（蔬菜学专业论文）马铃薯抗晚疫病主效位点的基因定位和遗传分析.pdf

摘要 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u m ) 属茄科茄属植物，起源丁南美洲安第斯山脉一带，是世界上 仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物，在世界粮食安全体系中具有重要作用。由致病疫 霉菌( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ( m o n t ) d eb a r y ) 引起的晚疫病是马铃薯世界范围内最具毁灭 性的病害，每年引起数十亿美元的损失，我国每年冈晚疫病造成的减产损失在1 0 亿美元以上。 因为p i n f e s t a n s 存在有性和无性两种生殖方式，具有极高的进化潜力，通过常规育种导入到 栽培种中的抗性尺基冈很容易被克服。现在，通过生物上程手段构建抗病基因近等混合系成 为持久防控晚疫病的最有希望的策略之一，然而这种策略需要克隆多个晚疫病抗性基因。 本研究旨在通过对马铃薯晚疫病主效抗性基因r i o 和r 1 1 分离群体的遗传分析和基因定 位，初步揭示马铃薯1 1 号染色体抗晚疫病主效位点( m 馏) 的基因组成和遗传特性，为进一 步的基因克隆和了解马铃薯野生群体的晚疫病抗性机制并最终持久地防控马铃薯晚疫病奠定 基础。本研究的主要结果如下： 1 通过对r i o 基因分离群体的遗传分析和作图表明，主效基因和抗性q t l s 共同决定了 r i o 的晚疫病抗性。马铃薯晚疫病抗性基因r i o 抗谱广，应用价值大，常用于马铃薯抗病杂交 育种。利用三个不同小种但含有同一个无毒基囚a v r l o 的晚疫病菌株分别对r i o 分离群体进行 离体叶片接种，结果表明分离群体对这三个菌株表现出不同的抗病反应。其中针对菌株i p o - o 或9 9 0 1 8 的抗性是由q t l s 控制的数量性状，而针对菌株8 9 1 4 8 9 的抗性是由主效基因即r i o 控制的。统计学分析表明，针对菌株i p o - o 或9 9 0 1 8 的抗性q t l s 与位于马铃薯1 1 号染色体 末端的r i o 位点连锁。所以，抗晚疫病主效基因r i o 与抗性q t l s 成簇存在很可能是r i o 鉴 别寄主良好田间抗性的原因。 2 利用比较基冈组学结合b s a 分析方法定位了马铃薯抗晚疫病土效基囚r i o ，并构建了 r i o 位点的高分辨率遗传图谱。r i o 位点位于马铃薯1 1 号染色体的短臂末端，与已克隆的晚 疫病抗性基冈r 3 a 同属丁抗晚疫病主效位点的单倍型( h a p l o t y p e s ) 。应用比较基冈组学和b s a 分析，开发了6 个与r i o 连锁的分子标记，并将r i o 初步定位在1 0 0 1 t 和c 2 一a t 5 9 5 9 9 6 0 两个 遗传距离为2 6c m 分子标记之间。r i o 位于已克隆的晚疫病抗性基因r 3 a 的近端粒区。利用 r i o 位点的两侧标记，从1 9 4 2 株r i o 分离群体中筛选剑9 9 株r i o 位点重组单株，对其进行 已开发标记分析和接种鉴定，从而构建了r i o 位点的高分辨率遗传图谱。r i o 基囚被定位于标 记6 5 6 t 和1 0 0 1 t 之间的0 2 6c m 的遗传区间内，为抗晚疫病分子标记辅助育种和r i o 基因 的最终克隆打下了基础。 3 通过马铃薯m l b 位点比较作图，定位了马铃薯抗晚疫病主效基冈r l l 。以晚疫病抗性 基因r l l 的鉴别寄主m a r l l 和不含已知抗性基因的品种k a t a h d i n 为杂交亲本的f 1 群体为杂 交亲本，对包含8 3 个基冈犁的r i i 基因的分离群体进行了晚疫病菌株接种和遗传分析，确定 r l l 为主效单基因，在m a r l l 中以单式( s i m p l e x ) 存在。应用比较作图和b s a 分析，开发了 6 个与r 1 1 连锁的分子标记，并将r l l 定位在11 号染色体末端，距离最近的c 2 _ a t 5 9 5 9 9 6 0 标记遗传距离约为2 4c m 。r l l 较晚疫病抗性基因r 3 a 和r i o 更靠近近端粒区。本研究所获 得的遗传图谱为进一步构建r l l 高分辨率遗传图谱提供了基础。 4 建立了从马铃薯b a c 文库中快速富集抗病基因及其同源序列的磁珠分离系统。我们首 先根据晚疫病抗性基因r 3 a 家族的序列比对结果设计了r 3 a 基冈家族的保守探针，并将含有 r 3 a 基冈的b a cs h 2 3 g 2 3 部分酶切成7 一1 1k bd n a 片段。通过结合保守探针的磁珠系统对上 述7 - ll k bd n a 片段进行r 3 a 基因分离，将磁珠富集到的片段克隆到双元载体p b i n p l u s 上。 通过阳性克隆和菌落p c r 鉴定表明，含有r 3 a 基因的克隆比率达到8 2 7 6 ，相对于磁珠系统 富集前，r 3 a 基因比率提高近1 9 倍。