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第四军医大学 硕士学位论文 氧化葡聚糖交联平阳霉素明胶微球的研制及其相关生物学特性 的实验研究 姓名：邱麟 申请学位级别：硕士 专业：口腔临床医学（颌面外科） 指导教师：封兴华 20070501 独独独独 创创创创 性性性性 声声声声 明明明明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德， 本人声明所呈交的 论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 不包含本人或他人已申 请学位或其他用途使用过的成果。 与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责 任。 论文作者签名： 日期： 保保保保 护护护护 知知知知 识识识识 产产产产 权权权权 声声声声 明明明明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即： 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医 大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署 名单位仍然为第四军医大学。 学校可以公布论文的全部或部分内 容（含电子版，保密内容除外） ，可以采用影印，缩印或其他复 制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网 上提供论文内容的浏览和下载服务。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 第四军医大学硕士学位论文 氧化葡聚糖交联平阳霉素明胶微球的研制及其生 物学特性对比的实验研究 氧化葡聚糖交联平阳霉素明胶微球的研制及其生 物学特性对比的实验研究 硕士研究生：邱 麟 导 师：封兴华 教授 第四军医大学口腔医院口腔颌面外科，西安 710032 中文摘要中文摘要 颌面部恶性肿瘤是目前国内外肿瘤治疗的难题。传统单一手术治疗因颌 面部的解剖关系复杂、血供丰富，往往导致术中出血量大、术后患者功能障 碍和面容畸形，增大了手术风险、降低了患者的生存质量。随着医学技术的 发展，颌面部恶性肿瘤治疗已经进入综合序列治疗时期。根据不同病种和个 体，通过多学科有序排列，即所谓“量体裁衣”式的治疗，可以收到比传统单 一手术治疗更好的预后效果1。经导管动脉栓塞技术（Transcatheterarterial embolization，TCAE）与化疗相结合治疗方法的出现，为恶性肿瘤的序列治 疗提供了全新的思路。 栓塞化疗剂的性能和选择在介入栓塞治疗中起着关键性的作用。栓塞用 载药微球的研制成为了目前栓塞剂研究的热点。明胶因其生物相容性好、可 自我交联、化学性质稳定等特点成为微球制备中的常用基质材料。目前在制 备明胶微球（Gelatin microspheres，GMS）中常用醛类交联剂，因其在微球 中的残留不能彻底清除，会对组织产生一定的毒性作用，不利于临床的广泛 应用。本课题首次通过选择一种生物相容性好的糖类交联剂来制备平阳霉素 （Pingyangmeisu，PYM)GMS，可有效的避免醛类交联剂对组织的毒性效应， -2- 第四军医大学硕士学位论文 并优化了工艺，使 GMS 栓塞化疗变的更为安全可靠，从而使 GMS 的性能进 一步完善，并向临床应用过渡。 目的目的：选择一种新的生物相容性好的多醛葡聚糖即氧化葡聚糖（Polyaldehyde dextran，PAD）交联剂来制备栓塞用 PYM-GMS，并与以传统戊二醛 （Glutaraldehyde，GA）交联剂制备的 PYM-GMS 进行比较。评估使用 PAD 交联剂制备栓塞用 PYM-GMS 的可行性。 方法方法：使用葡聚糖制备出 PAD，并以乳化冷凝法分别制备以 PAD 和 GA 作 为交联剂的 PYM-GMS。采用光镜、扫描电镜、激光粒度仪等方法分析微球 形态学特征。应用高效液相色谱仪、MTT 法等方法分析微球的生物学特性和 生物相容性。 结果结果：PAD 组微球圆整度优于 GA 组；与 GA 组相比，PAD 组的粒径分布范 围较窄；包封率、载药率（94.6、8.9）均高于 GA 组（80.1、5.5）， 且释药缓慢。细胞学实验显示，PAD 组细胞大多成梭形，细胞贴壁，充分伸 展，有大量分裂细胞，状态良好；GA 组有大量细胞脱落，细胞形态不规则， 圆形细胞较多。说明 PAD 组的细胞毒性明显低于 GA 组。 结论结论：PAD作为一种新的交联剂具有比GA更为突出的优点。PAD交联GMS 在形态学、生物学特性和生物相容性方面均达到了栓塞用微球标准，用它制 备的PYM-GMS将有可能成为一种有前途的可降解颗粒型栓塞剂广泛应用于 临床。 关键词关键词：明胶；平阳霉素；氧化葡聚糖；微球；缓释；细胞毒性；颌面部 肿瘤；动脉栓塞。 -3- 第四军医大学硕士学位论文 Experimental Studies on prepare a new kind of crosslinking agent to gelatin-PYM-microspheres and investigate its related biological characteristics Postgraduate Qiu Lin Tutor Feng Xinghua Department of Oral and Maxillofacial Surgery of Stomatological College ， Fourth Military Medical University,Xian 7l0032 Abstract Therapy of maxillofacial region malignancy is an existent tough problem of oncotherapy. It is for a long time that the therapy of the head and neck tumors mainly depends on the surgery operations. The blood supply of orai and maxilliofcial part is flourish and the anatomic stucture is complicated，so the conventional surgery has some problems such as high risk，heavy trauma，high relapse rate，et al. Besides the features deformation after operations and malfunction has badly affection on patientss life value. The method of transcatheter arterial embolization(TCAE ) combine chemotherapy offers a new approach for therapy of the oral and maxillofacial mailgnant tumors. Choice of embolic chemotherapeutic agent is a critical role on intervention chemoemoblization therapy. It has been a hot spot on embolic praeparatum. Gelatine is a base material that commonly used in prepare microballoons. Glutaraldehyde usually used as cross-linking agent which could not be cleared -4- 第四军医大学硕士学位论文 thoroughly in gelatin-microballoons and has toxic effect on tissues, that would confine clinical application of gelatin-microballoons. The study is to choose polyaldehyde dextran as a new kind of crosslinking agent to prepare gelatin-pingyangmyc(PYM)-microspheres ,it could significantly reduce toxic effect on tissues because used glutaraldehyde as cross-linking agent and be applied securely intervention chemoemoblization therapy. Objective：To choose a new kind of crosslinking agent to prepare gelatin Pingyangmyc(PYM)microspheres for the interventional chemoemoblization therapy. Method：.This study is divided into two parts： first，we prepared gelatin-PYM- microspheres cross-link with polyaldehyde dextran and glutaraldehyde respectively by emulsified cold一condensation method； second，we compared morphology and biological characteristics of two kinds of microsphere by related empirical method. Result ： The roundness of polyaldehyde dextran group is better than