（微生物学专业论文）高温碱性蛋白酶菌株的选育、酶学性质及脱毛条件的研究.pdf

表格目录 第一章原生质体形成及再生的最佳条件一5 表1 不同时期加入青霉素对原生质体形成的影响8 表2 青霉素和甘氨酸对原生质体形成的影响1 1 表3e d t a 对溶菌酶作用的影响1 3 表4 不同再生培养基及培养方法对s d 一1 4 2 菌原生质体再生率的影响1 4 表5 不同稳定剂对原生质体再生率的影响1 5 第二章诱变株的选育、酶学性质和脱毛条件的研究1 9 表1 蛋白酶活力标准曲线的测定2 7 表2s d 一1 4 2 菌及其原生质体的死亡率2 7 表3u v 处理后再生株突变率2 8 表4u v - n t g 复合诱变部分菌株的t a p 活力2 8 表5 菌株c h 1 7 的遗传稳定性试验2 9 表6p m s f 、e d t a 对c h 一1 7 9 酶活性的搀制作用3 2 表7 金属离子对酶活力的影响3 3 表8d h 值对酶堆置脱毛效果的影响3 5 表9d h 值对有温有浴酶脱毛效果的影响3 6 表1 0n a c l 浓度对酶脱毛的影响。3 8 表n 不同菌株的发酵液脱毛程度比较3 9 t v 图形目录 第一章原生质体形或及再生的最佳条件一5 图1s d 1 4 2 菌的生长曲线8 图2s d 1 4 2 菌对青霉素f u m l ) 作用的敏感性9 图3 青霉素浓度与s d 1 4 2 菌对溶菌酶的敏感性1 0 图4s d 1 4 2 菌对不同浓度甘氨酸的敏感性1 1 图5 酶浓度与s d 一1 4 2 菌原生质体形成率和再生率的关系一1 2 图6 酶解时间与s d 1 4 2 菌原生质体形成率和再生率的关系1 3 第二章诱变株的选育、酶学性质和脱毛条件的研究1 9 图1 酶反应的最适温度3 0 图2 酶作用最适的p h 3 0 图3 酶的热稳定性( p i l l 0 5 ) 3 1 图46 0 。c 酶在c a c l 2 ( o 0 1 m o l l ) 和g l y c i n ( 1 m o l l ) 存在下的热稳定性3 2 图5 酶与各种去污剂及s d s 的相容性和稳定性3 4 图6 酶浓度对脱毛效果的影响3 4 图7 脱毛过程中溶出还原糖含量的变化3 9 v 口h ) i i 大学硕士学位论文 高温碱性蛋自酶菌株的选育、酶学性质 及脱毛条件的研究 研究生李宏 微生物学专业 摘要 指导教师刘成君 以芽孢杆菌s d 一1 4 2 菌为出发菌株，对原生质体制各及再生的各种影响因素 进行了研究。在原生质体形成及再生的最佳条件下制备原生质体，结果发现， s d 1 4 2 菌的原生质体形成率及再生率分别达到了8 6 8 和3 1 3 。并通过光学 显微镜技术，观察了原生质体形成及再生的有关现象。 在原生质体形成及再生的最佳条件下制备s d 1 4 2 菌株原生质体，并对其进 行了复合诱变处理，从大量突变株中筛选出一株稳定，具有较高产量的碱性蛋 白酶产生菌c h 1 7 9 ，其酶活由出发菌株的5 1 6 u m l 提高到2 7 5 9 4 u m l 。 菌株c h 1 7 9 分泌的高温碱性蛋白酶最适反应温度6 0 ，最适酶作用 p h 9 5 。在p h 6 5 1 1 0 范围里，菌株表现出高的，比较稳定的蛋白酶活性。粗酶 液在4 0 水浴中保温2 4 h ，酶活没有改变；6 0 水浴保温3 0 m i n ，酶活保持5 3 4 ； 在c a c l 2 ( o o l m 0 1 l ) 和g l y c i n e ( 1 m o l l ) 存在下，酶的热稳定性均有所提高；若在 g l y c i n e 存在下6 0 水浴保温1 h ，剩余酶活6 0 8 ，延长了酶的半衰期。 四川大学硕士学位论文 菌株c h 1 7 9 高温碱性蛋白酶粗酶液o 1 m l 与1 s d s 等体积混合4 0 温 育1 0 m i n ，剩余5 8 8 酶活；与不同市售洗衣粉( 1 4 9 l ) 等体积混合，4 0 。c 温育 1 h 后酶活力仅有较小损失，体现了其较高稳定性及与去污剂很好的相容性，表 明c h 1 7 9 分泌的高温碱性蛋白酶在洗涤业中可能有应用潜力。 菌株c h 一1 7 ，9 脱毛实验发现，酶液浓度越高，脱毛速度愈快，随着酶液浓 度的降低，脱毛速度明显变慢，脱毛效果出现明显的差异；温度对脱毛效果也 有影响，脱毛温度低于2 5 时脱毛效果差，温度过高，皮革受到的损伤较大。 因此，我们采用菌株c h 1 7 9 发酵液原液在2 8 ，3 0 下进行脱毛。结果显示： 在嘲8 5 曲。5 时，用1 5 0 u g 酶浓度雄置2 4 h ：或p h 9 。5 1 0 5 时，有温有浴酶， 酶浓度2 5 0 u g ，1 8 0 r m i n ，1 2 1 1 脱毛效果最佳。 我们还发现，对有温有浴酶脱毛来说，由于酶在较高温度下并伴有机械挤 压和摩擦，所以酶向皮内渗透快，脱毛迅速，但工艺控制困难，容易造成松面、 毛穿孔或留毛的质量缺陷。相比较而言，堆置法脱毛的操作容易控制，松面、 毛穿孔等质量缺陷也大大减少，但此方法需要较长的时间才能将毛脱下，气味 难闻。