传统的基因克隆方式，图位克隆和转座子标签法，在遵 循同源四倍体的四体遗传规律的栽培马铃薯中应用难度极大，而本研究建立了抗病基因及其同 源序列的磁珠分离系统，为利用同源基因法克隆马铃薯四倍体栽培种中基冈提供了实验基础。 关键词：马铃薯，晚疫病，抗性基因，精细定位，磁珠富集 a b s t r a c t p o t a t o ( s o l a n u mt u b e r o s u m ) ，o r i g i n a t e df r o ma n d e sm o u n t a i n f o r e s t si ns o u t ha m e r i c a ，i st h e f o u r t hm o s tw o r l d w i d ec r o pi nt h ew o r l da f t e rw h e a t c o r na n dr i c e i tp l a y si m p o r t a n tr o l ei nf b o d s e c u r i t y l a t eb l i g h tc a u s e db yt h eo o m y c e t ep a t h o g e np h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ，o n eo ft h ew o r l d s m o s td e v a s t a t i n gp l a n td i s e a s e s ，r e s u l t si nt r e m e n d o u se c o n o m i cl o s s e st og l o b a lp o t a t op r o d u c t i o n d u et oh i g he v o l u t i o n a r yp o t e n t i a lr e s u l t e df r o mm i x e dr e p r o d u c t i o na n dh i g h g e n ef l o wo fp i n f e s t a n s ，r e s i s t a n c eg e n e s 僻g e n e s ) i n t r o g r e s s e di n t op o t a t oc u l t i v a r sf r o mt h ew i l dr e l a t i v eh a v e a l w a y sb e e no v e r c o m eb yn e wi s o l a t e s t h a tc o n t i n u a l l ye m e r g ei nf i e l d a tp r e s e n t ，rg e n e p o l y c u l t u r e ，am i x t u r eo fc u l t i v a r sw i t hd i f f e r e n trg e n e si nt h es a m eg e n e t i cb a c k g r o u n d ，i so n eo f p r o m i s i n gs t r a t e g i e st oc o n t r o ll a t eb l i g h t t oc r e a ta nrg e n ep o l y c u l t u r ead o z e no frg e n e sn e e dt o b ei s o l a t e d i n t h i s s t u d y ，b yi n h e r i t a n c ea n a l y s e sa n dg e n e t i cm a p p i n gf o rr i og e n ea n dr i 1 g e n e c o n f e r r i n gr e s i s t a n c et ol a t eb l i g h t ，w ep r o v i d eu s e f u li n s i g h ti n t or e s i s t a n c eg e n eo r g a n i z a t i o na n d f u n c t i o ni nm a j o rl a t eb l i g h tr e s i s t a n c el o c u s ( m l b ) i np o t a t oo nt h es h o r ta l t no fc h r o m o s o m e11 a n do u rw o r km a k e st h es t a r t i n gp o i n tf o rm a p - b a s e dc l o n i n go ft h er i o r l lg e n ea n dd i s c o v e r yo f r e s i s t a n c em e c h a n i s mi nw i l dp o t a t op o p u l a t i o n t h em a i nr e s u l t si nt h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ： 1 t h er i or e