（分析化学专业论文）食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究.pdf

摘要在食品营养强化剂及保健食品安全这个全球关注的热点问题中， 如何快速、准确地检测食品卫生的问题已成为重中之重，但是分析食 品的困难很多。本实验结合液质联用技术具有很好的灵敏度、专属性、 可信度和样品前处理简单等优点，为食品营养及保健食品安全分析提供可靠的定性分析和高灵敏度的定量分析结果。本论文主要内容如 下： 1 综述了食品营养及保健食品安全发展状况和所面临的问题， 讨论了 ，l c e s i m s 的优越性及其在食品检测中的应用。 2 氨基酸是组成生物大分子的基本单元。本文建立了邻苯二甲 醛( o p a ) 手动柱前衍生反相高效液相色谱法测定样品中氨基酸含 量的方法。优化高效液相色谱对目标物的分离条件，定性、定量研究了1 5 种氨基酸，并将优化结果直接应用于珍珠粉中各氨基酸的含量测定。 3 维生素作为有机体生长和发育所必需的营养物质越来越受到 人们的重视，在食品、保健品及药品中的测定也变得越来越频繁。本研究采用 玎) l c e s i m s 分析方法，在快速、准确地同时检测水溶性 维生素方面具有独特的优势，为质量监控提供了有效分离分析手段，此技术将更加广泛地应用于食品工业中。 4 西布曲明为减肥处方药，禁止添加到保健食品中。本研究建立盐酸西布曲明及双去甲基西布曲明的液相分离条件，提高了检测的 抗干扰能力和检测限。探索最佳的质谱条件，提高定性的可靠性，能够对保健食品中的西布曲明及其代谢物进行准确检测。 a b s t r a c t i nt h eg l o b a lh e a t e dd i s c u s s i o n ，h o wt oc h e c kt h en u t r i t i o ne n h a n c e r a n ds a f e t yo fs u p p l e m e n t a r yf o o dh a sb e c o m eac r u c i a lp r o b l e m a t p r e s e n t ，t h e r e a r es t i l l m a n yd i f f i c u l t i e s i n a n a l y z i n gf o o d u s i n g h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y e l e c t r o s p r a y m a s s s p e c t r o m e t r y ( h p l c e s i m s ) h a sa d v a n t a g e s o f s e n s i t i v i t y , e x c l u s i v e n e s s ，r e l i a b i l i t ya n ds i m p l ed i s p o s a lo fs a m p l e s t h i se x p e r i m e n t p r o v i d e sr e l i a b l eq u a l i t a t i v ea n a l y s i sa n dh i g h l ys e n s i t i v eq u a n t i t a t i v e a n a l y s i sf o rt h en u t r i t i o ne n h a n c e ra n ds a f e t yo fs u p p l e m e n t a r yf o o d t h e s t u d y i n gr e s u l t sa r ei n t r o d u c e di nt h i st h e s i sa sf o l l o w s ： 1 t h er e c e n t p r o g r e s s o fn u t r i t i o ne n h a n c e ra n d s a f e t y o f s u p p l e m e n t a r yf o o dh a sb e e ns u m m a r i z e d t h ep r o b l e m st h e ym e tw e r e a l s os u m m a r i z e d t h ei m p r o v e m e n ti nh p l c e s i - m st e c h n i q u ea n dt h e a p p l i c a t i o no f t h i st e c h n i q u ew e r ed i s c u s s e d 2 am e t h o df o rm e a s u r e m e n to fa m i n oa c i d s ，t h eb a s i cu n i to fl a r g e b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e ，b yh p l ca n do r t h o p h a l a d e t y d e ( o p a ) p r e c o l u m nd e r i v a t i o nw a sd e s c r i b e d e x t e r n a ls t a n d a r d i z a t i o nm e t h o d w a su s e df o rd e