（轻工技术与工程专业论文）木糖乙醇发酵菌种的研究.pdf

摘要 木糖乙醇发酵菌种的研究 摘要 木糖是一种五碳糖，是木质纤维素水解产物中的第二大糖类。如何有 效利用木糖发酵产乙醇是木质纤维素乙醇可行性的决定因素，而高效的发 酵菌株又是解决这一问题关键所在。本论文从木糖乙醇发酵菌种入手，分 别研究了天然可利用木糖的管囊酵母的发酵情况和基因工程酿酒酵母中 木糖异构酶基因的克隆与表达。 本实验对实验室保藏菌种管囊酵母进行了分离筛选，在得到的若干菌 株中经过木糖发酵的初步检测找出发酵性能稳定，产量较高的菌种做发酵 条件的优化。分别从碳源、氮源、营养因子( 纤维素) 、发酵温度、发酵 时间、溶氧、接种量等方面进行全面考察，初步得出了此菌种的摇瓶发酵 最佳条件，乙醇产量从开始3 9 6 9 l 上升到1 5 7 7 9 l ，增长了几乎4 倍， 达到理论产量的6 8 9 。再通过定向驯化得到发酵性能稳定的菌株并测定 了此菌株的生长曲线。 实验还进行了大肠杆菌中木糖异构酶基因的克隆和表达。以实验室保 藏的大肠杆菌基因组d n a 为模版，根据g e n b a n k 中已报道的木糖异构酶 基因设计引物，通过p c r 的方法从大肠杆菌中扩增出预期的1 4 k b 左右 的特异性产物。利用t - a 克隆技术，将p c r 产物连接到p m d l 8 t 载体上， 构建重组质粒p m d l 8 一t - x y l a 。经测序后，通过n c b i 网站上的b l a s t 分析， 北京化t 人学颀i j 学位论文 结果表明该序列与g e n b a n k 中记载的大肠杆菌x y l a 基因同源性为9 8 。 以e c o r i h i n d i i i _ 又2 酶切，经测序正确的重组质粒p m d l8 t - x y l a 表达载 体p y e s ，并将纯化后的x y l a 连接至p y e s ，构建表达载体p y e s x y l a 并 成功得到阳性克隆菌。 关键词：木糖，乙醇，管囊酵母，基因工程，酿酒酵母 摘要 r e s e a r c h e so ft h es t r a i n sf o re t h a n o l f r e m e n t a t i o no fx y l o s e a b s t r a c t x y l o s ei s ak i n do fp e n t o s e ，w h i c hi st h es e c o n dm o s ts u g a ri nt h e h y d r o l y s a t eo fli g n o c e ll u l o s e h o wt of e r m e n tx y l o s et oe t h a n o le f f i c i e n t l yi s t h e k e yf a c t o rw h i c hd e c i d e st h ef e a s i b i l i t yo fe t h a n o lp r o d u c t i o nb y l i g n o c e l l u l o s e ，a n df i n d i n go u tae f f e c t i v es t r a i ni st h em o s ti m p o r t a n tp a r tf o r t h ep r o c e s s i nt h i se x p e r i m e n t ，t w oa s p e c t sw e r es t u d i e d ，o n ei sa b o u tt h e n a t u r a lx y l o s e - u s i n gp a c h y s o l e n t a n n o p h i l u sa n dt h e o t h e ri sa b o u tt h e c o n s t r u c t i o no fe n g i n e e r i n gs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew h i c he x p r e s st h ex y l a g e n ef r o me c o l i p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u sf r o mo u rl a b o r a t o r yw a sf i r s t l ys e p a r a t e da n d s e v e r a ls t r a i n sw e r eo b t a i n e d a uo ft h e mw e r et e s t e di nt h e p u r ex y l o s e f e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dt h eb e s to n ew a ss e l e c t e df o rt h ef u r t h e rs t u d y t h e o p t i m u mc