s i s t a n c es p e c i f i c i t yt ol a t eb l i g h ti sc o n f e r r e db yb o t hs i n g l ed o m i n a n trg e n ea n d q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i t h er i og e n ec o n f e r sb r o a dr e s i s t a n c es p e c t r u ma n dw a su s e dw i d e l yi n b r e e d i n gp r o g r a m s p r o g e n yf r o mt h ec r o s sb e t w e e nt h er i od i f f e r e n t i a la n dt h es u s c e p t i b l ec u l t i v a r k a t a h d i nw e r ea s s e s s e df o rl a t eb l i g h tr e s i s t a n c et ot h r e ep 的t o p h t h o r ai n f e s t a n si s o l a t e si nd e t a c h e d l e a fa s s a y s o m ep r o g e n yd i s p l a y e dd i f f e r e n t i a lr e s p o n s et ot h et h r e ei s o l a t e s t h er e s i s t a n c et ot h e i s o l a t e si p o 一0a n d9 9 018a r ec o n t r o l l e d b yq u a n t i t a t i v et r a i tl o c i ，w h e r e a st h er e s i s t a n c et ot h e i s o l a t e8 914 8 9i si n h e r i t e da sam a j o rd o m i n a n trg e n e ，d e s i g n a t e da sr i oi nt h i ss t u d ys t a t i s t i c a l a n a l y s e sr e v e a l e dt h a tr e s i s t a n c eq t l st oi s o l a t ei p o 一0a n d9 9 018i sl i n k e dw i t ht h er i og e n et h a t l o c a t e so nt e l o m e r i cp a r to fc h r o m o s o m e11 ，w h e r et h em l bw a sd i s c o v e r e d t h ec l u s t e r i n go ft h e q u a l i t a t i v eg e n er i ow i t hr e s i s t a n c eq t l sm a ye x p l a i nt h ef i e l dr e s i s t a n c eo b s e r v e do nt h er i o d i f f e r e n t i a l 2 t h er i og e n ec o n f e r r i n gr e s i s t a n c et ol a t eb l i g h ti np o t a t ow a sm a p p e db yc o m p a r a t i v e g e n o m i c sc o m b i n e dw i t hb u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ( b s a ) ，a n dah i g h r e s o l u t i o ng e n e t i cm a po ft h e r i og e n ew a sc o n s t r u c t e d r i o ，l i k er 3 ac o n f e r r i n gr e s i s t a n c et ol a t eb l i g h t ，i sam e m b e ro fm l b a n dl o c a t e so nt h es h o r ta r mo fc h r o m o s o m e11 as e g r e g a t i n gp o p u l a t i o no f19 5g e n o t y p e sw a s i n o c u l a t e da n da n a l y z e d s i xm a r k e r sl i n k e dt or i oa r ed e v e l o p e du s i n gac o m b i n e ds t r a t e g yo f c o m p