glutaraldehyde group though optical microscope; the distribution range of particle diameter of two kind of microsphere were fit for the use of embolization, however, polyaldehyde dextran group is narrower when compared with glutaraldehyde group （p0.05） ;the drug content rate and the encapsulation rate of polyaldehyde dextran group was 94.6 ,8.9 respectively which was higher than glutaraldehyde group 80.1,5.5（p0.05）;the cumulative release rate of PYM from oxidized-dextran group in 6 hours was 71% , it has lower drug release than glutaraldehyde group 95%（p0.05）. MTT experimental results show that polyaldehyde dextran group has higher cell survival rate than glutaraldehyde group. Conclusion: These results implied the polyaldehyde dextran as a new kind of -5- 第四军医大学硕士学位论文 crosslinking agent has more exerted quality than glutaraldehyde，gelatin-PYM- microspheres cross-link with polyaldehyde dextran could become a perspective granular pattern embolism for targeted tumor therapy. Key words ： gelatin; PYM; polyaldehyde dextran group; microsphere; slow-release；cytotoxicity；maxillofacial region tumor；arterial embolism -6- 第四军医大学硕士学位论文 前前 言言 颌面部恶性肿瘤因位置特殊，血供丰富，与周围组织解剖关系密切，如 行手术切除则创伤大，易遗留面部畸形，严重影响患者的生存质量，是目前 国内外肿瘤治疗的难题。 上世纪 80 年代， 经导管动脉栓塞术(Transcatheterarterial embolization ,TCAE)与化疗相结合的治疗方法问世，为颌面部恶性肿瘤的综合 序列治疗提供了新的思路。它可以减少或阻断肿瘤的供血，并缓慢的在局部 释药，使局部达到高血药浓度并维持一定时间，从而达到疗效高、药物毒副 作用小、手术微创的治疗目的。为此研究一种既能装载化疗药物又能起到栓 塞作用的载药缓释系统就成为了介入栓塞化疗的关键。已有的研究表明 GMS 载药缓释系统具有较好的生物学性能，但是在制备 GMS 中所使用的醛类交联 剂会对组织产生一定的毒性，这使得 GMS 的临床应用受到了一定的限制。 明胶作为微球的主要基质材料之一，以它生物相容性好、可自我交联成 球、有一定的溶胀度等优点成为一种理想的栓塞用载药微球基质材料。使用 明胶制备栓塞用微球一般需要其粒径在 50m200m之间，粒径小于 40m 容易造成非靶器官栓塞或被单核巨嗜细胞吞噬。粒径大于 200m在栓塞后容 易形成侧枝循环，远期栓塞效果差2。使用生物相容性好的PAD交联剂交联 后的GMS，不仅其溶胀度得到控制、水解率降低、延长血管栓塞时间和释药 时间、减少给药次数，而且还可避免因使用醛类交联剂所引起的严重细胞毒 性作用。使用PAD交联GMS不仅可以达到传统醛类交联剂所制备GMS的各项 生物学和形态学指标， 而且还拥有比醛类交联剂更好的生物相容性。 因此PAD 交联剂可能是今后制备栓塞用GMS更为理想的选择。 我们选用PYM这种对头颈部肿瘤有独特疗效的化疗药物，首次制备出 -7- 第四军医大学硕士学位论文 PAD交联PYM-GMS， 并对其形态学特征、 生物学特性及生物相容性进行检测， 从而为能够使其进一步完善并向临床应用过渡提供实验依据。目前还尚未有 应用PAD作为交联剂制备PYM-GMS的文献报道。 -8- 第四军医大学硕士学位论文 文献回顾文献回顾 一一 TCAE 在肿瘤治疗领域应用研究进展在肿瘤治疗领域应用研究进展 肿瘤是危害人类生命健康的常见病和多发病，其中颌面部肿瘤占全身肿 瘤的 7.67，恶性肿瘤略高于良性肿瘤。颌面部恶性肿瘤因位置特殊、血供 丰富、与周围组织解剖关系密切、手术创伤大、易遗留面部畸形且复发率较 高，严重影响了患者的生存质量。