o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o ni ns h a k e f l a s kw e r eo b t a i n e df r o mt h e a s p e c t so fn i t r o g e n ，c a r b o n , t i m e ，d i s s o l v e do x y g e n ( d o ) ，v i t a m i n sa n d i n o c u l u m s s i z e ，t h ee t h a n o lp r o d u c t i o ni si n c r e a s e df r o m3 9 6 e e lt o 15 7 7 l ，4 一f o l d st h a nt h ei n i t i a ls t r a i na n d6 8 9 o ft h et h e o r e t i c a ly i e l d t h e e v o l u t i o n a r yc u l t u r ew a su s e dt os t a b i l i z et h ef e r m e n t a t i o np r o p e r t ya n dt h e g r o w t hc u r v ew a so b t a i n e d c l o n ea n de x p r e s s i o no fx y l ag e n ef r o me c o l ii nt h es a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ew e r es t u d i e d e c o l ig e n o m ed n aw a ss e ta st h et e m p l a t e ，d e v i s i n g t h ep r i m e ra c c o r d i n gt ot h ex y l ai nt h e g e n b a n k ，p r o d u c to f1 4 k bw a s o b t a i n e dw i t ht h em e t h o do fp c r p l a s m i do f p m d 18 - t - x y l aw a sc o n s t r u c t e d w i t ht - ac l o n e a f t e rs e q u e n c i n g ，t h er e s u l t sw e r et h es a m ea s9 8 i nt h e g e n b a n k t h ep l a s m i d so fp m d18 一t - x y l aa n dp y e sw e r ed i g e s t e dw i t h r e s t r i c t i o ne n z y m ee c o r ia n dh in d l i i s e p a r a t e l y , a n dt h ep r o d u c t i o nw a s l i n k e da f t e rp u r i f i c a t i o n t h ep o s i t i v es t r a i n sw i t hp y e s x y l aw e r eo b t a i n e d a f t e rs c r e e n i i i 北京化t 大学硕l ：学位论文 k e y w o r d s ：x y l o s e ，e t h a n o l ，p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ，g e n e e n g i n e e r i n g ， s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e i v 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。 作者签名：丛垒盘 日期： 丝! 芝= 二2 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大 学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可 以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名： 导师签名： e l 期：碰 芝二占：呈 日期： 冱理。主二，! 第一章绪论 第一章绪论 1 1木质纤维素乙醇发酵简介 1 1 1 木质纤维素 木质纤维素由三种聚合物组成：纤维素、半纤维素和木质素，由于气候条件 和地理位置的不同，三种组成成分会有所差异，其中纤维素占3 3 5 1 ，半纤 维素占1 9 3 4 ，木质素占2 0 一3 0 ，部分木质纤维素组成如表1 1 所示。 