同时，实验证明c h 1 7 9 菌株能耐盐、碱，所产生的高温碱性蛋白酶具 有较好的稳定性和脱毛效果，并且有较低的胶原酶活性，控制好条件不会产生 烂皮现象，显示了其适用于皮革工业的性能与前景。 关键词：芽孢杆菌高温碱性蛋白酶原生质体最佳条件诱变酶学性质脱毛 2 【! ；i 川大学顺l 学位论文 b r e e d i n go f t h e r m o t o l e r a n ta l k a l i n ep r o t e a s e p r o d u c i n gs t r a i n ，s t u d yo nu n h a i r i n g p r o c e s sa n d p r o p e r t yo fi t se n z y m e m 硝o rm i c r o b i o l o g y p o s t g r a d u a t el ih o n g t u t o rl i uc h e n g - j u n b a s e do nt h ep r e p a r a t i o no f b a c i l l u ss p s d 一1 4 2 ，w es t u d i e da l lf a c t o r se f f e c t i n g o nf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t s 。u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e r a t e so ff o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t so fs t a i ns d 一1 4 2h a dr e a c h e dt o 8 6 8 a n d3 1 - 3 r e s p e c t i v e l y t h er e l a t e d p h e n o m e n o n o ff o r m a t i o na n d r e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t sw e r eo b s e r v e db yo p t i c a lm i c r o s c o p e u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n , so fp r o t o p l a s t sf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o n , t h e p r o t o p l a s t sf r o mt h ep r i m i t i v es 溉nb a c i l l u ss p s d 一1 4 2w e r ep r e p a r e d a f t e rm a n y t i m e so fc o m p l e xm u t a g e n e t i ct r e a t m e n to fp r o t o p l a s t so fs d 一1 4 2a n ds e l e c t i o nf r o m al o to fm u t a n t so b t a i n e d ，am u t a n tc h 一1 7 - 9w a sf i n a l l yo b t a i n e dw i t hp r o p e r t i e so f h i g h o u t p u t s t a b l ea n dt h e r m o t o l e r a n ta l k a l i n ep m t e a s e t h ee n z y m ea c t i v i t yo f m u t a n tr o s eu pt o2 7 5 9 4 u m la sc o m p a r e dw i t h5 1 6 u m lo ft h ep f i m i t n es t a i n ， b ys t u d y m g o nt h e s u p e m a t a n t o ft h ec u l t u r e f l u i d s ，t h ee n z y m a t i c c h a r a c t e r i s t i c sw e r ec o n c l u d e d t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp hf o rp r o t e a s e a c t i v i t yw a s6 0 。