以往颌面部恶性肿瘤的治疗主要是将化学 药物全身给药或经动脉插管直接推注至肿瘤区域局部给药，使肿瘤局限和缩 小后再行手术切除。但因药物直接静滴入静脉或推注到肿瘤区域后迅速被血 流冲淡进入体循环，不能维持长时间的局部血药浓度，而且还需多次大剂量 给药。这样即起不到很好的局部化疗作用又对全身产生了较大的毒副作用。 上世纪 80 年代，TCAE 与化疗相结合的治疗方法的出现，为肿瘤的综合 序列治疗提供了新的思路。它可以使肿瘤的供血减少或阻断，并缓慢的在局 部释药，使局部达到高血药浓度并维持一定时间，从而达到疗效高、药物毒 副作用小的目的。目前应用 TCAE 结合化疗治疗肿瘤的方法在肝脏肿瘤的治 疗方面较为成熟，其次是子宫肿瘤，在颌面部肿瘤方面应用较少，大多还停 留在实验室阶段。 （一） 肝脏肿瘤 TCAE 化疗 肝癌是常见的恶性实体肿瘤。由于肝癌早期症状隐匿，患者就诊时多属 中晚期，加之肝癌患者合并肝硬化的发生率高(8595)，手术切除率较 低，因此大多数患者只能接受非手术治疗。在非手术疗法中，介入栓塞化疗 是应用最普遍的方法。因为正常肝脏主要是以肝动脉与门静脉双重血供，但 肝癌组织则以肝动脉供血为主，这为TCAE的应用创造了有利条件。 -9- 第四军医大学硕士学位论文 应用于肝癌栓塞的栓塞剂很多，较常用的有碘油、明胶海绵、丝线、弹 簧圈、微球等。碘油是TCAE常规使用的栓塞剂，将化疗药物与碘化油制成 乳剂，灌注到肝肿瘤区域的供血动脉内3，是目前最常用的肝动脉栓塞治疗 手段，但是临床上一般需多次注射才能奏效，而且不良反应严重，病变易复 发，用量过大或药物外渗都会引起周围正常组织坏死，引起肝昏迷，并且还 有大出血的危险。明胶海绵和弹簧圈仅能栓塞病变周围小动脉，栓塞后由于 瘤内血流压力降低，病变周围血管通过侧支循环的建立向病灶供血，达不到 有效治疗的目的。 微球是近年来栓塞剂的研究热点， 其可因基质材料的不同， 理化性质也有所不同。它应用于TCAE往往混合于造影剂中，进入肝动脉血 管，到达位置后再膨胀复原，机械性的阻塞血管，并通过溶解和降解缓慢释 药。Giavreglou等4 应用聚乙烯醇颗粒栓塞肝动脉，疗效确切且不良反应较 轻。Yamato等5曾采用淀粉微球对45例晚期肝癌患者进行治疗，成功延长了 患者的生存时间。 （二）子宫肌瘤TCAE治疗 子宫肌瘤是女性多发良性肿瘤，由增生的子宫平滑肌组织和少量纤维结 缔组织构成，好发于3050岁，发病率高达20左右。子宫肌瘤供血绝大部 分来源于双侧子宫动脉，62.97为一侧供血为主，33.70双侧同时供血，1.58 为卵巢动脉参与供血，1.74一侧子宫动脉发育缺如，子宫及肌瘤血供来自 另一侧子宫动脉6。子宫肌瘤的上述血供特点使它适合于栓塞治疗。采用栓 塞剂阻断双侧子宫动脉及其供血于肌瘤的毛细血管前吻合支，能缓解或消除 其伴有的一系列临床症状。 Sena-Martins等7曾应用聚乙烯醇颗粒对32例子宫肌瘤患者进行TCAE治 疗。栓塞前32例患者子宫的体积平均为4.55cm3，主要肌瘤的体积平均为 1.50cm3；栓塞12周后，子宫的体积平均为2.56cm3，主要肌瘤的体积平均为 0.91cm3。李廉等8采用海藻酸钠微球经子宫动脉栓塞治疗子宫肌瘤，治疗 -10- 第四军医大学硕士学位论文 后子宫肌瘤患者的临床症状明显缓解，月经量为原月经量的57.35；第6、 12个月肌瘤体积分别缩小59.17、72.54，子宫体积分别缩小45.75、 57.83。 （三） 颌面部肿瘤TCAE化疗 颌面部肿瘤病变部位特殊、血供丰富。手术治疗出血量多、创伤大。该 部位肿瘤主要由同侧颈外动脉的分支供血，颈内动脉及对侧颈外动脉较少参 与，且双侧的颈外动脉之间存在广泛的血管吻合支，栓塞一侧颈外动脉的分 支不会引起严重的正常组织坏死，故栓塞治疗是比较可行的。但由于颈外动 脉系统存在丰富的侧支吻合，仅栓塞二级动脉主干，侧支循环在短时间内即 可建立代偿，只有超选择插管栓塞三级动脉及病灶的小血管床，方能获得理 想的效果。 颌面部血管与颅内交通支即“危险吻合”较多且不易被发现，一旦误栓， 后果相当严重。栓塞剂可能通过颅内外交通支导致危险的脑栓塞。因此栓塞 前应用血管造影技术能有效了解肿瘤病变的大小、 范围及血管异常交通情况。 详细分析造影情况不但可以做出定性定量诊断，还可以有效地减少脑栓塞并 发症的发生。 1986年， Okamoto9首次使用顺铂乙基纤维素微球治疗上颌窦癌和口腔癌 患者，取得一定疗效，此后不少学者开展了此方面的实验和临床研究。但由 于我国这方面研究起步较晚，且颌面部动脉栓塞对设备技术的要求较高，风 险也较大，这是TCAE在我国颌面外科应用相对滞后的困难所在。目前国内 应用于颌面部动脉栓塞的主要还是传统的碘油、明胶海绵等栓塞剂，载药微 球应用的文献报道较少，大多报道还处在动物实验阶段。我科也已研制了5- 氟尿嘧啶GMS、顺铂GMS、PYM-GMS等载药微球，并在栓塞犬颈外动脉的 动物实验中获得了成功10-11。随着数字减影血管成像技术和微球制剂研究的 成熟，载药化疗栓塞微球在口腔颌面部的临床应用将不再遥远。 -11- 第四军医大学硕士学位论文 二二 栓塞用微球制剂在临床医学领域应用研究进展栓塞用微球制剂在临床医学领域应用研究进展 微球(microspheres)是指药物溶解或者分散在高分子材料基质中形成的微 小球状结构，粒径在 1250m之间，小于 1m的称为毫微粒，属于基质型 骨架微粒12。