表1 - 1 部分木质纤维素的化学组成 t a b l e1 - 1c h e m i c a lc o m p o s i t i o no fs o m e1 i g n o c e l l u l o s i cb i o m a s s 纤维素是d 一葡萄糖以p 1 ，4 糖苷键组成的大分子多糖，是木质纤维素中含 量最多的物质，分子量约5 0 ，0 0 0 一- 2 ，5 0 0 ，0 0 0 ，相当于3 0 0 - - 15 ，0 0 0 个葡萄糖基脱 水葡萄糖，其分子式为( c 6 h l 0 0 5 ) 。，由于来源的不同，纤维素分子中葡萄糖残 基的数目，即聚合度在很宽的范围，其化学组成含碳4 4 4 4 、氢6 17 、氧 4 9 3 9 。这种连接方式使纤维素的近乎所有羟基及其它含氧基团，都同其分子内或相 邻的分子上含氧基团之间，形成分子内和分子链之间的氢键。这些氢键使很多纤维素 北京化t 人学顾i ：学位论文 分子共同组成结晶结构，并进而组成复杂的基元纤维、微纤维、结晶区和无定型区等 纤维素聚合物的超分子结构。纤维素的特殊结构使纤维素酶分子很难靠近纤维素分子 内部的糖苷键进行有效的反应。纤维素的结晶部分比非结晶部分难分解得多。 半纤维素是木质纤维素的第二大组成成分，是由几种不同类型的单糖构成的异质 多聚体，这些糖包括五碳糖( d 木糖，l 阿拉伯糖) 和六碳糖( 甘。露糖，半乳糖等) ， 有些植物中还包括其他的糖类如果糖等。木聚糖和葡甘露聚糖是两种重要的半纤维 素，其中木聚糖的含量最大，是细胞壁中的第二大类物质，其水解产物以木糖为主， 因此如何有效利用木糖发酵产乙醇具有非常重要的意义【l 】。 木质素是由四种醇单体( 对香豆醇、松柏醇、5 羟基松柏醇、芥子醇) 形成的一 种复杂酚类聚合物，是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用，它不能 由微生物发酵生成乙醇，而且他的水解产物多为发酵抑制剂，不利于木质纤维素乙醇 的发酵。 1 1 2 乙醇 乙醇是一种重要的发酵产品，广泛地应用于国民经济的许多部门：在食品工业中， 乙醇是配制各类白酒、果酒、葡萄酒、露酒、药酒和生产食用醋酸及食用香精的主要 原料；它也是许多化工产品不可缺少的基础原料和溶剂，利用乙醇可以制造合成橡胶、 聚氯乙烯、聚苯乙烯、乙二醇、氯乙醇、二氯乙烷和乙基苯等大量化工产品；它是生 产油漆和化妆品不可缺少的溶剂；染料生产，国防工业等其他工业部门也需要大量的 乙醇。 2 0 世纪7 0 年代的石油危机及当今世界对能源需求的急剧增长，加快了人们寻找开 发燃油替代能源的步伐。作为传统的生物发酵产品和潜力巨大的燃料，乙醇已被公认 为是最有发展前景的可再生清洁能源之一。燃料乙醇作为石油的替代品，因其从可再 生资源发酵得到。且按合适的比例加入汽油中，会提高汽油的辛烷值，降低汽车尾气 中一氧化碳和碳氢化合物的排放，减少对环境的污染，越来越受到广泛的重视。 从减少温室气体排放和环境保护角度出发，欧盟国家已建议生物燃料的使用到 2 0 0 5 年要占整个运输燃料消耗的2 ，而至w j 2 0 1 0 年，这一数值要到达5 7 5 。 我国在“十五”规划中也制定了发展燃料乙醇的规划。规划方案分为三步：第一步先 在吉林、河南、黑龙江等省以玉米为原料生产燃料乙醇，并作为含氧添加剂在汽油中 掺入1 0 ，这一目标已初步实现；第二步在有条件的省区利用当地优势资源( 如早籼稻、 甘薯和甘蔗等生产燃料乙醇) ；第三步就是利用植物秸秆、稻壳等纤维素生产燃料乙醇， 并全面推广。 2 第一章绪论 1 1 3 木质纤维素乙醇发酵现状 木质纤维素乙醇与传统的糖蜜或是淀粉质乙醇相比具有许多优势： 1 ) 木质纤维素的来源非常广泛，如生长速度较快的树木、草、工业副产品、水 生植物、生产废物( 包括农业、造纸业和林业) 、市政以及工业废品，所有的这些都 可以作为木质纤维素的来源，原料的充足很大程度上确保了能源的供应1 2 j 。 2 ) 木质纤维素属于非粮作物，这样就不会引起因乙醇生产导致粮食供应不足。 尽管如此，至今没有达到工业化生产水平，目前大多数的乙醇生产仍以粮食作物为原 料，随着世界人口增长带来的粮食危机和对乙醇需求的不断增加，这种生产方法已经 不再适用，而木质纤维素乙醇的优势便更为突出，是未来乙醇生产的趋势【3 】。 木质纤维素乙醇的生产工艺流程与淀粉质乙醇是相似的，如图所示，包括原料的 液化，糖化，发酵以及乙醇分离等工艺【3 1 。 同收用于燃料术质素 图1 1 木质纤维素乙醇发酵基本流程 f i g 1 1p r o c e s s o fe t h a n o lf e r m e n t a t i o no fl i g n o c e l l u l o s e 木质纤维素乙醇生产过程的第一步是原料的粉碎预处理，而后是用酶或酸水解其 中的纤维素和半纤维素并释放单糖，释放出的单糖用细菌、丝状真菌或是酵母菌发酵 产生乙醇，其中糖化和发酵两个过程可以用一部完成，成为同时糖化发酵法。通过最 后的分离纯化后，得到产物乙醇，可用于燃料。一部分剩余的木质素可为整个过程提 供燃料，也可以生产一些附加值更高的产品，这也可以成为以后的一个发展方向。 