t e r m i n i n gq u a n t i t yo f15a m i n oa c i d s t h em e t h o dw a s a l s oa p p l i e df o ra n a l y z i n gf r e ea m i n oa c i d sc o m p o s i t i o n o f p e a r lp o w d e r 3 v i t a m i n sa r en e c e s s a r ys u b s t a n c e si nt h eo r g a n i s mw i mn o r m a l m e t a b o l i s m i nt h i sp a p e r , ah p l c e s i - m sm e t h o df o rs i m u l t a n e o u s h i d e t e r m i n a t i o no ft a u r i n ea n dt e nw a t e rs o l u b l ev i t a m i n sw a sd e v e l o p e d a n dv a l i d a t e di nm u l t i v i t a m i nt a b l e t s ，w h i c hc a l la l s ob ea p p l i e di n c l i n i c a ld e t e c t i o na n df o o dr e s e a r c h 4 as e n s i t i v ea n ds p e c i f i cm e t h o df o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f s i b u t r a m i n ea n di t sm e t a b o l i t e ，n - d i - d e s m e t h y l s i b u t r a m i n e ，t h ei l l e g a l f o o da d d i t i v ei n w e i g h t l o s sh e a l t h yf o o d ，w a si m p r o v e d ，b a s e do n h p l c e s i - m s t h em e t h o dh a sg o o ds e n s i t i v i t y , a c c u r a c y , p r e c i s i o na n d s p e c i f i c i t y a n d i ti ss u i t a b l e f o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f s i b u t r a m i n ea n di t sm e t a b o l i t ei nw e i g h t - l o s sh e a l t h yf o o d k e y w o r d s ：h p l c e s i - m s ，n u t r i t i o ne n h a n c e r , s u p p l e m e n t a r yf o o d s a f e t y , a m i n oa c i d ，v i t a m i n ，s i b u t r a m i n e i v 一 分 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分 耐产毓戮，魏薹雾懿斐薹蓄霎双随鞭辨啤| ! j ；! 雾；羹嘲一盈雾雾菰茬霸 磊湍哔镣鬟簋瓮壤骂虿磊篡蕊碧葱型星箍缆鉴妻霞i 幕f 羹潞鬈激昔 桊纂；舶屯；羹i 币嘲鎏；羹剁氰霉奠坦纛墅蓁发达国家的人民已经 实现控制微营养 素缺乏症的目标，但全球仍有1 3 以上的人因不同程度上缺乏锌、铁、 碘和维生素等在内的营养素而患上贫血症、精神障碍、发育迟缓、免 疫系统疾病等，严重影响了人们日常的学习和工作，甚至导致死亡。 尤其是在经济还不太发达的亚太地区，集中了全球34 的营养素缺乏 者。根据亚洲开发银行的统计，目前在亚太地区仍有约l 3 的学龄前 儿童及母亲存在维生素a 缺乏的亚临床表现，有近1o 亿人没有食用 碘化盐。此外，在发展中国家由缺乏微营养素、医疗费用增加和生产 率下降所造成的经济损失高达其国内生产总值的5 ( 据世界银行的 研究结果) ，如果不解决微营养素缺乏的问题，将无法实现该地区的 人民健康和经济繁荣，因此绝大多数发展中国家营养强化任务将任重 、3 0 、 】苴迈。 我国是发展中国家，食品营养强化工作起步较晚，2 0 世纪5 0 年 代，开始在大豆、大米为主要原料的婴儿代乳粉中添加骨粉、维生素 等微营养素，成为食品营养强化的先例。2 0 世纪8 0 年代，我国已能 生产各种维生素( 除生物素以外) ，其主要中间体仍依赖进口，成为 我国营养强化的初级发展阶段。2 0 世纪9 0 年代，我国经济的高速发 展推动我国商品化的营养素工业也大幅度增长，如各种维生素及中间 体的生产技术都有了突破性进展，使得我国营养强化工作取得了长足 的进步。当前我国食品营养素已能基本满足国内人民需要，部分产品 在国际上处于领先地位，但某 食匦薹冀薹雾羹蓁蓁蓥薹蚕薹羹薹寨蜓羹鬟蓁耋囊薹冀囊 篓蓄；答蔷略望；菰进对箱髅筠磊徽萋矍零醒些著；封鞋堇冀薅雌 冀襦萎藕i 萋蓠营蠢菠箱球；商鐾蓊漓熠蹦裂雾霎塑啊；复锕蓁 料册翦型强霎羹萨赫滴翮辅。