a r a t i v eg e n o m i c sa n d b s a r i or e s i d e sb e t w e e nt h et w op c rm a r k e r s1 0 0 1 ta n d c 2 _ a t 5 9 5 9 9 6 0t h a td e f i n eag e n e t i ci n t e r v a lo f2 6c m ，t e l o m e r i ct ot h ec l o n e dr 3 ag e n e w i t h f l a n k i n gm a r k e r so ft h er i og e n e ，9 9p l a n t sa sb e i n gr e c o m b i n a n ti nr i oi n t e r v a lw e r ei d e n t i f i e d f r o m19 4 2r i os e g r e g a t i n gp o p u l a t i o n ，w h i c hw e r et h e nt e s t e df o rr i ow i t hi s o l a t e8 914 8 - 9a n d i i i a n a l y z e dw i t hm a r k e r sd e v e l o p e d ah i g h r e s o l u t i o ng e n e t i cm a po ft h er i og e n ew a sc o n s t r u c t e d t h er i og e n ew a sd e l i m i t e di n t oag e n e t i ci n t e r v a lo f0 2 6c mb e t w e e n6 5 6 ta n d10 0 1ta sg i v e sa b a s ef o rm a sa n df u r t h e rr i oc l o n i n g 3 t h er l lg e n ec o n f e r r i n gr e s i s t a n c et ol a t eb l i g h ti np o t a t ow a sl o c a t e db yc o m p a r a t i v e m a p p i n gw i t hm l b af 1s e g r e g a t i n gp o p u l a t i o no f8 3g e n o t y p e sd e r i v e df r o mr i id i f f e r e n t i a l m a r11a n dt h es u s c e p t i b l ep o t a t oc u l t i v a rk a t a h d i nw e r ea s s e s s e df o rl a t eb l i g h tr e s i s t a n c ei n d e t a c h e dl e a v e sa s s a ya n dg e n e t i c a l l ya n a l y z e d r l li si n h e r i t e da sam a j o rd o m i n a n trg e n ea n di s p r e s e n ti ns i m p l e xi nm a r l1 s i xm a r k e r sl i n k e dt or 1 1a r ed e v e l o p e du s i n gac o m b i n e ds t r a t e g yo f c o m p a r a t i v em a p p i n ga n db s a r l li sl o c a t e do nt h ee n do ft h es h o r ta r l t lo fc h r o m o s o m e11a n di s a b o u t2 4c mt om a r k e rc 2a t 5 9 5 9 9 6 0 r l li st e l o m e r i ct ot h er 3 aa n dr i og e n e t h eg e n e t i cm a p i nt h i sp a p e rg i v e sab a s ef o rf u r t h e rc o n s t r u c t i o no fh i g h r e s o l u t i o ng e n e t i cm a po ft h er l lg e n e 4 s y s t e mo fm a g n e t i cs e p a r a t i o nf o rr e s i s t a n c eg e n e sa n dt h e i ra n a l o g sf r o mp o t a t ob a c l i b r a r yw a sc o n s t r u c t e d b ya l i g n m e n tf o rs e q u e n c e so ft h er 3 ag e n ef a m