ca n dp h 9 5 i tw a ss t a b l ei nt h ep hr a n g e6 5 1 1 0a n dh a dg o o d t h e r m a ls t a b i l i t y t h ee n z y m er e t a i n s1 0 0 o f a c t i v i t ya f t e r2 4 ho fh e a tt r e a t m e n ta t 4 0 。ca n d5 3 4 o fa c t i v i t ya f t e r3 0 m i na t6 0 。c a d d i t i o no fc a c l 2 ( 1 0 m m ) a n d 3 四川大学硕士学位论文 出y c i n eo m ) ，i n d i v i d u a l l ya n di nc o m b i n a t i o ni m p r o v et h e t h e r m o s t a b i l i t yo f e n z y m e t h ee n z y m er e t a i n e d6 0 8 o fi t sm a x i m u ma c t i v i t ya f t e rl ha t6 0 。ci nt h e p r e s e n c eo fg l y c i u e t h ee n z y m er e t a i n e da b o u t5 8 8 o fi t sm a x i m u l t i a c t i v i t ya f t e r1 0 m i na t4 0 0 c i nt h ep r e s e n c eo fs d s 。t h ee n z y m er e t a i n e dm a i na c t i v i t ya f t e rl ha t4 0 。ci n w a s h i n gp o w d e r ( 1 4 m g m l ) t h e e x t r a c e l l u l a r p r o d u c t i o n o ft h ee n z y m e ，i t s t h e r m o s t a b l en a t u r ea n dc o m p a t i b i l i t yw i t hm o s tc o m m e r c i a ld e t e r g e n t sa l ef e a t u r e s t h a ts u g g e s ti t sa p p l i c a t i o ni nd e t e r g e n ti n d u s t r y w eh a v ea l s os t u d i e dt h ea b i l i t yo f t h ee n z y m ei nu n h a i r i n g ，w h i c hi st h ef o u n d a t i o no ft h ef u r t h e rr e s e a r c h k e y w o r d s ：b a c i l l u ss p ；t h e r m o t o l e r a n ta l k a l i n e p r o t e a s e ；p r o t o p l a s t s ；t h e o p t i m u mc o n d i c t i o n ；m u t a g e n s i s ；e n z y m ep r o p e r t y ；u n h a i r i n g 4 四j 】i 大学颈：e 学位论文 第一章s d 1 4 2 菌原生质体形成及再生的最佳条件 自1 9 5 3 年w e i l b u l l l l 】首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌得到原生质体以来， 原生质体技术已有了很大发展。7 0 年代，s c h a e f f e r 等人成功进行了微生物原生 质体融合以来，原生质体技术就成为工业微生物育种的一种重要手段 2 - 4 1 。但原 生质体融合是两出发菌株基因的随机组合，不能定向进行d n a 重组来改变生物 合成碱性蛋白酶过程中某些关键酶的活性，因此融合株很难大幅度地提高产量。 另外，对双亲株进行遗传标记又要花费许多人力和时间曩有时往往降低亲株 的产量。根据文献报道【5 。9 j ，对原生质体直接进行紫外诱变处理，方法简便、效 果好，能在较短的时间内可大幅度地提高菌种的生产能力，因此这种方法是选 育菌种行之有效的方法。本工作详细地考察了芽孢杆菌s d 1 4 2 菌原生质体形成 和再生的各种因素及最佳条件，为今后的选育工作打下基础。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种 芽孢杆菌s d 1 4 2 ，本实验室保藏菌株。 