蝤蓥i 羹丽撕蓁翌薹茧蠢丽蒲覃攀雾髓 舀瘫印蠢藕；霎薹型萋婺咧塑篓啦耀犄蓁灞崩骂薹落萋霹；蓊蓠；j ；j ! 黼 灞当；筠治捏搓竖丝鋈瑟墼霎。孺拦萤薹懂型城崔糖薹型。色法等技术来 进行食品安全的检测，但这些方法一般灵敏度较低，选择性不高，应 用范围也很窄。当前随着科技的发展，一些先进的现代化检测技术在 食品营养及安全检测中得到应用，如超临界流体提取【15 1 、气质联用、 液相色谱质谱联用技术( l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c 们m e n y ， l c m s ) 【1 6 1 、毛细管气相色谱【1 7 1 、酶免疫分析【1 8 1、毛细管电泳1 9 之0 1 、 生物传感器【2 l 】等。这些新技术的共同特点是：灵敏精确，省时省力无 污染，样品用量少，能提高提取和净化效率，实现微型化和自动化【1 3 1 。 但液相色谱法在通用性和灵敏度上不如液相色谱质谱联用技术；生 物传感器、免疫分析法灵敏，但只能同时测定一类物质，使用范围受 到一定的限制。液相色谱与紫外联用技术要求所检测的物质有发色 团，更缺乏专一性。气相色谱质谱联用技术可使样品的分离、定性 及定量一次完成，但要求样品具有一定的挥发性，因此大多数情况下 所研究的食品需要经过适当的预处理和衍生化，使之成为易气化的样 品才能进行气质联用分析，加大了样品预处理过程的难度。而液质联 用技术( l c m s ) 由于具有很好的灵敏度、专属性、可信度，而且样 品前处理简单等优点，能为食品营养及安全分析提供可靠的定性分析 结果和高灵敏度的定量分析结果，目前在食品安全检测中已得到越来 越广泛的应用。 硕士学位论文 第二章邻苯二甲醛柱前衍生h p l c 法测珍珠粉中 的氨基酸含量 1 前言 氨基酸作为组成生物大分子的基本单元是阐明多肽和蛋白质结 构的基础，它在生命科学、制药、食品、饲料及临床检验等领域都有 非常重要的意义。经典的氨基酸分析方法是由m o o r e 和s t e i n 在2 0 世纪5 0 年代建立的，氨基酸由离子交换色谱分离后用茚三酮显色鉴 定，我们一般称之为柱后衍生法。该法虽然准确可信，但由于操作繁 杂、分析时间长且灵敏度不够高，已不能满足现代科学发展的需要。 随着生命科学和生物工程的深入研究，2 0 世纪7 0 年代迅速发展的反 相高效液相色谱技术在氨基酸分析中得到了广泛的应用，为氨基酸的 快速、简便、高灵敏度分析提供了有利的条件。荧光柱前衍生技术使 检测灵敏度提高了两个数量级，达到了p m o l 级。常用的衍生方法有： d a b s 法( 衍生剂为磺酰氯二甲胺偶氮苯d a b s y l c 1 ) ，d n s 法( 衍 生剂为丹酰氯- d a n s y l c 1 ) ，n 帕c 法( 衍生剂为氯甲酸芴甲酯 n 压d c c 1 ) ，p i t c 法( 衍生剂为异硫氰酸苯酯p i t c ) 和o p a 法( 衍 生剂为邻苯二甲醛o p a ) 等【4 8 4 9 1 。前四种方法存在反应活性差、速 度慢、灵敏度低、反映试剂干扰等缺点，而柱前衍生试剂o p a 具有 衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定等优点，其应用最 为广泛【5 1 1 。笔者改进了已有的o p a 衍生方法，由本实验室条件， 改善分析方法，应用于实际样品的大批量检测。 本文用w a t e r sp u m p5 1 5 双泵高效液相色谱仪，以o p a 为衍生试 剂，优化分离条件，测定了珍珠粉中1 5 种氨基酸的含量。该法操作 简单、重现性好，适于分离大批量样品。 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究 2 实验部分 “ 2 1 仪器 w r a t e r sp 硼叩515 双泵高效液相色谱仪，w a t e r s7 2 0 型色谱控制系 统，w - a t e r s7 1 0 b 型自动进样器，w a t e r sm a s s l y n x l m3 5 数据处理软 件( 美国，w a t e r s 公司) ，配岛津r f 1 0 a 荧光检测器( 日本，岛津 公司) ；a l 2 0 4 电子天平( 上海梅特勒托利多仪器有限公司) ； j c x 2 5 0 w 超声波清洗机( 山东济宁超声电子仪器厂) 。 2 2 化学试剂 丙氨酸( a l a n i n e ，a 1 a ) 、精氨酸( 鹕i n i n e ，a 玛) 、天冬氨酸( a s p a r t i c a c i d ，a s p ) 、谷氨酸( g l u t a m i n ea c i d ，g l u ) 、甘氨酸( g l y c i n e ，g l y ) 、 组氨酸( h i s t i d i n e ，h i s ) 、异亮氨酸( i s o l e u c i n e ，i l e ) 、亮氨酸( 1 e u c i i l e ， l e u ) 、赖氨酸( 1 y s i n e ，l y s ) 、蛋氨酸( m e t h i o n i l l e ，m e t ) 、苯丙氨酸 ( p h e n y l a l a n i n e ，p h e ) 、丝氨酸( s e r i n e ，s e r ) 、苏氨酸( t i l r e o n i i l e ， m ) 、酪氨酸( t y r o s i i l e ，研) 、缬氨酸( v a l m ，v a l ) 由中国疾病预 防控制中心购得( 中国，北京) ，标准品的纯度高于9 9 。 