i l y , t h ec o n s e r v e dp r o b e so f t h i sg e n ef a m i l yw e r ed e v e l o p e d a n dt h e n ，t h ed n ao fb a cs h 2 3 g 2 3c o n t a i n i n gt h er 3 ag e n e w a sp a r t i a l l yd i g e s t e di n t o7 1lk bf r a g m e n t s b ym a g n e t i cs e p a r a t i o ns y s t e mc o m b i n e dw i t h c o n s e r v e dp r o b e s ，t h e7 11k bf r a g m e n t sw e r ee n r i c h e da n dc l o n e di n t ob i n a r yv e c t o rp b i n p l u s t h r o u g hi d e n t i f i c a t i o no fp o s i t i v ec l o n e sa n dc o l o n yp c r ，t h er a t i oo fc l o n e si n c l u d i n gr 3 ag e n ei n a l lp o s i t i v ec l o n e sr e a c h e d8 2 7 6 ，w h i c hw a sn e a r l y19t i m e st h a nw i t h o u te n r i c h m e n tb ym a g n e t i c s e p a r a t i o ns y s t e m p o s i t i o n a lc l o n i n gi st h em a i na p p r o a c ht oi s o l a t en e wrg e n e s h o w e v e r , i t s v e r yd i f f i c u l tt oa p p l yp o s i t i o n a lc l o n i n go nc u l t i v a t e dp o t a t ot h a ti saa u t o t e t r a p l o i d i nt h i ss t u d y , s y s t e mo fm a g n e t i cs e p a r a t i o nf o rrg e n e sa n dt h e i ra n a l o g sp r o v i d e san e ws t r a t e g yf o rg e n e c l o n i n gb yc a n d i d a t eg e n ea p p r o a c hf r o mt e t r a p l o i dp o t a t o k e yw o r d s ：p o t a t o ，l a t eb l i g h t ，r e s i s t a n c eg e n e s ，f i n em a p p i n g ，m a g n e t i cs e p a r a t i o n i v 英文缩略表 v i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 弓余蒸七 l h i h j ：7 彬秒存 莎月 同 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，【i 】：中国农、! 科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：貉虹咖： 印9 年6 月歹同 洲躲廖勃删：硎男年衫月石同 中同农q k 科学院博 ：学伊论史第一章绪论 1 1 马铃薯晚疫病 第一章绪论 马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u m ) 属茄科茄属植物，起源于南美洲安第斯山脉一带，是世界上仅 次丁水稻、小麦、玉米的第四人粮食作物，也是世界上最重要的非禾本科作物，世界年产量3 亿吨。 马铃薯丁1 7 世纪传到我国，我国马铃薯常年栽培面积约4 0 0 多万公顷，现在是世界最大马铃薯生产 国，年产量6 8 0 0 万吨，从1 9 8 0 一1 9 8 3 到2 0 0 0 一2 0 0 3 年均增长率6 7 ( q ue ta 1 ，2 0 0 4 ) 。马铃薯营 养丰富、适应性强，在我国既是重要的粮食作物，又是人宗蔬菜作物。马铃薯鲜薯广泛用于加工 附加值高的淀粉、薯片、薯条和全粉等产品，同时随着年轻一代饮食结构的改变，马铃薯在食物 中的比例将有较人增加。因此，马铃薯在我国工农业生产中占有重要地位。 然而我国的马铃薯平均单产只有1 5 0 1 吨公顷，低于世界平均水平1 6 6 0 吨公顷( 中国农业年 鉴编辑委员会，2 0 0 3 ) ，相对于发达国家如荷兰4 9 o o 吨公顷( 最高达到1 0 0 吨公顷) 差距更大， 冈此我国马铃薯的平均单产还有很大增长空间。