（海洋生物学专业论文）壳聚糖纳米分散体系构建及抑菌性能研究.pdf

壳聚糖纳米分散体系构建及抑茵性能研究 摘要 壳聚糖( c s ) 是一种具有广谱抑菌性的阳离子多糖。近年来，对于c s 及其衍 生物的抑菌机理研究已经有了长远的发展，但其确切的抑菌机理只有一些推论性 的报道。而且在以往对c s 抑菌机理的研究中，大多是在溶液状态下研究c s 的 抑菌行为。本文构建了一种新型的c s 纳米分散体系，采用界面接触抑菌的新方 法，进行c s 的抑菌行为和细菌的生物化学信息变化的探索研究。 采用酸水解法制备了三种不同分子量( m w ) 的壳聚糖，m w 分别为11 0 0k d a 、 3 0 0k d a 和3 8k d a ，而且各个样品的脱乙酰度基本相同。c s 与油酰氯反应制备 了油酰壳聚糖( o c s ) 复合物，红外光谱中的特征吸收峰表明油酰基团已经成功引 入了c s 分子中，并计算得出o c s 的取代度( d s ) 分别为1 1 、5 和2 5 。采用 乳化法由o c s 制备的油酰壳聚糖纳米球( o c n p ) 呈球形且形态完整。粒径分布表 明，纳米球大小均一，平均粒径为2 7 5 3n n l ( 样品c ) 和3 2 7 4n n l ( f 4 品b ) 。o c n p 在营养肉汤培养基中较c s 和o c s 具有更好的分散性，是一种良好的固相分散 体系。 o c n p 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均具有抑制作用，但抑菌效果存 在明显差异。测定了纳米球浓度、壳聚糖m w 、油酰壳聚糖d s 、体系p h 值4 个因素对o c n p 抑菌活性的影响。结果表明o c n p 在以上4 个因素的作用下对 于不同菌种生长的影响是不同的。壳聚糖纳米分散体系对大肠杆菌和金黄色葡萄 球菌的抑制作用随着体系中纳米球浓度的增加而增强。对于大肠杆菌，五种 o c n p 的最低抑菌浓度( m i c ) 从3 1 2 5m g l 至1 2 5m g l 不等；对于金黄色葡萄球 菌，五种o c n p 的m i c 均为1 2 5m g l 。壳聚糖m w 对o c n p 抑菌活性的影响因 菌种而异。在针对大肠杆菌的抑菌试验中，低分子量( m w = 3 8k d a ) c s 制各的 o c n p 具有更强的抑菌活性。而在金黄色葡萄球菌的试验中，不同m w 壳聚糖制 备的o c n p 其m i c 相同，抑菌活性没有明显差异。油酰取代度对纳米球抑菌活 性的影响也受到不同受试菌的影响。中取代度( d s5 ) 的o c n p 对大肠杆菌的抑 制作用最明显；不同油酰取代度纳米球对金黄色葡萄球菌的抑制生长效果一致。 在所试的p h 范围( p h 4 - 6 ) 内，纳米分散体系对两种细菌的抑菌活性随体系p h 值 的升高而增强，p h 达到6 时其抑菌活性最强。杀菌试验结果表明，纳米分散体 系能在5m i n 内杀死9 0 以上的细菌，与c s 的杀菌能力相当。 o c n p 对细菌细胞膜的通透性和超微形态具有明显的影响。大肠杆菌和金黄 色葡萄球菌经o c n p 处理后a 2 6 0 迅速增加，表明在纳米球的作用下胞内的d n a ， r n a 等大分子迅速释放到胞外，细胞膜的完整性被破坏。而镁离子的加入使胞 内物质的释放大幅下降，有效的稳定了细胞膜结构，说明o c n p 对细胞壁上镁 离子的螯合作用是其抑菌性能的一部分。针对革兰氏阴性菌特殊的细胞外膜和内 膜结构，首先采用疏水性荧光探针1 - n 苯基萘胺( n p n ) ，以n p n 在外膜破坏后 进入胞内环境中时荧光强度的增加，证明了o c n p 对大肠杆菌外膜结构渗透性 的影响；对细菌内膜渗透性的检测以d 硝基苯酚b d 半乳糖苷( o n p g ) 为底物， 胞内的d 半乳糖苷酶在细菌内膜受损后可以释放至胞外，作用于o n p g 后生成 邻硝基苯酚，邻硝基苯酚含量的显著升高，证明o c n p 使大肠杆菌内膜渗透性 增加。而细菌悬液中电导率的升高再次证明了o c n p 增大了细菌细胞膜的通透 性。聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 结果显示，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中 的蛋白含量减少，分析其原因是o c n p 破坏了细胞膜的完整性，导致了胞内可 溶性蛋白的外渗，或是抑制了某些蛋白的合成。培养基中糖含量没有发现明显的 变化。通过透射电镜( t e m ) 观察到了o c n p 对细菌的抑制作用过程。结果证明纳 米球可以结合在细菌表面，通过界面抑制作用产生抑菌行为，进而在细菌表面形 成孔洞或破坏膜功能。直观的证实了o c n p 与细菌表面的吸附、结合是其发挥 抑菌作用的必经步骤。 o c n p 在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌胞外和胞内可能存在多种作用位点。通 过对细菌表面疏水性的分析，随着o c n p 浓度的增高，大肠杆菌和金黄色葡萄 球菌的表面疏水性明显下降。o c n p 对菌体膜蛋白荧光光谱的影响表明，纳米球 会导致菌体细胞膜结构发生变化，改变膜蛋白的空间构象。s d s p a g e 显示 o c n p 对大肠杆菌外膜蛋白具有很强的结合能力，外膜蛋白有可能是o c n p 在大 肠杆菌表面的结合位点。通过卵磷脂对o c n p 抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 生长的研究，揭示了磷脂在o c n p 与金黄色葡萄球菌菌体细胞膜相互作用中是 结合位点，与o c n p 表面的自由氨基发生反应，改变菌体细胞膜通透性，导致 细菌死亡。在进一步考察磷酸基团对o c n p 抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生 长的影响时，证明了磷脂中的磷酸基团是o c n p 与金黄色葡萄球菌相互作用时 的结合位点。