1 1 2 培养基 完全培养基( c m ) ( w ) 葡萄糖05 蛋白胨 1 0 酵母膏 o 5 n a c 】0 2 5 四川大学硕i 二学位论文 p h 9 5 再生培养基( d m 3 ) 【6 】 琥珀酸钠 水解酪鹭白 葡萄糖 酵母膏 m g c l 2 6 h 2 0 k i - 1 2 p 0 4 k h 2 p o d 3 h 2 0 琼脂 p h 7 3 ，加蒸馏水至1 l 斜面培养基( w ) 蛋白胨 牛肉膏 n a c l 琼脂 p h 9 5 1 1 3 试剂 高渗稀释液( d f ) 1 0 蔗糖 琥珀酸钠 e d t a k 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 9 0 0 5 9 5 o g 5 9 5 9 4 0 6 6 9 1 5 9 3 5 9 2 o 1 - 0 1 0 o 5 2 o o 2 5 m o 2 5 m 0 0 0 1 m 0 0 2 m o 1 1 m 6 四川大学硕l 一学位论文 m g c l 2 p h 7 0 青霉素： 溶菌酶： o 0 1 m 1 磷酸缓冲液配制。 d f 液配制后过滤除菌。 1 2 方法 1 2 1 原生质体的制备及再生【6 】 从新鲜斜面上取1 环菌接入1 0 m lc m 液中，4 0 振荡培养1 0 h ，以1 的 接种量转接到新鲜的1 0 m lc m 液中振荡培养至对数生长中期，同时加入1 玑 甘氨酸，继续培养至对数生长末期。取菌液离心去掉培养液，用d f 液洗涤菌 体两次，然后用d f 液调0 d 值至0 8 左右，用2 9 l 的溶菌酶3 7 。c 静止作用4 h ， 使之形成原生质体。将原生质体离心去掉酶液，悬于d f 液中。经适量稀释后， 涂布于再生培养基上，培养2 4 h ，用活菌计数法求原生质体的形成率和再生率。 计算方法如下： 原生质体的制备率= ( a - b ) a x l 0 0 原生质体的再生率= ( c - b ) ( a - b ) x 1 0 0 a ，b ：溶菌酶处理前后完全培养皿上的菌落数 c ：溶菌酶处理后高渗培养皿上的菌落数 1 2 2 计数观察方法 原菌和原生质体的计数用血球计数板在显微镜下以及平皿上用活菌计数法 进行。 2 结果和分析 2 1s d 一1 4 2 菌的生长曲线 将s d 一1 4 2 菌于c m 培养液中培养不同时间后，用浊度比色法测出其生氏曲 7 删川人学硕士学位论文 线( 如图1 ) 。 0 8 0 7 06 0 5 舍o 4 0 3 0 2 o 1 o o24681 01 2 g h 图1s d 1 4 2 菌的生长曲线 从图1 可以看出：s d 1 4 2 菌的对数生长期为2 1 0 h ，此时菌体的生理状态 比较一致，代谢旺盛。其中对数生长中期为6 h ，对数生长末期为1 0 h ；0 。2 h 为 延迟期，1 0 h 以后进入稳定期。 2 2 青霉素对s d 1 4 2 菌原生质体形成及再生的影响 2 2 1 不同生长期加入青霉素对s d ，1 4 2 菌原生质体形成的影响 在s d 1 4 2 菌的不同生长时期加入青霉素，然后测定其原生质体的形成率， 结果如表1 所示。 注 表1 不同时期加入青霉素对原生质体形成的影响 序号 青霉素加入时划 对数前期( 3 b ) ( )对数中期( 6 b ) ( ) 四川大学硕学位论文 从表1 的结果看出：在对数期的中期( 6 h ) j j h f i , 亚适量的青霉素比对数期前期 f 3 h ) n z ，其原生质体的形成率高，这说明在对数生长中期，菌体的生理状念相 对一致，代谢旺盛，对青霉素的敏感性强，此时加入适量的青霉素作用到对数 生长末期，可以抑制细胞壁的合成，有利于原生质体的形成。 2 2 2 不同浓度的青霉素作用不同时间对s d 1 4 2 菌生长的影晌 当s d 1 4 2 菌4 0 。c 摇瓶培养6 h 时，分别加入不同浓度青霉素作用不同时间， 考查s d 1 4 2 菌对青霉素的敏感性，结果如图2 所示。 1 6 1 2 o 60 8 0 4 0 圜 帆 图2 s d - 1 4 2 菌对青霉素( u m e ) 作用的敏感性 从图2 看出：随着青霉素浓度的增大和作用时间的延长，s d 一1 4 2 菌的敏感 性逐渐增强。当青霉素浓度为1 6 u m l ，作用时间超过4 h 时，丌始出现抑制细 菌生长的趋势。在细菌生长过程中，青霉素可干扰细菌细胞壁的合成，有利于 原生质体的形成，但浓度过高会抑制菌株的生长。从图2 可以看出，青霉素对 s d 一1 4 2 菌作用的亚适量为l 6 u m l 。 为了进一步确定青霉素的浓度与s d 1 4 2 菌对溶菌酶敏感性的影响，我们将 s d 一1 4 2 菌4 0 。c 摇瓶培养6 h 后，分别加入不同浓度的青霉素作用4 h 后，加入 2 9 l 的溶菌酶，3 7 。c 静l r 作用定时间，测其酶解前后菌体的生物量，考查 9 四川大学硕t 学位论文 s d 1 4 2 菌在不同浓度青霉素作用后对溶菌酶的敏感性，结果如图3 所示。 oo 81 6 青霉素( u m l ) 一酶解前的o d + 酶解后的o d 图3 青霉素浓度与s d 一1 4 2 菌对溶菌酶的敏感性 由图3 看出：随着青霉素浓度的增大，s d 一1 4 2 菌对溶菌酶的敏感性逐渐增 强。