晚稻收获后，我国南方冬季有1 6 0 0 万公顷左右的 冬闲田，其中大部分没有充分利用，而此时的水、热、光、温条件正是生产马铃薯最有利时期( 屈 冬玉等，2 0 0 5 ) ，因此利用这些耕地来种植马铃薯并发挥其产量潜力，将对于缓解我国的粮食紧 张和保证食物安全起到重要作用。 由致病疫霉菌( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ( m o n t ) d eb a r y ) 引起的晚疫病一直被认为是最具危 害的作物病害之一，是马铃薯世界范围内最具毁灭性的病害，每年引起数十亿美元的损失( k a l l l o u n ， 2 0 0 1 ) ，我国每年冈晚疫病造成的减产损火在1 0 亿美元以上( 宋伯符和谢开云，1 9 9 7 ) 。二十世纪 七十年代末，由丁病原菌a 2 交配型的出现，与原来的a 1 交配型有性杂交，增加了病原的变异性， 导致新生理小种不断产生。全球病原菌群体结构发生的变迁，导致该病害在世界各地流行频繁， 严重威胁着马铃薯生产( f r ya n dg o o d w i n ，1 9 9 7 ) 。联合国粮农组织1 9 9 6 年的年度报告认为，晚疫 病造成的危害性、防治难度及对社会的影响已超过水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作 物病害。中国是世界上马铃薯生产与消费大国，马铃薯晚疫病也严重威胁着我国马铃薯生产。 1 1 1 马铃薯晚疫病病原- - p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s 1 1 1 1p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s 属于卵菌 pi n f e s t a n s 现在被划分为c h r o m i s t a 界，o o m y c o t af - j ，p e r o n o s p o r a l e s 目，p y t h i a c e a e 科， p h y t o p h t h o r a 属，是一种能侵染马铃薯和番茄( s o l a n u ml y c o p e r s i c u m ) 的卵菌。虽然卵菌有很多 类似真菌的特性，但它不再划分为真菌( d i c k ，1 9 9 5 ) 。根据新陈代谢、细胞壁组成和r r n a 序列 研究表明，卵菌与金藻、硅藻和黄褐藻的亲缘关系较近，而与真菌有较远的亲缘关系( 图1 1 ) ( j u d e l s o n ，1 9 9 7 ) 。同一般的植物真菌相比，卵菌具有不同于真菌的能够自主侵染植物的能力，这 表明它具有与真菌截然不同的遗传和生化互作机制，同真正的真菌相比，许多卵菌的生物学特点 是特有的( g r i f f i t he ta 1 ，1 9 9 2 ) 。卵菌的生活史主要以二倍体存在，而真菌却是以单倍体的形式存 1 中同农、i k 科学院博十学伊论史第一帝绪论 在。具有多核的p h y t o p h t h o r a 物种基本上没有或有非常少的隔片。脚t o p h t h o r a 属的病菌的细胞 壁由纤维素和葡聚糖组成，没有几丁质。游动孢子具有双鞭毛，鞭毛具有鞭绳和金色的鞭鞘 ( h e m m e s ，1 9 8 3 ) 。 s l i m em o l d s ) 图1 1 晚疫病菌( pi n f e s t a n s ) 的分类学地位( j u d e i s o n 1 9 9 7 ) f i g u r e1 1t a x o n o m yo fp i n f e s t a n s ( j u d e l s o n ，1 9 9 7 ) 肋y t o p h t h o r a 属另外一个特征是它有双核孢子囊和菌丝细胞，但是游动孢子是单核的( e r w i n a n dr i b e r i o ，1 9 9 6 ) 。砌y t o p h t h o r a 的病菌小种每个细胞有两个或多个不同的核，称之为多核体。当 具有两种不同基因型的菌株的菌丝融合后，接着它们的核混合在一起，这样就形成了多核体 ( l a y t o na n dk u h n ，1 9 9 0 ) 。通过把两种不同生理小种的游动孢子混合在一起，就能够获得异核和 多核的生理小种( j u d e l s o na n d y a n g ，1 9 9 8 ) 。研究结果表明：拟有性生殖是只i n f e s t a n s ( 晚疫病菌) 产生遗传多样性的重要生殖方式。 1 1 1 2 病原生活史 pi n f e s t a n s 属丁活体营养性( b i o t r y p h y ) 致病卵菌，寄主范围狭窄，侵染马铃薯、番茄和其他 5 0 个茄属植物。只i n f e s t a n s 在这些寄主上通常以无性生殖方式繁殖；当存在两种交配型( a 1 和a 2 ) 时，也通过有性的卵孢子繁殖。晚疫病菌的生活史的大部分只能通过显微镜才可以看见( 图1 2 ) 。 在显微镜下呈无色、无隔膜，在寄主细胞间生长，然后侵入寄主细胞，菌丝是只i n f e s t a n s 侵染寄主 的唯一形式。 