荧光显微镜观察的结果表明异硫氰酸荧光素( f i t c ) 标记的 f i t c o c s 纳米球进入细菌的方式因菌种而异。对于金黄色葡萄球菌，f i t c o c s 纳米球能够在较短的时间内透过细胞壁和细胞膜，进入菌体内部；而对于大肠杆 菌，f i t c o c s 纳米球在菌体表面滞留1 5r a i n 后才能进入菌体内部。采用凝胶阻 滞的方法验证了o c n p 在离体条件下与菌体d n a r n a 的直接相互作用，推测 核酸是o c n p 在胞内的作用位点之一。 本研究证实o c n p 是一种具有良好抑菌性能的壳聚糖纳米分散体系，通过 其抑菌现象和细菌的生物化学信息变化，总结并提出了o c n p 抑菌机理的模型。 关键词：壳聚糖；纳米球；分散体系；抑菌活性；抑菌机理 i i i p r e p a r a t i o na n da n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f c h i t o s a n n a n o s p h e r e s i nd i s p e r s i n gs t a t e a b s t r a c t c h i t o s a n ( c s ) i sap o s i t i v ep o l y s a c c h a r i d e 诵t hb r o a d s p e c t r u ma n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y t h e r eh a sb e e ng r e a ti m p r o v e m e n ti nt h es t u d i e sa b o u tt h ea n t i m i c r o b i a l a c t i v i t yo fc sa n di t sd e r i v a t i v e s h o w e v e r , t h em e c h a n i s mo fh o wc sa c t su p o n b a c t e r i ah a sn o tb e e ne l u c i d a t e dc l e a r l y i np r e v i o u ss t u d i e s ，m o s tr e s e a r c h e sf o c u s e d o nt h ea n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o fc ss o l u t i o n i nt h i s p a p e r ，o l e o y l c s ( o c s ) n a n o p a r t i c l e s ( o c n p ) a san o v e la n t i b a c t e r i a ld i s p e r s i o ns y s t e mi sp r e p a r e da n dt h e c h a r a c t e r i s t i c sa r ee v a l u a t e d an e wm e t h o do fs u r f a c ec o n t a c ti n h i b i t i o ni su s e dt o i n v e s t i g a t et h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fc sa n db i o c h e m i c a li n f o r m a t i o nc h a n g e so f b a c t e r i a c ss a m p l e s 诵t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h t ( m w ) a r ep r e p a r e db yt h em e t h o do f a c e t i ca c i dh y d r o l y s i s t h e i rm wa r e110 0k d a , 3 0 0k d aa n d3 8k d a a n dt h e i r d e g r e eo fd e a c e t y l a t i o ni sa l m o s tt h es a m e o c si ss y n t h e s i z e db yg r a f t i n go l e o y l o n t ot i l e n h 2a tc 2i nt h ec h i t o s a nm o l e c u l e t h ef t i rs p e c t r u ma n dl hn m r s u g g e s tt h eo l e o y lg r o u p sa r ei n t r o d u c e di n t ot h ec sm o l e c u l a r s f t i rs p e c t r u ma l s o i n d i c a t e st h ed e g r e e so fs u b s t i t u t i o n ( d s ) a r e1 1 ，5 a n d2 5 o c se x h i b i t sp o o r e r s o l u b i l i t yi na q u e o u sa c i d i cs o l u t i o nt h a nc s t h es o l u b i l i t yo fo c sa n dc sd e c r e a s e s a st h ep hi n c r e a s e d o c n pi sp r e p a r e du s i n ga no 烈e m u l s i f i c a t i o nm e t h o db a s e do n o c s