3 北京化t 人学硕i ：学位论文 木质纤维素乙醇发酵同时也具有自身的一些特性和一些亟待解决的难题： 1 ) 木质纤维素是一种混合物，由纤维素、半纤维素和木质素组成，首先需要把 木质纤维素原料进行液化，而节能高效的液化方法是第一道难题； 2 ) 木质纤维素的水解产物是由六碳糖( 葡萄糖) 和血碳糖( 木糖、阿拉伯糖) 组成的混合物，同时还存在大量的杂质，这些杂质可能来自于糖液化化过程中生成的 物质或是木质纤维素中原有的物质，这些杂质可能对后续的发酵过程产生抑制，因此 寻找底物广泛，发酵抑制物敏感度差的菌株是第二道难题； 3 ) 在整个生产过程中需要耗费大量的能量，从能量的输入和输出的角度考虑， 最后得到的乙醇产生的能量要小于生产中的耗费，入不敷出，因此高效节能的生产工 艺是第三道难题； 4 ) 由于木质素不能在发酵过程中转化为乙醇，如何高效回收并利用副产物木质 素是第四道难题【引。 1 2 微生物戊糖代谢机理 微生物对戊糖的代谢是从对戊糖的摄入开始的，在酿酒酵母中戊糖的运输是通过 己糖的运输系统来完成的，而且己糖的运输效率要比戊糖高出一到两个数量级。因此， 戊糖的摄入曾被认为是戊糖乙醇发酵的限速步骤。研究表明，戊糖的运输对戊糖的利 用效率以及乙醇的生成有重要影响，h a m a c h e r t 】等人敲除1 8 个己糖运输基因后，菌株 不能在纯木糖培养基上生存，通过对此菌株再次引入糖运输蛋白的研究发现，h x t 4 、 h x t 5 、h x t 7 和g a l 2 对戊糖的运输至关重要。 木糖进入微生物体内以后根据菌株类型的不同有两种不同的途径： 1 ) 酵母及丝状真菌的木糖代谢途径是木糖通过细胞膜上的葡萄糖运输系统进入 茵体细胞后，首先在依赖n a d p h 的木糖还原酶( x y l o s er e d u c t a s e ，x r ) 作用下还原木 糖为木糖醇，随后在依赖n a d + 的木糖醇脱氢酶( x y l i t o ld c h y d r o g e n a s e ，x d h ) 作用下氧 化生成木酮糖。木酮糖经过木酮糖激酶( x y l u l o k i n a s e ，x k ) 磷酸化生成5 磷酸木酮糖， 可以进入磷酸戊糖途径( p p p ) ，最终以中间产物6 磷酸葡萄糖和3 磷酸甘油醛进入糖 酵解途径生成乙酣5 1 。 2 ) 细菌的木糖代谢途径是通过木糖异构酶( x y l o s ei s o m e r a s e ，x i ) 直接转化木糖 形成木酮糖，随后在木酮糖激酶的作用下形成5 一磷酸木酮糖进入p p p 途径，但与p p p 途径偶联的是e d 途径，通过e d 途径产生乙醇【扪。 酵母代谢己糖和戊糖成酒精的总反应式如下： c 6 h 1 2 0 6 - - 2 c 2 h 5 0 h + 2 c 0 2 i o c s h l o o s - - * 1 5 c 2 h s o h + 2 0 c 0 2 由于酵母代谢戊糖的途径比代谢葡萄糖复杂得多，在代谢过程中部分戊糖没有转 4 第一章绪论 化成乙醇而进行辅酶n a d p h 的合成或转化成其它副产物，因此，酵母代谢戊糖的理 论转化率为0 4 6 9 g ( 乙醇糖) ，低于己糖乙醇发酵理论转化率0 5 1 9 g ( 乙醇糖) 。 2 ，l 核酮糖棚甲酸 ：竺墨n a d h 上 2 1 卜 l 木酮糖d 木酮糖5 一磷酸 图1 2d 木糖和l 阿拉伯糖代谢机理【3 1 f i g 1 - 2m e c h a n i s mo fg l y c o m e t a b o l i s mo fd - x y l o s ea n dl - a r a b i n o s e 1 1 1 2 l ，醛糖木糖还原酶( g r e 3 x y l l ) ；1 - 1 1 9 ，木糖醇脱氢酶( x y l 2 x y l 2 ) ；2 7 1 1 7 ，木酮糖激酶( x k s i x y l 3 ) ； 5 - 3 1 5 ，术糖异构酶( x y l a ) ；1 1 1 1 2 ，阿拉们糖醇4 一脱氧酶( 1 a d l ) ；1 1 1 1 0 ，l - 木酮糖还原酶( 1 x r l ) ；5 3 1 4 ，l - 阿拉伯糖异构酶( a r a a ) ；2 7 1 1 6 ，l 广核酮糖激酶( a r a b ) ；5 1 3 4 ，l - 核酮糖5 磷酸4 异构酶( a r a d ) ；p p p 戊糖磷 酸途径； e de d ：途径 1 3 戊糖乙醇发酵菌种的研究现状 木质纤维素乙醇发酵菌株必须能够发酵所有的单糖，此外，还要对潜在的抑制物 不敏感。现有的戊糖发酵菌株包括细菌、酵母和真菌，每一种微生物都有自身的优势 和劣势，如表1 2 所示。 几十年来，借助于现代基因技术，很多实验室都在寻找构建出能利用所有单糖的 微生物 4 0 , 4 2 】。这些方法可以分成两个方面：一是构建底物广泛的微生物，二是提高微 生物碳代谢中关键酶的活性使之尽可能的流向生成乙醇的方向。第一种方法致力于构 建好的乙醇基因工程菌，包括引入木糖或阿拉伯糖的代谢途径；第二种方法从底物广 泛的菌种出发，引入转化途径。 团 a ， 埔 - d 一、 即 x 北京化t 人学硕i ：学位论文 表l - 2 各种类型微生物发酵产乙醇情况对比【删 t a b l e1 - 2c o m p a r a t i o n so fd i f f e r e n tt y p e so fm i c r o o r g a n i s m sf o re t h a n o lf e r m e n t a t i o n 1 3 1 细菌 自从f r e d 5 3 】等人对乳酸杆菌的研究后，才知道有些细菌是可以发酵戊糖的。