2 雄器( n 图12 晚癌病菌( pi n f e s t a n s ) 生活史( j u d e is on19 9 7 h 2 u n l2 i m ec y c l eo y p 埘口k h s 【j u d d m 1 螂) pt 啦s 是一个譬化性瘸原，只能引起茄属植物范围内叫片和果实的嫡言。弛子囊i ； = 到 叫上，温度低1 ：1 2 干气候湿洲时，尤性位染即u r 发生。首先袍子囊释放游动孢子游动 艳子萌产隹萌发管，其顶部产生附着胞( a p p r e s o r i u m ) 它能产生侵染钉( i n l b c t i o np e g ) ，从 而进 细胞。有时候，在细胞内产生吸器。侵染3 天后，菌丝在气孔出现之前，随着坏死斑的扩 人腐生扩展。抱囊柄在叶的背面发育，然后产_ ! 三孢子囊米通过空气传播病原。 中国农q p 科学院博l j 学竹论文第一审绪论 晚疫病菌是一个异宗配合的卵菌，有a i 和a 2 两个交配型，是从墨两哥中部的t o l u c a 山谷 进化而来，有性生殖和无性生殖交替是其生活史的显著特点。 无性繁殖：由于环境条件不一样，菌丝侵染寄主后3 1 0 天，孢囊梗将成丛地从叶背气孔伸 出，叶背面气孔比上叫表分布的多，因而叶背面更容易观察到孢子。游动孢子囊在这些孢囊梗的 末端发育。游动孢子囊成熟后很易碎裂，并随风飘散，大多数孢子飘出几米后即落下来，也有的 孢子能飘出3 0 公里以外。在显微镜下，游动孢子早柠檬状，它能直接萌发和间接萌发。2 0 以 上( 最适2 4 ) ，游动孢予囊直接萌发，就像单个的孢子一样，先形成萌发管，然后萌发管刺入 植物组织，进行再侵染。自然条件下，直接萌发意义不大。1 2 1 6 时，孢子囊间接萌发，每一 孢子囊释放出1 0 一2 0 个游动孢子，每个游动孢子着生两根鞭毛，游动孢子依靠鞭毛，可以游动几 分钟到几小时。在某些条件下，它们可能失去其鞭毛，形成细胞肇和萌发管，萌发管能直接侵入 叶部和苹部皮层( 不一定从气孔进入) ，经过伤口或皮孔侵入块茎组织。因为病菌不能在寄主组织 外长期生存，如果没有适当的寄主，游动孢子就会死亡。 有性繁殖：pi n f e s t a n s 也能经过有性方式进行繁殖。a 1 和a 2 两种交配型具有亲和性，不同 于荷尔蒙产生和引起的反应，也有别于动物的二态有性方式。在交配激素的影响下，配子( 雄器 和雌器) 形成，此时菌体正常生长和无性孢子形成受到抑制。单倍体核在配子器中产生并发生核 融合，形成双倍体核的卵孢子。卵孢子很快成熟，一层厚壁形成，这层厚肇能够保护卵孢子在土 壤中存活许多年。卵孢子萌发后，具有a 1 或a 2 交配犁的新后代产生( j u d e l s o n ，1 9 9 7 ) ，从而开 始新一轮侵染循环。 止冈为晚疫病菌存在两种繁殖方式，无性繁殖使其能迅速扩散传播，有性繁殖能使其遗传多 样化，变种增多，增加了防治难度，所以晚疫病作为最重要的马铃薯病害，日益引起世界性关注。 1 1 2 马铃著晚疫病抗性遗传与育种 晚疫病可通过喷洒农药而得剑控制，但这种防治的成本昂贵，而且会增加环境危害性，新的 抗药菌株的出现义会限制可利用的药剂的选择。由于以上原因，寻求一种有实际效果的、能对晚 疫病菌有持久作用的遗传抗性是1 常重要的( b r o u w e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。寄主抗性在保证现有田间产 量和质量标准的前提下能大量减少农药的使用。随着人们对健康和环境无危害的植保手段的关注， 针对马铃薯晚疫病持久抗性的育种就成为现代马铃薯育种体系的焦点( f l i e re ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在1 8 4 5 年著名的爱尔兰大饥荒发生以后，晚疫病抗性育种成为主要的育种工作之一( c o s t a n z o e t a l 2 0 0 4 ) 。 早在1 0 0 年前，人们就在一个墨西哥野生种d e m i s s u m 中发现对晚疫病的抗性单基因( 威壁冈) ， 并把这些基因引入剑栽培种中，这些材料构成了2 0 世纪3 0 年代到5 0 年代的晚疫病抗性育种的基础 ( b l a c ke ta 1 ，1 9 5 3 ；m a l c o l m s o na n db l a c k ，1 9 6 6 ) 。然而向马铃薯栽培种中引入对晚疫病小种专一 抗性的尺基因只能提供暂时抗性，这种尺基因介导的抗性不久就会被新的病原小种所克服( f r ya n d g o o d w i n ，1 9 9 7 ) 。在马铃薯野生种也鉴定出了数量抗性( q u a n t i t a t i v er e s i s t a n c e ) 或田间抗性( f i e l d r e s i s t a n c e ) ，这种抗性比月基因介导的抗性持久，但这种抗性很难通过杂交和表犁选择转到栽培种 中去( b a l l v o r ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 。随着分子生物学和基因上程技术的发展和完善，针对马铃薯晚疫病 抗性分子机理研究和遗传操作变得可能，这为晚疫病的防治开启了一扇大门。 