t h en a n o p a r t i c l e sf o r m u l a t i o nh a sa na l m o s ts p h e r i c a ls h a p ea n dt h em e a n d i a m e t e r sa r e2 7 5 3n n l ( s a m p l ec ) a n d3 2 7 4 舢( s a m p l eb ) ，r e s p e c t i v e l y o c n p c o u l db ew e l ld i s t r i b u t e di nn u t r i e n tb r o t hf o ran i c e d i s p e r s i o ni nt h et e s t e d c o n c e n t r a t i o nr a n g e o c n ps h o w si n h i b i t o r ye f f e c ta g a i n s te c o l ia n ds a u r e u $ ，b u tt h ea c t i v i t yv a r i e s a g a i n s ts t r a i n s f o u rf a c t o r s ，c o n c e n t r a t i o n ，c h i t o s a nm w ，d so fo c sa n dp h ，a r e e x p l o r e do nt h ea n t i b i a c t e r i a la c t i v i t y t h ee f f e c t so ff o u rf a c t o r st oc sa r eq u i t e d i f f e r e m 、析t he a c hm i c r o o r g a n m i s m r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t y i n c r e a s e sa st h ec o n c e n t r a t i o no fo c n pi n c r e a s e d 1 1 1 em i n i m u mi n h i b i t o r y v c o n c e n t r a t i o n s ( m i c s ) o fo c n pr a n g ef r o m3 1 2 5m g lt o12 5m g la g a i n s te c o i l f o rs a u r e u s ，t h em i co fa l ls a m p l e si s12 5m g l o c n po fl o wc h i t o s a nm w a p p e a r e sm o s te f f e c t i v ea g a i n s te c o l i f o rs a u g e u s ，t h ee f f e c to fc sm wo nt h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fo c n pi sn o tp r o n o u n c e d ec o l ii sm o s ts u s c e p t i b l et oo c n p o fo c s 诚t i ld s5 ，w h i l en om a r k e dd i f f e r e n c ei sf o u n da m o n go c n po fo c sw i t l l d i f f e r e n td sa g a i n s ts a u r e u s o c n ps h o w si n c r e a s e da n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw h e np h i n c r e a s e sf r o m4 0t o6 0a n dr e a c h e sam a x i m u ma tp h6 0 b a c t e r i c i d a lt e s ts h o w s t h a to c n pk i l l sm o r et h a n9 0 b a c t e r i ai n5m i n ，s t i l lk e e p st h eo r i g i n a lb a c t e r i c i d a l a c t i v i t yo fc h i t o s a n e f f e c to fo c n po nt h e p e r m e a b i l i t y o fb a c t e r i a lm e m b r a n ea n d m i c r o - m o r p h o l o g yi ss i g n i f i c a n t a 2 6 0i n c r e a s e sr a p i d l ya so c n pm i x e d 、析t l lb a c t e r i a , w h i c hi n d i c a t e st h a tl a r g em o l e c u l e ss u c ha sd n a ，r n al e a c ho u ta n dt h ec e l l m e m b r a n e sa r ed a m a g e d t h ea d d i t i o no fm 9 2 + s h a r p l yr e d u c e st h er e l e a s eo f i n t r a c e l l u l a rm a t e r a l sa n ds t a b i l i z e st h es t r u c t u r eo fe e l lm e m b r a n e s n i se f f e c t s h o w st h a tt h ea b i