如今， 戊糖发酵细菌已经包括许多天然细菌和基因工程细菌，其中一些可用于同时糖化发酵 的方法生产乙醇。但它也有自身的限制，就和乳酸发酵类似，细菌产生的发酵产物种 类较多，而且对乙醇的耐受度很差，这使发酵变得十分困难。同时，细菌发酵的乙醇 产量也十分有限，以下列举几个典型的也是比较重要的乙醇发酵菌。 酵母菌可以很好的利用丙酮酸脱羧酶( p d c ) 乙醇脱氢酶( a d h ) 系统代谢六 碳糖产乙醇，但是只有一小部分细菌拥有p d c a d h 系统，其中，运动假单胞菌的 p d c - a d h 系统最为活跃，因此，很多的基因工程细菌就是把运动假单胞菌中的丙酮 酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因转移到宿主菌种以提高细菌代谢乙醇的能力。 6 第一章绪论 e m p e d 乙醇 d h l d h 乙酸h 2 c 0 2 、乳酸 c 0 2 1 - 3 细菌发酵产物示意刚4 l 】 f i g 1 3s k e t c hm a po ff e r m e n t a t i o np r o d u c t i o nb yb a c t e r i a a c k p t a ，乙酸激酶磷酸转乙酰酶；a l d h ，乙醛脱氧酶；f h l ，甲酸氧裂解酶；p d h ，丙酮酸脱氧酶；t c a ， 三羧酸循环；p f l ，丙酮酸甲酸裂解酶；l d h ，乳酸脱氢酶；a d h ，乙醇脱氢酶；p d c ，丙酮酸脱羧酶 1 ) 大肠杆菌 如今，对细菌乙醇发酵菌种的研究很大程度上都集中在大肠杆菌上，对于乙醇的 生产这是一个很具有潜力的宿主菌：首先，它可以利用几乎所有的木质纤维素水解物 中的单糖，包括葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖，并且可以快速生长；其 次，在有氧或是无氧的条件下，它都能耐受水平很高的糖代谢流；最后，它的乙醇耐 受度较好，至少可以达到5 0 l 【4 。 c h e n 4 3 】等通过非基因工程的方法获得一株大肠杆菌s z a 2 0 ，经过三个月的进化培 养得到突变株k c 0 1 ，此菌株丙酮酸脱羧酶活性增加了1 0 0 ，细胞生长速率增长了 2 3 ，乙醇产量增长了6 5 ，耐受度提升了2 倍。这使得大肠杆菌k c 0 1 在5 0 9 l 木糖发 酵培养基中乙醇产量达至u 2 3 9 l ，为理论产量的9 0 ，这主要归功于乙醇耐受度的提高。 r o z a n o v 3 7 】等将大肠杆菌k 1 2 q h 的木糖异构酶基因通过质粒转移到大肠杆菌b l 2 1 中去，得到的重组大肠杆菌木糖异构酶的产量增加，占总蛋白的9 0 。经过亲和层析 纯化后，得到了纯度高达9 0 的酶制剂。 2 ) 产酸克雷伯菌 k a z y y o s h i 3 8 1 等人将运动假单胞菌的基因在产酸克雷伯菌中表达，使原有菌株发 一7 北京化丁人学顾i j 学位论文 酵产乙醇能力大为提高。最终的乙醇产量高达4 0 9 l ，乙醇得率为0 4 8 9 , 醇儋木糖和 0 5 0 9 乙醇葡萄糖，接近了理论产值。两种糖的每小时最大消耗量为2 9 l 。这比先前 报道的在大肠杆菌中表达运动假单胞菌的产量整整高出2 倍。 3 ) 运动发酵单胞菌 运动发酵单胞菌也可以利用木糖产乙醇，是天然的乙醇发酵菌，而且它的发酵能 力可以和酵母相媲美。它具有很多发酵特性适于乙醇生产：乙醇产量高，生产速率快， 可在低p h 条件下生长和较高的乙醇耐受度。在葡萄糖培养基中，运动发酵单胞菌的乙 醇产量可达到1 2 ( w v ) ，是理论产量的9 7 。与酵母相比，产量高出5 - 1 0 ，体积 产量提高了5 倍。这种提高是由于发酵过程中生物量的减少，这是由可利用a t p 的限制 达到的【4 。 a l t i n t a s 5 】等人在运动发酵假单胞菌中表达了乙醇代谢中的4 种异源酶用于提高乙 醇产量，并且建立了一套完整的动力学模型来研究不同酶的浓度对最终乙醇产量的影 响，对结果进行了合理的推测，得出当木糖异构酶和转醛酶活性最高时乙醇产量最大 的结论。 1 3 2 真菌 真菌中发酵木糖产生乙醇的菌较少，研究也不多。目前的研究主要集中在尖镰孢 菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 及粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 。w e n e 5 6 】等分离出一株 f u s a r i u mo x y s p o r u ma n l 2 2 7 6 0 ，2 木糖溶液中乙醇最大浓度为8 2 l ，产量为0 4 1 g 。这类菌的生长发酵较慢，在发酵过程中受芳香类物质及木质素的抑制，可通过加 大接种量、选育抗抑制物的菌株等方法来解决。但是，上述两类菌自身可产生纤维素 酶及半纤维素酶，又具有发酵戊糖和己糖为乙醇的能力，可使天然纤维原料的利用工 艺大大简化，降低生产成本，因此是一个不可忽视的研究方向m 】。 