当青霉素浓度超过1 6 u m l 时，s d 1 4 2 菌对溶菌酶的敏感性更强，但开始 出现抑菌现象。在青霉素的浓度为1 6 u m l 时，既无抑菌现象，又可提高s d 一1 4 2 菌对溶菌酶的敏感性。综合图2 与图3 的实验结果，我们选择青霉素对s d 1 4 2 菌作用的最佳浓度为1 6 u m l ，最佳作用时间为4 h 。 2 3s d 1 4 2 菌对甘氨酸的敏感性 在s d 1 4 2 菌培养至对数生长中期时，加入不同浓度的甘氨酸作用不同的时 间，考查其对甘氨酸的敏感性，结果见图4 。 从图4 可以看出，随着甘氨酸浓度的增大及作用时问的延长，s d 一1 4 2 菌的 敏感性也逐濒增强。当作用时间达到5 h 后，较低浓度的甘氨酸( 如1 - 2 9 l ) 已 经不抑制细菌的生长。这可能是随着细菌的生长代谢，细胞壁里发生的氨基酸 置换效应逐渐达到饱和，低浓度的甘氨酸不但侵入不进细胞壁，反而为其提供 营养所致。综合考虑到青霉素对细胞壁合成的影响，我们选择甘氨酸的浓度为 l g l ，作用时间为3 5 h 。 1 n 删j f i x 学硕士学位论文 1 6 1 2 c 口5 0 8 0 4 0 0 6 图4s d 1 4 2 菌对不同浓度性氨酸的敏感性 2 4 青霉素与甘氨酸对s d 1 4 2 菌原生质体形成的影响 在s d 1 4 2 菌的对数生长中期，加入2 5 u m l 青霉素和l g l 甘氨酸。制备 原生质体后，分别测定原生质体形成率，结果见表2 。 表2 青霉素和甘氨酸对原生质体形成的影响 注：l ，2 ，3 表示重复实验。 从表2 可以看出，单独加入青霉素可显著提高s d 一1 4 2 菌原生质体的形成率 辅以适量的甘氨酸效果更好。 2 5 溶菌酶作用的最佳条件 2 5 1 不同浓度的溶菌酶对s d 一1 4 2 菌原生质体形成率和再生率的影晌 四j 】i 火学硕l 学位论文 当s d 一1 4 2 菌在延滞期和对数中期分别加入适量的甘氨酸和青霉素，4 0 。c 摇 瓶培养1 0 h ，然后加入不同浓度的溶菌酶作用4 h ，测定其原生质体的形成率和 再生率，结果如图5 所示。 擗 删 障 蒋 槎 醴 1 0 0 0 00 511 522 5 溶菌酶( g ，l ) 1 ：s d - 1 4 2 菌原生质体形成率；2 ：s d 1 4 2 菌原生质体再生率 图5 酶浓度与s d 一1 4 2 菌原生质体形成率和再生率的关系 从图5 可见，s d - 1 4 2 菌的原生质体形成率随酶浓度的增加而提高，但再生 率则呈下降趋势。当溶菌酶的浓度为2 o g l 时，s d 1 4 2 菌的原生质体形成率达 8 6 8 ，再生率为3 1 1 3 ，说明在此浓度时，s d 1 4 2 菌对溶菌酶很敏感，原生 质体的形成率很高，再生率也较高，故s d - 1 4 2 菌的酶解浓度选择为2 o g l 。 2 5 2 溶菌酶作用不同时间对s d 一1 4 2 菌原生质体形成和再生的影响 s d 一1 4 2 菌在4 0 。c 下培养1 0 h ，加入2 o g l 溶菌酶分别作用不同的时间，然 后测定其原生质体的形成率和再生率，实验结果如图6 所示。 由图6 可见，s d 一1 4 2 菌原生质体的形成率随酶解时间的延长而增加，而再 生率呈下降趋势，因此选择4 h 为酶作用的最佳时间，此时原生质体的形成率很 高，而再生率也相对较高。 1 2 p q 川人学硬上学位论文 讣 划 睦 僻 蟠 靛 1 【) 0 0 o4 8 时间t ( h ) 1s d 一1 4 2 菌原生质体形成率：2s d 一1 4 2 菌原生质体再生率 图6 酶解时间与s d 一1 4 2 菌原生质体形成率和再生率的关系 在对数生长末期，菌体的生理状态相对一致，对溶菌酶的敏感性强，易于 进行破壁 6 。s d 1 4 2 菌的对数生长末期为1 0 h ，此时加入适量的溶菌酶，破壁 效果很好。 2 5 3e d t a 对溶菌作用效果的影响 s d - 1 4 2 菌在4 0 。c 条件下培养至对数生长末期n o h ) ，分别用0 5 ( w v ) e d t a 预处理以及用e d t a 和溶菌酶同时处理一定时间后，然后测定其原生质体的形 成率，结果如表3 所示。 表3 e d t a 对溶菌酶作用的影响 四川i 大学硕士学位论文 从表3 可见，e d t a 预处理对原生质体形成率影响不明显，但将其与溶菌 酶共同作用时，则可提高原生质体的形成率。 2 6 再生培养基的选择 此课题的目的是为了获得更多的再生菌株，从中选出高产菌株，因此，如 何提高再生率是关键。影响原生质体再生率的主要因素是培养基，我们试验了 几种再生培养基，结果见表4 。 表4 不同再生培养基及培养方法对s d 1 4 2 菌原生藏体再生率的影响 从实验结果可见，以d m 3 培养基为最好，且夹层法比用涂布法再生率提高 了1 0 9 。所以我们选择d m 3 作为再生培养基。 