l i t yo fc h e l a t e dw i t hm 9 2 + o nt h ec e l lw a l li sap a r to fo c n p s a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y o c n pa l s or a p i d l yi n c r e a s e s1 - n - p h e n y l - n a p h t h y l a m i n e ( n p n ) u p t a k ea n dt h er e l e a s eo fc y t o p l a s m i c1 3 - g a l a c t o s i d a s ev i ai n c r e a s i n gt h ep e r m e a b i l i t y o fo u t e rm e m b r a n e ( o m ) a n di n n e rm e m b r a n e ( i m ) s d s p a g ei n d i c a t e st h ec o n t e n t o fc e l l u l a rs o l u b l ep r o t e i n sd e c r e a s e ss i g n i f i c a n t l yi no c n p t r e a t e db a c t e r i a i ti s s u g g e s t e st h a to c n pd e c r e a s e st h ec o n t e n to fc e l l u l a rs o l u b l ep r o t e i n sb yp e r m e a t i n g a n dd i s r u p t i n gc e l lm e m b r a n e s n om a r k e dc h a n g eo fs u g a rc o n t e n ti sf o u n di nt h e m e d i u m e l e c t r o nm i c r o s c o p yc l e a r l yd e m o n s t r a t e st h a to c n pa d h e r e st ot h es u r f a c e o fec o l ia n ds a u r e u s ，i n h i b i t e st h e i rg r o w t ht h r o u g h ti n t e r r a c i a li n t e r a c t i o no nt h e c e l ls u r f a c ea n ds h o w se x t e n s i v ec e l ls u r f a c ea l t e r a t i o n so fo c n p t r e a t e db a c t e r i a , w h i c hs u p p l i e sd i r e c te v i d e n c et h a tb i n d i n go fo c n pt ot h eh i g h l yn e g a t i v e l yc h a r g e d c e l ls u r f a c ep o l y m e r si st h en e c e s s a r ys t e p t h e r em a yb em a n ye x t r a c e l l u l a ro ri n t r a c e l l u l a rt a r g e t si ne c o l ia n dsa u r e u s f o ro c n p t h ec e l ls u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yo fkc o l ia n ds a u r e u sd e c r e a s e sa st h e c o n c e n t r a t i o no fo c n pi n c r e a s e d t h ef l u o r e s c e n c ee x p e r i m e n t si n d i c a t et h a to c n p i n f l u e n c e st h es t r u c t u r eo fm e m b r a n ea n ds p e c u l a t et oi n t e r a c t 、析t hp r o t e i n so nt h e c e l lm e m b r a n e s d s p a g eo fe c o l io u t e rm e m b r a n ep r o t e i n ( o m p ) t r e a t e d 、i t h o c n pi n d i c a t e st h a to m pm a yb eo r l eo ft h ee x t r a c e l l u l a rt a r g e t si ne c o l i t h e l e c i t h i ne f f e c ts u g g e s t e st h a to c n pb i n d st oc y t o p l a s m i cm e m b r a n ep h o s p h o l i p i d so f s a u r e u s ，a n dp h o s p h a t eg r o u p sm a yb ea ne x t r a c e l l u l a rt a r g e tc o n t r i b u t i n gt ot h e i n t e r a c t i o nb e t w e e no c n pa n dt h ec e l ls u r f a c e f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y