张潇【5 2 】等研究了一株粗糙脉孢菌n e u r o s p o r ac r a s s aa s3 1 1 6 0 2 发酵木糖产乙醇的 能力。主要对培养基初始p h 值和发酵中不同通氧条件进行了考察，结果表明在适宜 的通氧量和初始p h 值下，菌株具有较强的发酵木糖产乙醇的能力，同时还发现葡萄 糖的存在会抑制木糖的利用和乙醇的产量。 u e n g t 。7 】等人对几株毛霉菌和镰胞菌的纤维素发酵进行了研究，发现这两种菌可以 利用多种糖类和糠醛生成乙醇，包括d 葡萄糖，五碳糖和木糖醇。其中毛霉菌可以发 酵糖蜜中的半纤维素产乙醇，但是镰胞菌f 5 不可以。在发酵过程中，d 葡萄糖首先 被耗尽，而后是d 木糖和l 阿拉伯糖。毛霉菌发酵时会产生少量的木糖醇，推测是 醛糖还原酶催化木糖的结果。对于五碳糖的发酵，d 木糖是最佳的底物。l - 阿拉伯糖 和d 邛可拉伯醇做底物时只有少量乙醇生长，d 邛可拉伯糖和l 阿拉伯醇为底物不能生 第章绪论 产乙醇。 p a n a g i o t o u 4 0 1 等人利用尖孢镰刀菌发酵木糖与葡萄糖的混合物产乙醇，条件为厌 氧批式发酵。在厌氧条件下木糖的消耗收到限制同时产生了大量的木糖醇。当通入适 量的氧气时木糖消耗提高了9 5 ，木糖醇产量下降，乙醇产量从开始的0 9 6 m o l m o l 上 升到1 5 2 m o l m o l 。这是由于在半厌氧的条件下提高了整个乙醇代谢能力。 1 3 3 酵母菌 k a r c z e w s k a 4 5 1 早在1 9 5 9 年就报道了有些酵母可以转化木糖生成乙醇，虽然许多已 知酵母都可以同化木糖，但是这些发现并没有引起人们重视。直到w a n g 【4 6 】等人在1 9 8 0 报道了酿酒酵母和粟酒裂殖酵母可以发酵木糖产乙醇之后，才引起了人们重视。很快， s c h n e i d 0 4 7 1 等人和s l i n i n g e r l 4 8 1 等人分别报道了管囊酵母也可发酵木糖产乙醇。g o n g 4 9 】 等人报道了一株突变的假丝酵母可代谢木糖产乙醇，在此同时j e f f r i e s 等人报道了假丝 酵母须在厌氧条件下转化木糖生成乙酣3 9 】。大量报道表明许多菌株可以发酵木糖，但 只有三类酵母的乙醇产量较高，也就是我们现在所熟知的，也是研究最为广泛的管囊 酵母，毕赤酵母和假丝酵母，部分结果如表1 3 所示。 在过去的几十年中对毕赤酵母的研究报道比较多，包括利用基因工程的方法对代 谢途径进行修饰，例如木糖利用中对氧气的依赖；呼吸系统和发酵系统共存促进菌株 生长和产物生成。毕赤酵母可以在有氧条件下快速生长，但不产生乙醇，只有在限制 氧的情况下才能发酵木糖产乙醇，但是这会影响菌株的生长【4 。 由于本实验第二章部分主要介绍了管囊酵母的木糖乙醇发酵情况，因此这里主要 介绍一下对管囊酵母的研究。 b r a v o 9 】等人研究了初始的木糖浓度和酵母膏浓度对管囊酵母批式发酵的影响，通 过正交实验得出了发酵最适条件，初始木糖浓度为2 5 l ，酵母膏为4 l ，此时管囊 酵母的比生长速率为0 2 6 h 一，菌体增长浓度0 0 2 3 9 l h ，乙醇得率为0 3 4 9 g 木糖。 z h a o 1 0 】等通过改变培养基中木糖和葡萄糖的比例，得到了管囊酵母1 7 7 1 发酵木 糖产乙醇的最佳碳源组合，提高了木糖发酵能力，并发现葡萄糖的存在会抑制木糖的 代谢。 s f i n c h e z 8 】等研究了发酵温度对两株管囊酵母k 2 3 8 和k 3 1 3 的影响，找到了两株 菌株各自的最适发酵温度，使乙醇浓度达到o 3 9 g ( 乙醇木糖) ，较大程度提高了乙 醇的生成。 9 北京化丁人学硕f ：学位论文 表l - 3 天然木糖利川酵母发酵木糖产乙醇的比较 t a b l e1 - 3c o m p a r a t i o no fn a t u r ex y l o s e f e r m e n t e dy e a s te t h a n o lf e r m e n t a t i o no fx y l o s e y c 乙醇产量；y 。术糖醇产量；q p ，。最大乙醇体积产率；。最人比乙醇产率；a ，有氧；a n ，厌氧；l ，限 氧；m i c r o ，微好氧；s a ，半好氧；n s ，未提到 l o 第一章绪论 1 3 4 基因工程酿酒酵母 酿酒酵母是乙醇发酵的高效菌株，它町以很好的利用六碳糖，包括葡萄糖，甘露 糖和半乳糖，乙醇产量高，对发酵抑制物耐受力强。虽然天然的酿酒酵母可以在较低 p h 条件下良好生长，但并不能利用木糖，却可以利用木糖的同分异构体木酮糖。虽然 已经有报道一些酵母菌可以代谢木糖产乙醇，但是乙醇的产量和产速和葡萄糖相比还 比较低，因此，基因工程技术是得到理想酵母菌的最佳手段之一【2 6 2 9 1 。 迄今为止，对于酿酒酵母代谢工程的研究已经有大量的报道 z o , 5 0 ，很多综述性质 的文章都对酿酒酵母木糖代谢工程的现状以及存在的问题进行了较为详尽的阐述，其 中对酿酒酵母基因工程的改造主要包括了一下几个方面： 1 ) 通过对酿酒酵母糖运输系统的研究，找到编码糖运输蛋白的基因并对其进行 超表达，从而提高木糖的摄入能力和乙醇的产量。 