若将此给药系统用于动脉栓塞化疗，即可称为动脉栓塞化疗微 球。 微球作为药物载体应用可以追溯到上世纪 70 年代中期， 其目的是为了掩 盖药物不良气味和口味、提高药物的稳定性、防止药物在胃内失活或产生胃 刺激、减少复方药物的配伍变化、缓释和控释药物、使药物浓集于靶区等等。 要达到上诉目的，微球的基质材料就必须要满足一定要求，比如性质稳定； 有合宜的释药速度；无毒无刺激性；能与药物配伍，不影响药物的药理作用 及含量测定；有一定的强度及可塑性，药物与附加剂能比较完全地进入球体 骨架内；具有符合要求的粘度、渗透性、亲水性、溶解性等特性13。微球的 药物释放一般分 3 种机制：药物从微球表面脱附、微球溶胀后的药物扩散和 微球基质溶解化学键断裂释放14。微球的释药速度与粒径、表面性状、载体 材料、药物种类和体内环境密切相关。 目前，国内外主要用于 TCAE 的微球基质材料可分为可生物降解类微球 和不可生物降解类微球两种。 （一）可生物降解类微球 1.淀粉微球（淀粉微球（Starch microspheres） 淀粉价格低廉、无毒、生物相容性好、储存稳定，是由葡萄糖构成的天 然高分子。其作为微球基质材料的主要为淀粉的衍生物，包括羟甲基淀粉、 羟乙基淀粉和马来酸酯化淀粉-丙烯酸共聚物等。 淀粉微球的制备工艺主要是乳化聚合法，制得的微球可在水中膨胀，具 有凝胶的特性，但其缺点是降解时间较短，一般数分钟到数小时。在瑞典， 淀粉微球已经商品化，商品Spherex已有出售，粒径一般在 4050m之间。 -12- 第四军医大学硕士学位论文 淀粉微球的临床应用较为广泛，Mao等15以抗黑变激素为药物模型，制备经 鼻腔给药的淀粉微球，在活体中载药微球的药物释放率到达 80以上，而药 物作用时间超过 2h；在药物动力学上，活体药物吸收速率快，而且利用率达 到 84.07。Bjork等16还研究了包有胰岛素的淀粉微球在小鼠体内的降解与 吸收情况和降糖作用，结果显示，淀粉微球能明显增加其吸收，达峰时间为 710 min，表明胰岛素从淀粉微球释放后快速通过鼻粘膜。近年来国外对应 用淀粉微球与化疗药物结合的方法进行栓塞化疗的研究日趋广泛，特别是针 对肝癌的栓塞化疗研究17-18有一定进展，但因淀粉微球降解速度较快，不适 合长时间栓塞。目前尚无应用淀粉微球针对颌面部肿瘤进行栓塞化疗的文献 报道。 2.白蛋白微球（白蛋白微球（Albumin microspheres） 白蛋白分子较小，能溶于水，呈球状，又称清蛋白。常作基质材料的有 人血清白蛋白、小牛血清白蛋白等，其化学性质稳定、无毒、无明显抗原性。 Muramatsu等19首次采用膜乳化-热固化方法制备白蛋白微球，所得微球呈规 则的球形，粒径分布窄，平均粒径约为7m，此后此法成为了制备白蛋白微 球的主要方法，但制备过程也存在着微球固化受热不均匀的缺点。早期白蛋 白微球研究主要集中于放射医学领域，用于检查肺循环异常现象。后来人们 发现白蛋白微球对亲水性药物有较高的负载能力，很适合用作药物载体，于 是将其应用于药物制剂尤其是抗癌药物制剂的研究中。近年来，通过各种方 法使白蛋白微球具有新的表面性质成为一个研究热点。白蛋白微球的表面改 性主要有两个目的：(1)避免吞噬细胞的捕获；(2)增加其负载药物的途径20。 白蛋白微球的应用十分广泛。 Luftensteiner等21首次将含米托蒽醌的微球 应用于腹膜腔内治疗腹部肿瘤，取得一定疗效。华成舸等22使用白蛋白微球 栓塞颈外动脉，结果显示：微球经颈外动脉灌注后92.23集中于头颈局部组 织内。 其对颈外动脉的微小分枝有明显的栓塞作用， 栓塞的血管在79d内再 -13- 第四军医大学硕士学位论文 通。此外还有报道将载药白蛋白微球应用于眼部及关节腔，并取得了良好的 疗效。 3.明胶微球（明胶微球（Gelatin microspheres） 明胶是氨基酸与肽交联形成的直链聚合物，其价廉易得、无毒、无抗原 性、可自我交联、化学性质稳定、干燥条件下可长期保存。GMS 的制备主要 是以乳化-交联法为主，制备方法简单，适合工业化大生产需要。因制备明胶 时水解方法不同，明胶分酸法明胶(A 型)和碱法明胶(B 型)，A 型明胶的等电 点为 79，10g/L 溶液 25的 pH 为 3.86.0；B 型明胶稳定而不易长菌，等 电点为 4.75.0，10g/L 溶液 25的 pH 为 5.07.4，通常可根据药物对酸碱 性的要求选用 A 型或 B 型。 GMS具有大小均匀、疏松多孔、载药量高、分散性好的特征。其遇水后 略有膨胀，30 分钟膨胀率在 27.9以内，水环境中溶解较快，通过交联固化 的方法可有效延长微球的降解时间，降低膨胀率，还可延缓所载药物的释放 23。在制备微球过程中，如果明胶浓度高，油量比例小，搅拌速度慢，形成 的微球就会大；反之则会小24。近年来人们对GMS的研究日益深入，根据临 床要求的不同，人们已研制出一大批对应不同要求的载药GMS，如 PYM-GMS、阿霉素GMS、双氯芬酸钠GMS等等25-27。 GMS也是动脉栓塞的主要材料之一28，而且其栓塞效果确实可靠，但目 前国内尚无成熟的GMS商品，用于栓塞的多为临时制得的微球。