o b s e r v a t i o n sd e m o n s t r a t et h a tt h ei n t e r n a l i z a t i o np a t h w a yo fo c n pi sc o m p l e t e l y d i f f e r e n ti n e c o l ia n ds a u r e u s t h ei n t e n s eg r e e nf l u o r e s c e n c ei sv i s u a l i z e d t h r o u g h o u tt h et e s t e db a c t e r i a a ss o o na sf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ( f i t c ) - o c s n a n o p a r t i c l e sm i x e dw i t hs a u r e u s ，w h i l ef o re c o l it h ep r o b ei s i n t e m a l i z e di n f i t c o c sn a n o p a r t i c l e s - t r e a t e db a c t e r i aa f t e r15m i n t h eg e l r e t a r d a t i o ne x p e r i m e n t s h o w st h a to c n pi sc a p a b l eo fb i n d i n gt oi n t r a c e l l u l a rt a r g e t ss u c ha sd n aa n dr n a t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a to c n pe x e r t st h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yb yp u t a t i v eb i n d i n g t oi n t r a c e l l u l a rt a r g e t ss u c ha sd n aa n dr n a b a s e do nt h ea b o v ec o n s i d e r a t i o n s ，o c n pi san a n o s p h e r ed i s p e r s i o ns y s t e m 、析t l lg o o da n t i b a c t e r i a la c t i o n s t h r o u g hi n v e s t i g a t i n gt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n d b i o c h e m i c a li n f o r m a t i o nc h a n g e so fb a c t e r i a , t h em o d e lf o rt h em e c h a n i s m0 1 1t h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fo c n pi sd r a w no u t k e yw o r d s ：c h i t o s a n ；n a n o p a r t i c l e ；d i s p e r s i n gs y s t e m ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ； a n f i b a c t e r i a lm e c h a n i s m v n 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：再pf f j 签字日期：9 0 , 7 年岁月2 6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：再p 硒 签字日期：2 口寸j 年f 月jb 日 新解：修习 签字日期：弘。产j 月影日 壳聚糖纳米分散体系构建及抑菌性能研究 第一章前言 甲壳素( c h i t i n ) ，( 1 ，4 ) 一2 一乙酰氨基一2 一脱氧- p d 一葡聚糖，即聚n 一乙酰葡糖胺， 其结构如图1 1 所示。又称为几丁质、甲壳质、壳多糖、虫膜质、蟹壳素、聚乙 酰胺基葡萄糖等，是一种白色、无定形、半透明的氨基多糖生物聚合物，是许多 低等动物特别是节肢动物，如虾、蟹和昆虫等外壳的重要成分，也广泛存在于低 等植物和真菌、藻类的细胞壁中，起到维护和保护甲壳动物和微生物躯体的作用 ( 蒋挺大，2 0 0 0 ) 。每年的生物合成量约为1 0 0 多亿吨( r i c h a r d s ，1 9 5 1 ；j e u n i a u x ， 1 9 6 3 ) ，是地球上仅次于纤维素的第二大再生资源，也是地球上除蛋白质外数量 最大的含氮天然有机化合物。 甲壳素( c h i t i n ) 壳聚糖( e h i t o s a n ) 图1 1 甲壳素和壳聚糖的结构式 f i g u r e1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fc h i t i na n dc h i t o s a n 壳聚糖( c h i t o s a n ) i 相1 3 1 ，4 连接2 氨基葡萄糖和2 乙酰氨基葡萄糖组成，是甲壳 素在强碱性条件下经水解、部分脱乙酰基后形成的一种重要衍生物，呈白色或灰 白色，无定形、半透明、略有珍珠光泽。壳聚糖和甲壳素的区别主要在于脱乙酰 化的程度不同，般把脱乙酰度大于7 0 的称为壳聚糖，其结构如图1 1 所示。 