2 ) 是引入可将木糖代谢为木酮糖的关键酶，包括天然可利用木糖酵母( 如毕赤 酵母) 中的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶和细菌中的木糖异构酶， 3 ) 加强产乙醇代谢途径的关键酶的活性，包括木酮糖激酶以及磷酸戊糖途径中 非氧化还原部分的四种酶【2 引。 通过这些基因的改造，使得酿酒酵母获得了代谢木糖的能力，但同时也存在很多 亟待解决的问题，使得这一技术还停留在实验室阶段而不能实现工业化的生产。 k a t a h i r a 6 j 等人在带有木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的酿酒酵母中超表达了毕赤酵 母编码糖运输的基因s u t l ，目的是提高酿酒酵母对培养基中木糖的摄入量，提高木 糖的利用效率进而提高乙醇产量。结果表明，s u t l 的高效表达提高了木糖的摄入能 力和乙醇的产量，同时也促进了葡萄糖的代谢和乙醇产量。在葡萄糖木糖混合培养基 中乙醇产量达n o 4 4 9 g 糖。 毕赤酵母的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶是用于酿酒酵母的最常用的双酶系统【3 2 1 。 依赖于n a d + 的木糖醇脱氢酶的应有受到限制因为木糖还原酶的辅酶是 n a d p h 2 1 - 2 4 , 2 7 , 3 1 , 3 5 , 3 6 】，这种情况导致了木糖醇的生成进而减少了乙醇的产量。毕赤酵 母的双酶系统可以通过改变其中一种辅酶而达到辅酶平衡。b e n g t s s o n t 5 4 】等人用基因修 改等方法得到了突变的木糖还原酶，同时对乙醇代谢中的其他关键酶基因进行了过量 表达，包括木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶、戊糖磷酸途径非氧化还原部分的四种关键酶 同时删除了编码醛糖还原酶基因的g r e 3 。所有的操作都是把相关基因植入酿酒酵母 基因组中以保证遗传的稳定性。考察三种来源的木糖还原酶基因，包括毕赤酵母 k 2 7 0 m 和它的突变体以及假丝酵母，并对重组菌株进行木糖厌氧发酵测试，结果表明 带有突变木糖还原酶毕赤酵母k 2 7 0 r 的乙醇产率达n o 3 9 9 g 木糖，木糖醇产量0 0 5 9 g 木糖，木糖消耗速率为0 2 8 9 h ，其发酵培养基中为1 0 9 l 的葡萄糖$ 1 1 0 9 l 的木糖。这 表明突变木糖还原酶改变了其原本的辅酶特性，得到了较高产量的乙醇和较少的木糖 北京化t 人学顾1 j 学位论文 醇。 由于细菌代谢木糖是通过一部反应来实现的，这样不会引起双酶系统由于辅酶因 子不同而引起的氧化还原失调，因此，把细菌中的木糖异构酶引入到酿酒酵母中是解 决这一问题的又一种有潜力的方法，科学家也对此做了大量的报道 2 5 , 3 3 】，但由于这种 酶来自于细菌，属于原核生物的酶，在酵母中的表达后出现了加工的不正确，产生包 涵体或是检测不到酶活性，t h e r m u st h e r m o p h i l u s 中的木糖异构酶是第一个可以在酵 母中检测剑活性的木糖异构酶f 3 训，对这种的菌的研究也有大量的报道，w a l f r i d s s o n ”j 等人将t h e r m u st h e r m o p h i l u s 的木糖异构酶基因表达到酿酒酵母中，在8 5 摄氏度时测得 酶的活性为1 0 u m g 。而后又发现在瘤胃动物瘤胃中的瘤胃真菌具有和细菌代谢木糖 途径相同，这对于解决由细菌来源木糖异构酶引起的问题提供了很大的帮助。 k u y p e r l l 4 椰1 等人将真菌p i r o m y c e ss p e 2 1 2 ，1 9 1 中的木糖异构酶转移到酿酒酵母中，并对 酿酒酵母宿主菌进行了一系列的基因改造，而后又进行了进化培养等，最后得到的菌 株乙醇发酵能力大大提高，但还不能达到工业化水平。m a d h a v a i l 【1 8 】等人利用另一种瘤 胃真菌o r p i n o m y c e s的木糖异构酶，对其c d n a 进行序列分析，并在酿酒酵母中表达， 破碎酵母细胞后检测到了较高活性的木糖异构酶。酶的最佳作用p h 值为7 5 ，最佳温 度为3 7 ，这与以前报道的嗜热木糖异构酶的作用温度大为降低，和酿酒酵母的生长 温度相符。 k a r h u m a a 1 3 】等人将以上提到的两种基因工程方法进行了比较，即来自毕赤酵母的 木糖还原酶和木糖醇脱氢酶以及来自瘤胃真菌p i r o m y c e s 的木糖异构酶。将此两种基因 转好到同类型酿酒酵母细胞中，比较两者的发酵性能的差异。结果表明，在确定矿 物培养基中，带有双酶系统的酿酒酵母的木糖消耗速率，乙醇增长率和最终乙醇产量 均高于带有木糖异构酶的酿酒酵母。但是两种酵母在发酵含有抑制物的木质纤维素水 解物的时候，只有很少一部分糖类被利用，与工业化菌株相比差距较大。双酶系统酿 酒酵母只在矿物培养基中才生成木糖醇而在水解物发酵过程中未检测到木糖醇的生 成。