2 7 高渗透压培养基稳定剂对原生质体再生率的影响 将s d 1 4 2 菌的原生质体置于含有相同浓度( 0 3 3 m o l 几) 稳定剂的再生培养基 j ：生长，结果见表5 从表5 可见，琥珀酸钠作为稳定剂时，原生质体的再生率最高；甘露醇和 蔗糖次之，n a c l 效果最差。 l j ：【i 川夫学硕l 学位论文 表5 不同稳定剂对原生质体再生率的影响 稳定剂再生率( ) 琥珀酸钠 蔗糖 甘露醇 n a c l 3 1 3 2 3 6 2 5 ，1 1 9 9 2 8s d 1 4 2 菌原生质体形成和再生最佳条件的综合实验 在以上各实验的基础上，我们做了s d 1 4 2 菌原生质体形成和再生最佳条件 的综合实验：即将s d 1 4 2 菌接种于5 m lc m 中4 0 。c 恒温振荡培养1 0 h ，接种 到新鲜的5 m lc m 中，加l g l 甘氨酸4 0 培养6 h ，再加入1 6 u m l 的青霉素 继续恒温振荡培养4 h ，离心洗涤2 次，加入2 o g l 溶菌酶3 7 。c 静止作用4 h ， 测定其原生质体的形成率和再生率，结果表明：s d 1 4 2 菌原生质体的形成率达 8 6 8 ，再生率为3 1 3 。由此确定s d 1 4 2 菌原生质体形成和再生的最佳条件 为：青霉素的浓度1 6 u m l ，作用时间4 h ：溶菌酶的浓度2 0 9 l 作用时间4 h 。 2 9 原生质体形成和再生的显微观察 将s d 1 4 2 菌及其原生质体制片、染色，于o l y m p u s 显微镜下观察，形态 如版图1 ，版图2 及版图3 所示。由图所示，s d 1 4 2 菌为杆菌；原生质体己完 全脱壁，呈球形；而再生株重新生成细胞壁，恢复为杆状。观察中还发现，s d 1 4 2 菌原生质体往往聚集成团，堆积成串或堆，这可能与其失去细胞壁而粘性增大 或其表面的特殊结构有关。 四川t 夫学硕士学位论文 版图1s d 1 4 2 菌的形态 版图2s d 1 4 2 菌的原生质体形态 版图3s d 1 4 2 菌的原生质体簇 1 6 旧川大学顶i ：学位论文 3 讨论 原生质体技术一般包括原生质体制备、培养、融合、再生和原生质体转化 等等。通过适当的酶处理，除去微生物的细胞壁形成原生质体是原生质体技术 的关键步骤之一，而细胞壁的合成与菌的生理状态有关。由于菌体在对数生长 中期时，生理状态比较一致，代谢旺盛，此时加入青霉素可以抑制细胞壁的合 成。另外，细菌破壁过程中，加入适量的甘氨酸可置换肽聚糖中的丙氨酸残基 而干扰细胞壁的网状结构，从而有利于原生质体的形成。我们的实验结果也与 此一致。值得注意的是：s d 一1 4 2 菌对青霉素耐性比较强，其原因有待于进一步 研究。 在对数生长期，菌体的生理状态相对一致，对溶菌酶的敏感性更强，易于 破壁。为了使破壁效果更好，我们选择在此期加入溶菌酶。但溶菌酶浓度过高、 作用时间过长，虽然原生质体形成率很高，但再生率却较低。综合考虑这两方 面的影响，我们选择原生质体形成率和再生率乘积最大时的条件为溶菌酶作用 的最佳条件。 另外，考虑到e d t a 的去污作用，我们利用它对细菌进行预处理以除去细 胞壁上不利于溶菌酶作用的物质，但实验结果证实这种影响不明显。不过，e d t a 和溶茵酶同时作用还是有利于原生质体的形成。这是因为在细菌的破壁过程中， e d t a 可通过螯合作用促进溶菌酶破坏细胞壁，从而有利于原生质体的形成。 但是，随后我们发现经过e d t a 和溶菌酶同时处理的原生质体，再生率较低， 可能是e d t a 对原生质体的破坏作用造成的。因此做综合实验时，就没用e d t a 对原生质体进行处理。 总之，在原生质体的制备过程中，我们不能忽视影响原生质体形成及再生 的各种因素。 1 7 叫j l 入学嵌：i ：学位论文 参考文献 1 w e i l b u l lc t h ef o r m a t i o n o f p r o t o p l a s t s o fb a c i l l u sm e g a t e r i u m b a c t e r i u l 1 9 5 3 ，6 6 ：6 8 8 - 6 9 5 2 s e h a e f f e rp e ta 1 p r o c n a t l a c i d ，s c i u s a1 9 7 6 ，7 3 ( 6 ) ：2 1 5 1 - 2 1 5 5 3 h o v w o o d p a c ta 1 n a t u r e 1 9 7 7 ，2 6 6 ：1 7 1 4 t 7 0 d o r k ，a l l o r dlp i n e n a t l a c i d s c i u s a 1 9 7 6 ，7 3 ( 6 ) ：2 1 4 7 - 2 1 5 0 5 冯清平，薛林贵兰州大学学报( 自然科学版) 1 9 9 5 ，3 1 ( 3 ) ：1 0 0 - 1 0 6 6 王弘等生物工程学报1 9 9 0 ，6 ( 1 ) ：3 2 - 3 8 7 张克旭等微生物学报1 9 9 1 ，3 1 ( 2 ) ：1 0 8 - 1 1 4 8 常尊学等微生物学通报1 9 9 1 ，3 1 ( 2 ) ：1 0 8 1 1 4 9 李平等菌物系统2 0 0 0 ，1 9 ( 1 ) ：1 1 7 1 2 1 1 0 乔宝义等微生物学报1 9 8 3 ，2 3 ( 1 ) ：3 3 , - 4 - 3 1 1 h a m m ik a n e k o ，k e n j is a k a g u c b i a 鲥cb i o lc h e m 1 9 7 9 ，4 3 ( 5 ) ：1 0 0 7 1 0 1 3 1 8 四川夫学碗一l 学位论文 第二章诱变株的选育、酶学性质 及脱毛条件的研究 碱性蛋白酶最早发现在猪胰脏中，1 9 1 3 年r h o m l l 】首先将胰蛋白酶作为洗涤 浸泡剂使用。