Realtime PCR检测原理和问题处理.ppt

Real-timePCR检测技术原理和问题处理,2014-06-25,实时荧光定量PCR检测技术（Real-timePCR),荧光定量PCR（Realtimefluores-cencequantitativePCR,RTFQPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量实验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。,实时荧光定量PCR检测技术（Real-timePCR),定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理,什么是PCR？,PCR的反应过程,RT-PCR原理图,荧光定量PCR的数学原理,1、Baseline(基线)2、Threshold(阈值)3、ThresholdCycle(CT值)4、DNA0(初始模板),基线,反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为3-15cycles的信号值,线性图谱,对数图谱,阈值,阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近。,Ct值,扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。,DNA0,确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,Real-timePCR动力学曲线和四个阶段,只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。PCR理论方程只在指数期成立。,PCR产物的量与扩增循环数间的理论方程,Rn=RB+X0(1+e)nRsRn:第N次PCR循环时的荧光信号强度RB:背景信号强度X0(1+e)nRs:每个分子的荧光强度与分子数目的乘积经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：得到：Ct=klgX0+b线性方程，lgX0越大，则CT值越小！,从荧光信号实现定量结果一、检测荧光信号增长，获取样品CT值,从荧光信号实现定量结果二、绘制标准曲线,从荧光信号实现定量结果三、以待测样品的Ct值对DNA0作图，得到定量结果,定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理,常用的荧光标记方法,1、DNA双链特异性染料SYBRGreen、SYTO9、LCGreen、Evagreen2、序列特异性探针TaqMan、MolecularBeacons（分子信标）、DualProbes(FRET)、LNA(LockedNucleicAcid)Double-Dyeprobes,SYBRGreenI工作原理,1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2、染料一结合，就产生荧光信号3、信号强度与DNA分子总数目成正比,SYBRGreenI工作原理图片演示,熔解曲线(Dissociationcurve),目的：在PCR之后分析产物特异性基本程序：-解链；-复性；-升温检测；-降温；软件自动分析,融解曲线(Dissociationcurve),PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Tm值：50%DNA变成单链时所需要的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表产物序列的特异性；PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号逐渐减弱；当体系到达某一特定温度时，某些DNA双链会突然完全解离，荧光强度也显著减弱；对融解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，该处所对应的横坐标值（温度），即Tm,融解曲线(Dissociationcurve),PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。,原始图谱,导数图谱,只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。,SYBRGreenI的优缺点,成本低不需要制备序列特异的针对性探针，且试剂便宜适合初步筛查先用SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法确认配合熔解曲线分析需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体特异性问题不能分辨主带与杂带，给出所有双链DNA的总信号多重定量问题每个PCR管只能检测一个目标基因,Taqman原理,Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。,TaqMan探针的作用机理,Taqman探针,优点灵敏、特异性高：每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响缺点探针设计有一定难度，需要验证效果探针合成质量对试验结果有较大影响荧光标记成本较高,多重检测,原理同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的荧光报告基团标记不同的探针目的提高效率，节省时间降低研究成本特点一次提取DNA/RNA、一次反应、定量多个基因要保证信号之间互不干扰,常用的荧光染料,定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理,荧光PCR区别于其他PCR方法主要有以下优点,1)全封闭反应，无需PCR后处理2)特异性强，灵敏度高3)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确4)定量范围宽，可达到10个数量级5)仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断6)可实现一管双检或多检7)操作安全，缩短时间，提高效率8)利于自动化和联网管理,定量PCR常见问题处理,扩增曲线-AmplificationPlot,标准曲线-StandardCurve,原始数据-Component,各波长的原始信号-Spectra,融解曲线-Dissociation,定量PCR实验中的10个常见缺陷,1.引物或探针的设计不过关2.RNA模板质量差3.没有使用“预混液”，导致差异的累积4.发生污染5.没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组DNA的干扰6.选取了不恰当的“内参基因”7.在使用SYBRGreen染料的实验中，没有引入“融解曲线分析”8.没有正确设置“基线”和“阈值线”9.反应体系“扩增效率”低下10.标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化,导致异常实验数据的常见原因,错误的荧光染料设置错误的反应程序设置荧光污染反应试剂质量问题仪器硬件问题未正确密封而导致的试剂蒸发,实例1：没有标准曲线,标准品没有填写相应的数值,实例2：没有扩增曲线,原因1：PCR参数设置错误数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。,实例2：没有扩增曲线,原因2：硬盘休眠，数据采集中断,实例3：基线下滑,从原始数据找原因1-9循环，ROX的信号下降基线设定4-13范围内，ROX信号值变化，FAM的信号值基本固定；FAM/ROX的校正后，基线不是水平的直线；应该取ROX信号稳定的10-20循环为合理的基线范围。,实例3：基线下滑,修改基线范围为10-20，重新分析,实例3：基线下滑,基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱,实例4：扩增曲线弯曲,原因：基线设置的终点大于样品CT值。通常是因为模板DNA浓度过高，若CT值15，而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值设定过高。解决方案：减小基线终点设置至最小CT值前4个循环，重新分析数据。,实例4：扩增曲线弯曲,原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀释后另做实验。,实例5-1：直线扩增曲线,部分探针降解后，部分报告荧光基团从探针上脱落导致：基线抬高；扩增与荧光信号的增加不一致。,实例5-2：直线扩增曲线,扩增曲线是一根水平直线说明没有检测到信号，提示实验失败,实例6：非特异性扩增,SYBRGreenI实验，Dissociationcurve分析,推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体补救措施：优化引物浓度和退火温度，专设高温度的收集信号步骤,实例7：重复性不佳,正常的原始数据,实例7：重复性不佳,不正常的原始数据,原因：盖子未盖紧，溶液蒸发。,疾病监测