实验表明，尽管双酶系统会生成副产物木糖醇，但利用木糖的效率要远远高于单 酶系统。 1 4 本研究的目的、意义与主要内容 1 4 1 本研究的目的与意义 纤维素是地球上储量最丰富的多糖类物质，如何高效的利用这一潜在的可再生清 洁能源是我们必须面临的一项非常有意义的任务，而利用纤维素生产乙醇是有效利用 这一资源的首选。石油、煤炭等化石燃料的日益枯竭必会导致能源结构的变化，燃料 乙醇作为杰出的新型能源也一定会在将来的能源新体系中占据重要位置。如今，全球 1 2 第章绪论 范围内对纤维素乙醇的研究已经越来越感兴趣，美国、巴西已经走在世界前列；欧洲、 亚洲也紧随其后，虽然这一技术还没有发展到工业化水平，f h 随着重视程度的加深和 资源投入的增大，突破技术瓶颈指同可待。 良好的发酵菌株是实现纤维素乙醇发酵工业化的必要条件，这也掀起了筛选和构 建纤维素乙醇发酵菌株的高潮。本研究分别考察了管囊酵母的发酵情况和构建基因工 程酵母菌的初步尝试，有望找到良好的纤维素利用菌，对早r 实现纤维素乙醇的工业 化生产具有重要的意义。 1 4 2 本研究的主要内容 本研究主要分为两个部分，首先对实验室保藏的一株管囊酵母进行了考察，经过 菌种分离筛选后得到一株发酵性能稳定、乙醇产量较高的菌株d 2 1 ，而后对发酵培养 基中碳源、氮源、溶氧、温度、发酵时间、营养因子和接种量等条件进行考察，优化 了发酵条件，提高了管囊酵母d 2 1 的发酵水平，为稳定d 2 1 的发酵性能，进行定向驯 化，又进一步提高了乙醇产量。最后对d 一2 1 的整个发酵过程进行了监测，测定了生长 曲线。 管囊酵母1 7 7 0 初始菌株 图1 - 4 管囊酵母木糖乙醇发酵条件优化基本流程 f i g 1 _ 4f l o wc h a r to fe t h a n o lf e r m e n t a t i o no fx y l o s eb yp a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s 其次又考查了基因工程酵母菌的构建，用p c r 的方法把大肠杆菌基因组中的木糖 异构酶基因提取出来，经测序鉴定后连接到穿梭质粒上，通过穿梭质粒表达载体转移 到酿酒酵母中去进行表达，发酵检测酶的活性，使酿酒酵母具备发酵木糖的能力，由 于时间有限，本实验只进行到了成功构建重组穿梭质粒，后续的检测和表达将由其他 人来完成。 1 3 塑 睁 源 一 言书一 一，侧。一。m、 一 篡 一 北京化工人学硕1 ：学位论文 穿梭质粒p y e s 1 l 带有酶切位点 大肠杆菌e c o l i 提取基冈组。n a 上电泳检测 基冈组d n a p c r 法提取目的基因i p m d l t 4 d n a 双酶切 上 带有酶切位点 线性p u b s 切胶回收 x y 认 t 4 d n a & 抗生素筛选 切电泳检测 p y e 卜_ x y l a 酿酒酵母 基冈重组酿酒酵母 酶活& 发酵检测i 阳性克隆酵母 图1 5 酿酒酵母基因工程菌的构建流程图 f 遮1 - 5f l o wc h a r to fc o n s t r u c t i o nf o re n g i n e e r i n gs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 1 4 第：章管囊酵母术糖乙醇发酵条1 i ， = 的优化 2 1 引言 第二章管囊酵母木糖乙醇发酵条件的优化 管囊酵母足能发酵木糖的天然酵母之一，具备酵母菌的发酵特点，有一定实用价 值，但仍存在一定的问题，i ：b 女n 况乙醇耐受性差，乙醇产量不高等问题。本小节系统 的研究了管囊酵母摇瓶发酵木糖产乙醇的情况，经过菌种选育，对一株产量较高的管 囊酵母d 一2 1 进行了发酵条件的优化，对碳源，氮源，营养因子，温度，时间，溶氧 等因素进行综合考虑，得出了管囊酵母d 2 l 发酵木糖产乙醇的最佳条件，再通过对 此菌株的定向驯化稳定了发酵性能，最后又通过生长曲线的绘制监测了此菌株发酵木 糖产乙醇的全过程，对全过程有了更深刻的了解。 2 2 实验材料 2 2 1 菌种 管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ) ：中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心提供。 2 2 2 实验试剂与仪器 本节实验所用仪器和试剂如表2 1 和2 2 所示。 表2 - 1 试验仪器 t a b l e2 - 1 e x p e r i m e n t a li n s t r u m e n t 北京化工人学硕一j ：学位论文 木糖分析纯北京益利精细化学品有限公司 葡萄糖分析纯北京益利精细化学品有限公司 尿素分析纯北京益利精细化学品有限公司 硫酸铵分析纯北京益利精细化学品有限公司 硝酸钠分析纯北京益利精细化学品有限公司 维生素b 1分析纯北京益利精细化学品有限公司 维生素b 2分析纯北京益利精细化学品有限公司 维生素b 3分析纯北京益利精细化学品有限公司 维生素b 4分析纯北京益利精细化学品有限公司 维生素b 5分析纯北京益利精细化学品有限公司 维生素b 6分析纯北京益利精细化