壳聚糖含有超过5 0 0 0 个葡萄糖氨单位，商业上，一般通过碱液( n a o h ，4 0 5 0 呦 水解虾、蟹壳中的甲壳素来制备壳聚糖( g o o s e n ，1 9 9 7 ；h a n 等，1 9 9 9 ；l i u 等， 壳聚糖纳米分散体系构建及抑菌性能研究 2 0 0 1 ) 。而发酵工程领域的研究表明，使用微生物法生产壳聚糖是一种很有前途 的方法( t e n g 等，2 0 0 1 ；p o c h a n a v a n i s h 等，2 0 0 2 ) 。黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e ) 是含甲 壳素最多的真菌( k n o r r , 1 9 9 1 ) 。曹健等( 曹健等，1 9 9 5 ) 使用经济、简便的方法培养 黑曲霉并从其菌丝体中提取甲壳素，或者直接从其菌丝体中制备壳聚糖。此外人 们也发现许多丝状真菌的细胞壁中都含有或多或少的甲壳素或壳聚糖成分，而生 物工程技术的使用，特别是使用微生物法生产壳聚糖不仅不受原料的限制，更可 大大降低生产成本，提高壳聚糖的应用价值。从真菌细胞壁中提取甲壳素或者壳 聚糖的方法大体可表示为以下3 步( 陈庆源，1 9 9 9 ) ： 发酵液 过滤 水洗 冷冻干燥 1 rr 菌丝体 稀碱处理( 1m o l ln a o h ) 高温加热( 1 2 1 ，1 5m i n ) 离心 水洗、离心 乙醇洗涤、离心 冷冻干燥 1 l 碱不溶物i 2 醋酸加热萃取( 9 5 ，1 2h ) 离心 离心液调节p h 值至1 0 离心 水洗 冷冻干燥 r i 甲壳素或壳聚糖 图1 2 微生物法提取甲壳素或壳聚糖 f i g , r e1 - 2e x t r a c t i o no fc h i t i no rc h i t o s a nb ym i c r o b i a lm e t h o d s 除黑曲霉外，丝状真菌中毛霉菌和根霉菌的菌株中的壳聚糖含量也比较丰 2 壳聚糖纳米分散体系构建及抑菌性能研究 富，从雅致放射毛霉( 陈忻等，2 0 0 0 ) 、鲁氏毛霉( 王惠杰等，1 9 9 9 ) 和米根霉( 陈世 年，1 9 9 6 ) 中也可通过控制发酵条件获得高得率的壳聚糖。 壳聚糖是自然界中唯一的碱性阳离子多糖( 蒋挺大，2 0 0 1 ) ，化学稳定性好。 不溶于水、碱性溶液及有机溶剂，可溶于大多数稀酸，如盐酸、醋酸、谷氨酸、 柠檬酸中，此时溶液中的h + 可与分子中的氨基结合，生成带正电荷的壳聚糖分子， 具有许多独特的性能。由于分子结构中含有氨基、羟基、乙酰氨基、氧桥以及富 含电子的吡喃环等活性基团，可发生交联、接枝、酯化、醚化、酰化、羧甲基化、 烷基化等反应，对壳聚糖进行改性可赋予其不同的特性。壳聚糖具有其独特的物 理、化学性质和生物活性，如生物可降解性( t o m i h a t a 等，1 9 9 7 ；r a t a j s k a 等，1 9 9 8 ； s e u i 等，19 9 9 ；i k e ji m a 等，2 0 0 0 ；e h r e n f r e u n d k l e i r u n a n 等，2 0 0 2 ；k u r i t a 等，2 0 0 2 ； i t o h 等，2 0 0 3 ) 、生物相容性( l e e 等，2 0 0 2 ；m i 等，2 0 0 2 ；m o l l i n a r o 等，2 0 0 2 ；y u a n 等，2 0 0 4 ；b e r g e r 等，2 0 0 4 ) 、无毒性( c h o b o t 等，1 9 9 5 ；石玲等，2 0 0 0 ) 、广谱抑 菌性( h i r a n o 等，1 9 8 9 ；c h o i 等，2 0 0 1 ；h e l a n d e r 等，2 0 0 1 ；n o 等，2 0 0 2 ；h o n g 等，2 0 0 2 ；c h u n g 等，2 0 0 3 ；r a b e a 等，2 0 0 3 ；y o s h i h i k o 等，2 0 0 3 ；h u a n g 等， 2 0 0 4 ；p a r k 等，2 0 0 4 ；l i 等，2 0 0 7 ) 抗肿瘤活性( s u z u k i 等，1 9 8 6 ；l i u 等，1 9 9 7 ； k o i d e ，1 9 9 8 ；k a m i y a m a 等，1 9 9 9 ；m i t r a 等，2 0 0 1 ；q i n 等，2 0 0 4 ) 、增强免疫 反应( 魏涛等，2 0 0 0 ；j e o n 等，2 0 0 1 ) 、抗氧化( 陈同坡等，1 9 9 8 ；x i e 等，2 0 0 1 ； l i n 等，2 0 0 4 ) 等特点，也因此而引起了人们的广泛关注。 1 壳聚糖及其衍生物抑菌活性的研究进展 1 1 壳聚糖的抑菌活性 壳聚糖是一种广谱型抗菌剂，对几十种细菌和真菌的生长都有明显的抑制作 用，见表1 1 ( l i 等，2 0 0 2 ) 。早在1 9 7 9 年，a l l a n 等( a l l a n 等，1 9 7 9 ) 就对壳聚糖的抑 菌性作了系统的研究，提出壳聚糖具有广谱抑菌性。浓度为1 1 5 的壳聚糖溶液 与金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 在p h 5 5 或6 5 条件下培养2 天，能够使菌 体全部死亡。浓度为0 5 或1 的壳聚糖溶液与大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l o 在p h 5 5 条件下培养2 天，可使菌体全部死亡。当壳聚糖浓度超过1 时，培养l 天后即可 使菌体全部失活( w a n g ，1 9 9 2 ) 。另有报道研究了不同浓度的壳聚糖对天然虾中含 3 壳聚糖纳米分散体系构建及抑菌性能研究 有的不同细菌的抑制作用，并比较了细菌对壳聚糖敏感程度的不同( s i m p s o n 等， 1 9 9 7 ；s t r a n d 等，2 0 0 3 ) 。