥糖酯-SOD成品,（三）聚乙二醇修饰法在一定条件下，经活化的聚乙二醇对SOD非活性部位上赖氨酸的氨基进行修饰，增强SOD对环境的稳定性。,聚乙二醇修饰法工艺流程,SOD的制备聚乙二醇的活化SOD的修饰反应透析冷冻干燥聚乙二醇-SOD成品,SOD作为药物在临床上被广泛应用，研究证明经口摄入SOD是有效的，为SOD应用于功能食品的开发提供理论依据。欧、美、日等发达国家和地区SOD保健食品已被消费者广泛接受。,四、超氧化物歧化酶在功能食品中的应用,（一）保健品SOD有清除细胞中超氧阴离子的作用。具有防病、抗衰老的SOD潜在的市场容量及经济价值巨大。国内外已有不少添加SOD的抗衰老的保健品。,SOD作为保健食品可申报的功能有：免疫调节、调节血脂、调节血糖、调节血压、抗突变、抗疲劳、抑制肿瘤等。,SOD苹果原有天然风味和营养成分不破坏的前提下，用微生态生物工程技术对自然生长过程中的苹果进行特