国外现已有 商品化GMS（三丙烯基GMS）出现，有报道临床用 150300m的三丙烯基 GMS术前栓塞脑膜瘤的供血动脉，术中止血效果优于同样粒径的聚乙烯醇微 球29。 4.壳聚糖微球（壳聚糖微球（Chitosan microspheres） 壳聚糖是几丁质脱乙酰基衍生物，一种碱性多糖。其制备简单、生物相 容性好、生物降解后可被吸收利用，且成粒性好、分子还具有独特的物理化 -14- 第四军医大学硕士学位论文 学与生理功能30，如丰富的-OH、-NHR功能基团与表面电荷，及较高的表面 能与生物粘附作用和较强的细胞间瞬间渗透能力，此外，壳聚糖作为药物载 体还具有抗酸、抗溃疡、抗菌消炎、促进伤口愈合、降血脂和降胆固醇、抑 制肿瘤等多种药理作用。壳聚糖微球的制备方法主要有喷雾干燥法、盐析法 和化学交联法等。壳聚糖水溶性与亲水性差，在制备过程中质量较难控制， 不利于大规模生产。 用壳聚糖微球运载小分子药物及生物大分子活性物质时，与现有的抗癌 药合用可增强抗癌效果31-32。Akbuga等33制备壳聚糖顺铂微球，应用狗肝动 脉栓塞模型，发现顺铂壳聚糖微球在阻塞区域可显著减少肝细动脉、节结坏 疽与肝细胞恶化的数量。但目前利用壳聚糖微球载药系统栓塞化疗颌面部肿 瘤的文献报道还不多见。 5.聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物微球（聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物微球（PLA/PLGA microspheres） 聚乳酸（PLA）是由乳酸在高温和减压下缩合聚合，聚合物在氯乙烯中 用甲醇沉淀精制而成。它可以溶于水和乙醇，降解速度较快，在体内降解不 易蓄积。其制备的常用方法为相分离法。国内外均有研制成功的PLA微球。 聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）是由乳酸及乙醇酸单体按比例混合，在一定 在一定温度、压力及催化剂作用下聚合而成的。其具有良好的组织相容性、 生物可降解性和可塑性可以被人体消化吸收，最终产物是二氧化碳和水。 PLGA是目前研究最多的可生物降解材料之一，已获美国FDA批准用作手术 缝合线，心血管支架控释药物涂层，以及注射用微囊、微球、埋植剂等的材 料34。此外还有部分成功上市的PLGA微球，如法国Ipsen公司开发的曲普瑞 林PLGA微球35。但PLGA聚合物价格昂贵，不易获得，国内生产的质量不稳 定，微球制备条件要求高，还存在产率、包封率较低，不易灭菌，稳定性和 重复性差等问题。 在动脉栓塞化疗领域，Fujiwara36等曾成功使用了阿霉素聚乳酸微球栓 -15- 第四军医大学硕士学位论文 塞日本大白兔肾动脉。国内也已研制出顺铂PLA微球，用以肝动脉栓塞治疗。 6.葡聚糖微球（葡聚糖微球（Sephadex） 葡聚糖微球又称葡聚糖凝胶，是由一定规格葡聚糖悬浮于有机相中，加 入表氯醇交联聚合而成的。其已经成为商品，且商品型号很多，常用于动脉 栓塞剂的Sephadex为G50。其在肝动脉栓塞方面的应用最为多见，对于肝癌 末梢动脉的栓塞效果较好。国内外已研制出阿霉素Sephadex、顺铂Sephadex 等。 近年来徐青等37还研制出磁性顺铂Sephadex用以靶向栓塞治疗大鼠肝癌， 结果显示了理想的磁响应性及靶向性，它可在肿瘤组织中高浓度聚积而明显 高于非靶区肝组织，亦未出现异位栓塞现象。但目前还没有将Sephadex应用 于颌面部栓塞化疗的文献报道。 （二）不可生物降解微球 1.乙基纤维素微球（乙基纤维素微球（EC microspheres） 乙基纤维素（EC）的化学稳定性高，适用于多种药物的微球化，不溶于 水、甘油和异丙醇，可溶于乙醇，遇强酸易水解，故不适用于强酸性药物。 其制备方法多为相凝聚法和溶剂蒸发法，制得的微球表面圆整、多微孔、载 药量大。 国外已有使用载药EC微球通过颞浅动脉超选择栓塞治疗了5例上颌骨癌 的病人， 取得了很好的治疗效果38。 目前EC微球已有商品出现， 并已国产化。 封兴华等39对国产EC微球的安全性及其在口腔颌面部动脉的栓塞效果进行 了评价。 结果表明： 国产EC微球生物相容性良好， 可以持久阻塞动脉血管腔。 有望在临床上用于血管性疾病的栓塞治疗。 2.聚乙烯醇微球（聚乙烯醇微球（PVA microspheres） 聚乙烯醇(PVA)是一种水溶性高分子材料，无毒性，无刺激性，并且有良 好的生物相容性，被广泛应用于制备止血纤维、人工皮肤，还可以用于避孕 药膜、代血浆、眼药膜等，也可以作为药物缓释载体材料制备靶向微球。美 -16- 第四军医大学硕士学位论文 国FDA已批准生物治疗(BioCure)公司的聚乙烯醇栓塞微球（Bead Block） ，用 于治疗多血管性肿瘤和动静脉变形。邹英华等40使用国产PVA微球进行肝动 脉栓塞实验。 结果， 栓塞后1周半年不同时间血管造影复查证明所栓塞末梢 动脉未能再通，体内观察半年未见微球降解吸收征象，不同时间的镜下微球 形态、结构不发生改变。栓塞后肝功能改变是的暂时，3周内均恢复正常。最 后结论认为该微球可以栓塞相应直径的细小动脉，起到永久拴塞效果。 3.