后来d r j a g g 2 1 ，h o r i k o s h i 3 1 ，a u n s t m p 【4 】等相继报道了微生物生产 碱性蛋白酶的研究。 碱性蛋白酶广泛用于洗涤剂、制革及丝绸等各种工业，特别是用于生产加 酶洗涤剂，帮助取出血渍、奶渍、汗渍等各种蛋白污垢【5 川。近年来对碱性蛋白 酶的研究更加广泛【8 。”，主要来源于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。目前，由 于市场的需求，酶制剂厂及洗涤剂工业都需要扩大产品品种，并推出耐高温、 耐高碱、性能更好的蛋白酶种类。 制革工业是环境污染大户，其污染源一是来自原料皮上的油脂、肉渣、毛 角蛋白及碎毛，二是制革过程中所用的化工原料，如硫化物、染料及高聚物等。 而且制革污水处理投入高，效果差。因此，制革工业已转向生物技术的应用。 对酶法脱毛工艺的实施国内外都研究得较多，1 9 1 0 年r o h m 发明的脱毛方法叫 做“a r a z y m ”法，是将原料皮经碱膨胀后再用胰酶进行脱毛。随后很多国家的研 究人员对此工艺进行了各种改进。1 9 6 8 年，上海新兴制革厂在国内首先成功的 运用1 3 9 8 、3 9 4 2 两种蛋白酶脱毛，实现了猪皮制革酶脱毛新工艺。然而，虽然 酶脱毛具有可减少废水中硫化物的含量、可回收质量好的毛以及可消除脱灰液 中的软化剂等优点，但由于成本高、酶脱毛后容易造成松面、质量低劣、安全 系数低及烂皮等缺点，限制了其在制革工艺中的运用。因此要使酶法脱毛取代 灰碱法脱毛并使之得以推广应用，关键在于解决脱毛用酶制剂存在的种种问题。 所以目前研究的重点是开发新来源的稳定性好、成本低、耐盐碱的新型脱毛蛋 自酶。 1 9 四川人学颁 ：学位论文 本章对出发菌株s d 一1 4 2 菌进行了原生质体u v 诱变和u v - n t g 复合诱变， 在较短的时间内选育出c h 1 7 9 菌，酶活提高了4 3 4 8 ，达到2 7 5 9 4 u m l ， 并对其酶性质和脱毛条件进行了研究，为进一步的研究开发工作打下了基础。 1 材料和方法 l _ 1 材料 1 1 1 菌种 芽孢杆菌s d 一1 4 2 ，本实验室保藏菌株。 b s u b t i l i sa s l 3 9 8 ，由泸州酶制剂厂提供。 1 1 2 培养基 种子培养基( w ) 葡萄糖 胰蛋白胨 k h 2 p 0 4 m g s 0 4 p h 9 5 斜面培养基( w ，) 葡萄糖 胰蛋白胨 k h 2 p 0 4 m g s 0 4 琼脂 p h 9 5 平皿筛选培养基( w 1 1 o o 5 0 1 0 0 5 1 0 o 5 0 1 0 0 5 1 5 四川人学硕士学位论文 葡萄糖 1 o 胰蛋白胨 o 5 k h 2 p 0 4 0 1 m g s 0 4 o 0 5 琼脂 1 5 灭菌后加入无菌蛋白水解液至终浓度为1 发酵培养基( w ，) 麦芽糖 豆饼粉 麸皮 n a 2 i - i p 0 4 m 龄0 4 c a c l 2 p h 自然 6 o 3 0 3 o o 4 o 0 2 0 0 2 完全培养基( c m ) ( w ) 葡萄糖05 蛋白胨 1 0 酵母膏05 n a c l0 2 5 p h 9 5 再生培养基( d m 3 1 琥珀酸钠 水解酪蛋白 葡萄糖 9 0 0 5 9 5 o g 3 9 四川i 火学颂l 学位论文 酵母膏5 9 m g c l 2 6 h 2 04 0 6 6 9 k h 2 p 0 41 5 9 k h 2 p 0 4 3 h 2 0 3 5 9 琼脂 2 鼢 p h7 3 ，加蒸馏水至1 l 1 1 3 试剂和设备 1 1 3 1 试剂 1 ) 高渗稀释液( d f ) 蔗糖 0 2 5 m 琥珀酸钠 o 2 5 m e d t a0 0 0 1 m k 2 h p o a 0 0 2 m k h 2 p 0 4 0 1 l m m g c l 2 o 0 1 m p h 7 0 2 ) 磷酸缓冲液( p h 7 4 ) 3 1 青霉素：1 磷酸缓冲液配制 4 1 溶菌酶：s i g m a 产品，用d f 液配制 4 1n t g ，酪蛋白：s i g m a 公司产品 6 ) e d t a ，苯甲基磺酰氟化物( p m s f ) ：华美生物工程公司产品 1 1 3 2 设备 1 ) p h s 一2 型酸度计：上海第- 2 分析仪器厂产品； 7 5 2 型紫外光栅分光光度计：上海第三分析仪器厂产品 叫川大学碗】一学位论文 1 2 方法 1 2 a 原生质体的制备及再生 参见第一章。 