结果表明，0 0 2 的壳聚糖溶液对蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u s c e r e u s ) 具有抑菌作用。在0 0 0 5 的壳聚糖溶液中，大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l o 和 普通变形菌( p r o t e u sv u l g a r i s ) 的生长量很少，当壳聚糖浓度达到o 0 0 7 5 时完全不 生长。 表1 1 壳聚糖的抑菌活性 t a b k1 - 1a n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fc h i t o s a n m l c 8 m l c 。 m i c r o o r g a n i s mm i c r o o r g a n i s m ( p p m )( p p m ) b a c t e r i a f u n g i a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s 10 0 b o t r y t i sc i n e m a 10 b a c i l l u sc e r e u s10 0 0d r e c h s t e r as o r o k i a n a10 0 c o r i n e b a c t e r i u mm i c h i g a n e n c e10f u s a r i u mo x y s p o r u m10 e r w i n i a s p 5 0 0m i c r o n e c t r i e l l an i v a l b z1o e r w i n i ac a r o t o v o r as u b s p 2 0 0p i r i c u l a r i ao r y z a e5 0 0 0 e s c h e r i c h 妇c o l i2 0r h i z o c t o n i as o l a n i10 0 0 k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 7 0 0 t r i c h o p h y t o ne q u i n u m 2 5 0 0 m i c r o c o c c u sl u t e u s 2 0 p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s 5 0 0 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 2 0 x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s5 0 0 am i c ：m i n i m u mg r o w t hi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n n o 等( n o 等，2 0 0 2 ) 报道了不同分子量的壳聚糖和壳寡糖对四种革兰氏阴性菌 ( 大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i ，荧光假单胞菌p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s ，鼠伤寒沙门 氏菌s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ，副溶血弧菌v i b r i op a r a h a e m o l y t i c u s ) 和七种革兰氏 阳性菌( 单核细胞增多性李斯特茵l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ，巨大芽孢杆菌b a c i l l u s m e g a t e r i u m ，蜡状芽孢杆菌b a c i l l u sc e r e u s ，金黄色葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ， 植物乳杆菌l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ，短乳杆菌l b r e v i s ，保加利亚乳杆菌 4 壳聚糖纳米分散体系构建及抑茵性能研究 l b u l g a r i c u s ) 有抑制效果。a t i a 等( a t i a 等，2 0 0 5 ) 用壳聚糖溶液处理番茄晚疫病植 株，发现壳聚糖能明显减少菌丝体的生长、孢子囊的产生、游走孢子的释放、晚 疫病菌( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ) 孢囊的萌芽，提高番茄对病害的抵抗能力，抑制病 害发生。邓婧等( 邓婧等，2 0 0 5 ) 研究了不同分子量和不同浓度的壳聚糖对e l 腔常 见致病菌的体外抑制作用。发现不同分子量的壳聚糖在p h6 5 时对金黄色葡萄球 菌、白色念珠菌、幽门螺杆菌、牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌均有抑制作用。l i 等( “等，2 0 0 7 ) 首次报道了壳聚糖溶液对植物病原细菌一一植物一品红 ( e u p h o r b i ap u l c h e r r i m a ) 的角斑病病原细菌( x a n t h o m o n a s ) 具有明显的抑制作用。 1 2 壳聚糖衍生物的抑菌活性 壳聚糖作为一种具有广谱抑菌性的生物材料备受关注，但是壳聚糖还存在一 些缺陷，如适用的p h 值范围较窄，不溶于大多数溶剂，只能溶解于醋酸、甲酸、 琥珀酸、乳酸及苹果酸等稀酸溶液，使其应用受到一定限制。因此很多研究者致 力于通过各种化学改性的方法对壳聚糖进行修饰，改进壳聚糖的水溶性和生物活 性，极大的拓展了壳聚糖的应用范围。 1 2 1 羧甲基壳聚