玻璃微球（玻璃微球（Glass microspheres） 玻璃微球是在上世纪80年代中期出现的，其主要用于局部肿瘤的放射治 疗。它是以氧化物形式烧结于玻璃中，再放于核反应堆中辐射形成。玻璃微 球化学性质稳定，核素释放率低，使用前易消毒，具有永久性栓塞等优点， 克服了包含微球核素不稳定，易脱落入血，及胶体颗粒大小不均匀的缺点。 80年代90Y-玻璃微球在加拿大问世，国内也在90年代研制成了放射性医用32P- 玻璃微球。1988年Herba等41首次采用90Y-玻璃微球经肝动脉灌注内照射栓塞 介入治疗肝恶性肿瘤，目前已经是临床应用较多的治疗肝恶性肿瘤的方法。 1996年国内王大章等42应用32P-玻璃微球进行舌癌抗肿瘤实验取得了一定进 展。目前常用国外主要应用的是90Y-玻璃微球，国内32P-玻璃微球研究较多。 三 交联固化对微球制备的影响的研究进展交联固化对微球制备的影响的研究进展 目前研究较多的医用高分子微球载药系统，其制备工艺大多分为化学交 联法和物理交联法两种。其中又以化学交联法应用最为广泛。通过化学交联 的微球能够较长时间地保持良好的力学性能和完整的自身形态结构而且还可 提高了抗酶降解的能力，同时又降低了甚至去除了材料的抗原性。这就为载 药微球拓宽了应用范围。 交联剂是化学交联法中不可或缺的重要组成部分。使用交联剂制得的微 球，其溶胀率降低、粘连减少、颗粒圆整、粒径均一、药物释放速度减慢、 突释效应降低，有利于动脉栓塞给药时的通畅性及给药后的安全性。在当前 -17- 第四军医大学硕士学位论文 的实际应用中，较为常用的交联剂有 GA、多聚环氧化合物、京尼平、多醛 基葡聚糖等。这些交联剂在处理微球材料方面各有所长，但有些也暴露出较 为严重的缺点。 （一）化学交联法 1. 戊二醛戊二醛(Glutaraldehyde, GA) GA是一种5碳双缩醛的化合物， 分子式为C5H8O2， 被广泛的用作交联剂， 其具有亲水与疏水两种特性，且价格低廉，可较容易的进入微球基质材料和 组织中进行交联反应，形成网状交联。一方面它可以提高材料的各项理化性 质，如制得的微球分散性好、较少粘连、溶涨率降低等等；另一方面它却可 以产生局部较严重的细胞毒反映，并且降低注射区血管的质量。 GA可交联血管组织的胶原纤维，使血管的韧性降低并发生收缩，使延展 度增加，应力松弛下降，抗张强度增加43，从而降低了血管的机械强度。 Schmid等44认为释放出的GA醛基可诱导钙晶核的形成产生钙化，并影响细 胞的钙调节机制， 使细胞外大量Ca2+ 内流并与细胞膜中的磷结合造成钙的沉 积，从而进一步降低了血管的机械强度。而且，GA进行交联时会产生Schiff 碱，Schiff碱是一种不稳定易发生可逆性反应的交联产物，它的逆反应可释放 出较多GA分子，使得组织局部总保持较高的GA浓度，并长时间刺激局部组 织，引起较严重细胞毒性反应45和炎症反应，直到微球被完全降解为止。 目前清除 GA 的方法主要以洗涤为主，但洗涤难以将其清除完全，而且 多次洗涤会洗掉微球中的部分药物，影响微球载药率，从而影响微球总体质 量。还可采用甘氨酸及谷氨酸等氨基酸溶液处理，可减少毒性，增加生物相 容性，但仍不能彻底解决所存在的问题。 2. 多聚环氧化合物多聚环氧化合物(Polyepoxy compound, PC) 多聚环氧化合物（PC）是带有多个环氧功能基团的交联剂，其交联环境 为碱性，交联反映时，同材料形成耐酸水解的C-N键，同时自身也聚合成长 -18- 第四军医大学硕士学位论文 链与材料交联。PC的交联度较低43，因为多聚环氧化合物交联呈线状，交联 速度也较慢，要想达到GA的交联度就必须延长PC交联固化的时间。此外PC 交联过程中易形成伪饰，即只有一个PC分子中仅有一个环氧基团参与交联反 应， 其实并未达到交联的效果46。 此外PC处理的微球也中同样存在PC渗出的 问题，由此材料局部也要产生细胞毒性47。PC中环氧基团毒性比GA的醛基 稍轻，经充分的冲洗可降低其毒性，但也存在因冲洗造成的药物流失现象。 3. 京尼平京尼平(Genipin,GP) 京尼平（GP）是传统中药杜仲的活性成分之一，是从京尼平甙中分离、 提纯而获得的。它是一种环烯醚萜类化合物，具有羟基、羧基等多个活性官 能团。其活性官能团可与材料形成环状的分子间和分子内交联，且交联速度 较慢，需较长的交联时间48。 钙元素含量的高低，是钙化现象发生与否的一个重要表征。GP交联处理 后制品的钙元素含量，与其他交联剂处理后的制品相比，两者之间并没有统 计学上的差异49，说明GP不会影响栓塞处血管的质量。GP的最大优点是低 细胞毒性。通过MTT试验测定的交联剂细胞毒性显示，GP细胞毒性比GA小 10000倍；而通过细胞集落形成试验测定的细胞毒性显示，暴露于GP的细胞 的增殖能力大约是同样暴露于GA的细胞的5000倍50。但GP交联生物性材料 后常常使材料变成深蓝色51，使制品的外观受到影响，这是其作为交联剂的 一个缺点。此外，由于提取过程复杂，GP商品价格很昂贵，这也限制了其广 泛应用。 4. 多醛基葡聚糖（多醛基葡聚糖（Polyaldehyde dextran,PAD） 多醛基葡聚糖（氧化葡聚糖，PAD）是由葡聚糖经高碘酸纳氧化得到的 高分子葡萄糖聚合物。