1 2 2 技术路缓 s d 一1 4 2 _ u v _ l h 2 2 一u v n t g _ c h 1 7 - 热孢子处理一c h 1 7 9 1 2 3 原生质体的紫外诱变处理 制备好原生质体后，用d f 液将其稀释到1 0 4 ，取5 m l 原生质体液加入直 径为9 0 m m 的平皿中。先预热紫外灯3 0r a i n ，然后开启平皿盖，在磁力搅拌下， 分别在紫外灯下处理1 、2 、3 、4m i n ，各取o 1 m l 原生质体液涂再生平皿，4 0 下避光培养。同样，按第一章制成菌液后，在未加溶菌酶前，将菌体分别用生 理盐水和d f 液稀释至1 0 巧，在紫外灯下照射2 0 1 2 0s ，各取o 1 m l 菌液涂完全 平皿，4 0 下避光培养。诱变处理后菌体及原生质体的存活率按下列公式计算。 诱变存活率= ( 诱变处理后原生质体再生率) ( 诱变前原生质体再生率) 1 0 0 选择致死率为8 0 左右的诱变剂量处理样品，梯度稀释后涂再生平皿。 1 2 。4u v - n t g 复合处理 以紫外线诱变获得的正突变株为出发菌株，4 0 。c 培养1 0 h 的菌液，离心去上 清液，用o 0 5 m o i l ，p h 7 4 的磷酸缓冲液洗涤菌体2 次，再用此缓冲液配成 1 0 x 1 0 1 1 c f u m l 的菌悬液，加入n t g 使其终浓度分别为4 0 、1 0 0 、2 0 0 、4 0 叽g m l ， 3 7 。c 水浴处理3 0 m i n ，间歇摇动，离心后去掉含n t g 的上清液，再用磷酸缓冲液 洗涤1 次，重悬在同样体积的缓冲液中，倒入直径为5 c m 的培养皿中，在黑暗中 用紫外灯( 1 5 w ，距离3 0 c m ) 分别照射2 0 s 、3 0 s 、l m i n ，经适当稀释后涂布平板， 4 0 避光培养2 4 h 。诱变存活率计算方法同上。 选择致死率为8 0 左右的诱变剂量处理样品，梯度稀释后涂再生平板。 四川大学硕l 学位论立 1 2 5 筛选方法 1 ) 初筛方法 用牙签从再生平皿上挑去单菌落并点种于鉴别培养基上，4 0 下培养一段 时间后，根据鉴别培养基上水解透明圈与菌落直径比值( 剐c ) 的大小以及双基质 ， 一静散法比较酶活。 2 ) 复筛方法 经初筛后，选取酶活较高的菌株上，接一环到装有l o m l 种子培养基的 l o o m l 三角瓶中，4 0 。c 、1 8 0 r m i n 摇瓶培养l o h 后，按1 0 接种量接种于发酵 培养基中4 5 。c 、1 8 0 r r a i n 摇瓶发酵4 8 h ，取上清液测定酶活。 3 ) 筛选标准 与出发菌株相比，相对酶活姜9 0 的为负突变株；相对酶活耋1 1 0 的为正 突变株；而相对酶活在9 0 一1 1 0 之间的则视为非变异株。 1 2 。6 蛋白酶活力测定 1 2 6 1 试剂和溶液 1 1 福林试剂的制备 于2 0 0 0 m l 磨口回流装置中加入钨酸钠( n a z w 0 4 - 2 h 2 0 ) l o o g 、钼酸钠 ( n a 2 m 0 0 4 ) 2 5 9 、水7 0 0 m l 、8 5 磷酸5 0 r a l 、浓盐酸l o o m l ，小火沸腾回流 l o h ，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂( l i 2 s 0 4 ) 5 0 9 、水5 0 r a l 和数滴 浓溴水( 9 9 ) ，再沸腾1 5 m i n ，以除去多余的溴( 冷后仍有绿色需再加溴水， 再煮沸除去多余的溴) ，冷却，加水定容至1 0 0 0 m l 。混匀，过滤。制得的试剂 应呈金黄色。贮存于棕色瓶内。 使用溶液：1 份福林试剂和2 份蒸馏水混合，摇匀。 四川火学砸上学位论文 2 ) 硼酸缓冲液( p h = 1 0 5 ) 甲液：秤取硼酸钠1 9 0 8 9 ，加水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 乙液：秤取n a o h 4 0 9 ，加水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 使用溶液：取甲液5 0 0 m l 、乙液4 0 0 m l 混匀，用水稀释至1 0 0 0 m l 。 3 、0 4 m o l f l - , n a 2 c 0 3 溶液 秤取n a 2 c 0 3 4 2 4 9 ，用水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 4 、0 4 m o l l 三氯乙酸 秤取无水三氯乙酸6 5 4 9 ，用水溶解定容至1 0 0 0 m l 。 5 10 5 m o