4 中国农q p 科学院博l ：学位论艾第一审绪论 1 1 2 1 马铃薯抗病性的遗传 栽培马铃薯( s o l a n u mt u b e r o s u ms s p t u b e r o s u m ) 远非遗传分析的理想材料，它是四倍体 ( 2 n - - 4 x = 4 8 ) ，具有四体遗传特性。由于重复自交引起的近亲衰退形成遗传上的高度杂合性。在 每个基冈座上都存在四个等位基因中的一个，这样就形成一个纯合和四个杂合的基因型：a 。a 。a ， a l 、a l a 2 a 3 、a l a l a 2 a 3 、a l a l a 2a 2 、a l a 2a 2a 2 。基冈型杂交之后的相互重组可以产生2 5 个 遗传研究模型。最简单的抗病遗传模型只有一种等位基冈状态的四倍体植株主效r 基因的单基因 遗传，纯合的为r r r r ，杂合的为r r r r 、r r i t 和r r r r 。在杂合的抗性植株和纯合感病的植株( 眦) 间杂交的期望孟德尔抗感分离比例依次为l ：o 、5 ：1 和l ：l 。 f l o r ( f l o r , 1 9 7 1 ) 的“基因对基冈”学说认为，每个寄主植物的抗病基因( 尺) 都存在一个病 原无毒基因( a v r ) 。a v r 基因的产物能够被r 基因产物识别。在这种识别过程中需要不同基冈借 导的防卫反应的启动。这种“基冈对基冈”的概念是与马铃薯种中研究的大部分抗性单基冈的作 用原理符合的，这个概念被经典的遗传分析所证明，例如抗性基因h i 及其对应的根结线虫中的 a v r 基因，通过分子的研究证明p v x 农壳蛋白基因是作为a v r 基因对应于抗性基冈r x ，这个抗性 基因的结构与从植物中克隆的许多其它的j r 基因的结构是相似的。 科技文献中的单基冈抗性( 垂直抗性) 的概念是源于简单孟德尔遗传，而非源于自然的致病 系统( p a t h o s y s t e m ) 中的流行性。然而，非孟德尔遗传，抗性水平上的量变在野生种和栽培种中 是j “泛存在的。这种水平抗性或者田间抗性被认为是由多基因或微效基冈复合物控制的。这两种 抗性的区别，质量抗性和数量抗性，垂直抗性和水平抗性，是由主效尺基冈和微效基因或多基因 控制的，但这两种抗性在表型水平上却不容易划清界限。在植病互作过程中主效基因抗性和微效 基冈抗性的关系就像高人的山峰和它_ 卜- 面绵延的山脉一样( g e b h a r d ta n dv a l k o n e n 。2 0 0 1 ) 。 1 1 2 2 抗性资源 马铃薯结块茎种的种质资源多样性为抗各种生物和非生物压力提供了丰富的基冈资源。在这 些资源中，& d e m i s s u m 是对晚疫病抗性利用最好的一个野生种。这个杂合六倍体种能直接和四倍 体的& t u b e r o s u m 杂交。另外，二倍体种p h u r e j a 也可以作为sd e m i s s u m 和墨t u b e r o s u m 杂交的桥梁 种。早在一个世纪以前来源于sd e m i s s u m 的尺基因就引入了栽培种中( m u l l e r ，1 9 5 2 ) 。据r o s s ( r o s s ， 1 9 8 6 ) 推测前联邦德国8 3 的马铃薯品种都携带有来源于d e m i s s u m 的基冈。从其它种如 a n d i g e n a ，a c a u l e 、& b u l b o c a s t a n u m 和& s t e n o t o m u m 等( l a n d e oe ta 1 ，1 9 9 5 ；h a y n e sa n dc h r i s t ， 1 9 9 9 ) 引入r 基因或进行遗传分析方面也做了大量的研究，但很少应用于栽培种水平。其中一个重 要原因就是杂交障碍。例如，利用a c a u l e ( 2 n = 4 x - - 4 8 ) 和& p h u r e j a ( 2 n = 2 x = 2 4 ) 作为双桥梁种 b u l b o c a s t a n u m ( 2 n = 2 x = 2 4 ) 引入尺基因到t u b e r o s u m 的工作，在2 0 世纪7 0 年代早期建成了a b p t 品系( h e r m s e n ，1 9 9 4 ) ，可是直到2 0 0 4 年才选育出携带a b p t 品系基冈的品种b i o g o l d ，但这个被 育种界寄予厚望的品种在田间释放一年就被晚疫病菌所克服。通过传统杂交育种对野生资源利用 存在许多困难，但随着分子生物学的兴起及其技术的日渐成熟，对野生抗性资源的搜集和利用又 掀起了新的高潮。 5 中同农业科学院博十学忙论文销一章绪论 1 1 2 3 育种方法 1 传统杂交育种 常规抗性育种主要是采用杂交和回交选育的方法，目前国内外的抗病品种基本上都是采用常 规方法选育而成。但是马铃薯普通栽培种是同源四倍体作物，杂交时基因分离复杂，有利性状出 现频率低，选择效率不高。抗病育种还要涉及植物、病原和环境之间的复杂互作，使抗病育种更 为复杂。垂直抗性的感抗性状明显，选择相对容易，但对于水平抗性，由于感抗不明显，加之抗 病程度受环境影响较大，使得水平