葡聚糖拥有无毒、水溶性好、价格低廉的特点，是临 床上用于防治低血容量休克，如出血性休克、手术中休克、烧伤性休克的血 浆代用品52。与其他交联剂相比，PAD可以提供持久稳定的交联，且生物相 -19- 第四军医大学硕士学位论文 容性极好，不会引起组织的钙化和细胞的毒性反映。 经氧化后的葡聚糖可产生较多供交联的化学基团，其中以醛基为主。它 进行交联反应主要以分子内的醛基官能团与材料中的氨基酸结合形成Schiff 氏键，之后同其他分子再形成立体网状交联，其交联形式类似于GA的交联方 式。PAD的交联度与所暴露醛基的多少有关，而其醛基的暴露程度又与葡聚 糖的氧化程度密切相关。葡聚糖的氧化度因高碘酸钠使用浓度的不同而有所 差别。有文献报道53，在相同温度、时间下，随着高碘酸钠浓度的不断提高， 被氧化的葡聚糖所暴露的醛基数量也不断增加，大量的醛基确保了PAD的交 联效果。 因葡聚糖分子量大小的不同，制得的PAD的用途也略有差别，一般T-10 的PAD因其分子量较小，多用于药物的相互交联；T-40 以上的PAD则可用于 微球、组织工程材料的交联。PAD的性质稳定，交联过程中不影响药物的性 质， Mate等54认为与常用的GA相比， 用PAD交联剂可得到较高的固定化收率。 对青霉素G酰化酶CLEAs的活性位点滴定法显示，用PAD作为交联剂可使活 性位点的损失明显降低，而使CLEAs的活性更高。原因可能是大分子交联剂 不能穿透蛋白活性位点， 而与催化必需的氨基酸残基反应。 还有学者认为PAD 还具有增强体内非物异性抗瘤的效应，将其与抗癌药物交联，可增强药物对 靶细胞的毒性作用55。有报道称56以PAD为中间体制备的免疫结合物，稳定 性较好. 即使与血清及肝脏匀浆混合物作用 48h，其释放的药物量仅为 18.6%， 说明以Schiff氏键连接的结合物较稳定， 进入体内后不易被分解破坏。 这就保证了PAD的持久交联作用。 在制备微球方面PAD比经天然葡聚糖处理或未处理的微球溶涨度都低， 药物包封率均高。37 48h后，未处理的及经天然葡聚糖处理的GMS释放药 物 90，经PAD处理的微球只释出 20。以PAD为交联固化剂能减慢药物的 释放，对微球产率无影响，而且能在体内自行降解57。 -20- 第四军医大学硕士学位论文 PAD 与 GA、PC 相比，在细胞毒性和生物相容性等方面明显优于 GA 和 PC，通过控制高碘酸钠的浓度进而还可控制 PAD 制备微球的释药速率。与 GP 相比它又拥有价格上的绝对优势，有利于扩大再生产。综上所述 PAD 将 有可能成为一种有前途的栓塞微球交联剂被广泛应用。 （二）物理交联法 光氧化交联法光氧化交联法(Dye-mediated photooxidation，DMP)，蛋白质中某些氨 基酸能在光敏感剂存在的情况下，通过可见光照射而被特异地氧化，并进一 步导致组织交联。与化学处理方法的效果一样，经DMP交联的生物性材料抗 原性降低而生物稳定性增加，并且随着DMP交联时间的延长，材料的抗原性 越发降低而抗酶降解能力越发增强58。但目前DMP交联生物性材料在许多方 面还需进一步研究。 紫外光辐射法（紫外光辐射法（Ultraviolet radiation，UVR）其原理是以聚烯烃为主要 原料掺入适量的光引发剂，用紫外光照射，通过光引发剂吸收特定波长的紫 外光引发产生聚烯烃自由基，从而发生一系列快速聚合反应，生成具有三维 网状结构的交联聚烯烃。经过交联的聚烯烃材料具有优良抗降解性、抗溶剂 性和明显增强的力学性能等。 综上所述，微球在药剂学及临床应用中日渐广泛，其在肿瘤栓塞化疗的 实验研究和临床应用方面都有了很大进步。但国内至今尚无一种栓塞化疗剂 可以做到商品化并被临床广泛应用。虽有部分临床应用的报道，但大多样本 量较小、适应证较窄。目前国内外大多数微球制备过程中使用的是有生物毒 性或价格昂贵的交联剂，严重影响了微球的总体质量和提高了成本。由于颌 面部栓塞有一定风险，所以 TCAE 结合化疗在颌面部肿瘤的临床应用报道更 为少见，且缺乏远期随访资料，大多数研究仍停留在动物实验阶段。 目前的微球载药缓释系统都有着粒径单一，释药和降解速度较难控制， -21- 第四军医大学硕士学位论文 制备成本较高等不足。但随着交联剂和交联方法的不断改进，微球载药缓释 系统必然将形成完备的体系，其总体质量也将不断提升。TCAE 栓塞化疗的适 应症及效果也将得到很大的扩大和提高，在颌面部及全身的肿瘤治疗方面会 拥有更为广阔的临床应用前景。 -22- 第四军医大学硕士学位论文 正正 文文 第一部分第一部分 氧化葡聚糖交联平阳霉素明胶微球的制备 及体外检测对比 氧化葡聚糖交联平阳霉素明胶微球的制备 及体外检测对比 1 材料和方法材料和方法 1. 1 材料与仪器材料与仪器 平阳霉素标准品：中国药品生物制品检定所； 平阳霉素：天津太河制药有限公司； 葡聚糖（Dextrn T-40）：Sigma公司进口分装； 明胶G9382：Sigma公司进口分装； 集热式磁力搅拌器DF-型：江苏金坛市正基仪器有限公司； 离心机LG10-2.4A：北京医用离心机厂； 无极恒速搅拌器DW-1型：巩义市英峪华仪器厂生产； 超声发生器 CSF1A型：上海超声波仪器厂； 高效液相色谱仪Waters600型：Waters生产；