超纯水采用m i l l i q 纯水系统( m i l l i p o r e 公司，美国) 制得，甲 醇( c h 3 0 h ) 、盐酸、氢氧化钠、硼酸钠、醋酸钠和巯基乙醇均为分 析纯( 上海三浦化工有限公司) 。 2 3 标准溶液的配制 丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨 酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、 缬氨酸标准储备液的配制如下：称取一定量的标准品溶解于o 1m o 们 盐酸，每种标准溶液的浓度为1 om 咖l 。分别取0 5m l 丙氨酸、甘 氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸；o 8l n l 谷氨酸、 组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、酪氨酸；1i n l 精氨酸、天冬氨 酸转移到1 0i i l l 的容量瓶中，加水定容到刻度获得混合标准溶液，将 硕士学位论文 此标准液逐渐稀释得到一系列做校正曲线的工作溶液( 浓度范围见表 2 4 ) 。储备液在7 天内使用，工作液当天配制，均保存在冰箱中，使 用前让其恢复到室温，这些溶液用于珍珠粉中各氨基酸组分的定性、 定量分析。 2 4o p a 衍生试剂的配制 1 5 0 0m go p a 溶于l om l 甲醇，用o 4m o l l 硼砂钠( 氢氧化钠 调p h 值至1 0 ) 稀释到1 0 0 砌。 2 加4 0 0i j l l 巯基乙醇( 2 m e r c a p t oe t h a l l o l ，2 m c e ) 摇匀，过 滤，于4 冰箱中保存。 3 放3 4m l 溶液至m s p 瓶中，用硅树脂隔膜盖子盖住，但无 需太紧，避免形成真空。每三天从1 0 0m l 储备液中加满m s p 瓶中 的溶液，4 冰箱中保存。o p a 在这一段时间内是稳定的，但是每隔 三天应加入4 0 l 的2 m c e 到1 0 0m lo p ! a 衍生剂中，平衡巯基乙醇 挥发带来的损失，避免影响实验的重现性。 2 5 样品溶液的制备 本实验供试样品为珍珠粉( 1 5g ) 在5 0 0m 1 人工胃液溶液( 1 0m m l 胃蛋白酶的水液，含1 6 4 稀盐酸，3 7 o 5 ) 中的溶出样品， 购自市场。n m 组为纳米粉体溶出量样品，c w 组为超微粉体溶出量 样品，c g 组为常规粉体溶出量样品。进样前过o 4 5 阻滤膜，滤液 经衍生化处理后，直接进 玎? l c 系统分析。所有样品均保存在冰箱 中，使用前恢复至室温。 2 6 衍生及分析 m o d e l7 2 0 程序控制自动进样，智能样品处理系统( w - a t l 潞 i n t e l l i g e n ts 锄p l ep r o c e s s o r ，w i s p ) 被系统控制器中o 】) e 鼬m 0 n 表 控制。本控制系统使用两套泵装置，第一套泵取九衍生试剂进入 1 2 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究 w i s p ，第二套泵取氨基酸样品和运行梯度。两个泵的初始流速均设 为o ，这就使s p 仅进行注射循环，而不进样。例如a 在1 号 瓶，氨基酸溶液在2 号至5 号瓶，因为操作的最大次数是5 0 ，对每 个样品瓶都需要操作两次，所以最大的样品数是2 4 。o p e r 棚o n 程序见表2 1 。 t 出l e2 lt h ec o n t r o lp m c e d u r eo f 廿l eo p e r a t i o n 。e x p r e s d 弱m e t h o d1 c o n t a j i l sp u m ps e tl ，w h e 陀t i l en o wf a t ee q u a l sz c r 0w i mn 0 争a d i e n tp m g 硒m be x p r e s s e d 舔m e m o d 2c o n 缸l i n sp 啪ps e t2 2 7 s p 程序 使用控制系统m o d e l7 2 0 时，表2 2 中的参数值必须输入m s p 系 统。 i a b l e2 - 2t h es e t u po f w i s pp a n u n e t e r 2 8h p l c 工作条件 硕士学位论文 色谱柱：色谱柱为s p b 槲g e lc 1 8 ( 2 5 0 i i h n 4 6m m ，5 p m ，大连江 申) ：柱温为3 5 ；流动相a 为o 0 5m o 价醋酸钠水液：四氢呋喃： 甲醇= 9 6 ：2 ：2 ( v ：v ：v ) ，流动相b 为甲醇：水= 6 5 ：3 5 ( v ：v ) ； 流动相分别用o 4 5p m 的微孔过滤膜过滤，超声脱气2 0m i n 后使用。 梯度洗脱条件( 第二套泵程序) 见表2 3 。进样前，色谱柱用流动相 a 平衡1 0m i n 。荧光检测器：发射波长3 3 8m ，激发波长4 3 0 姗。 ! 鲨堡至：三q 堡垒迪坐皇! 坐i q 翌巳塑g 翌里q ! 兰堡垦g t i m e ( m i n ) f l o wm t es o l v e n t a ( )s o l v e n tb ( )g m d i e n tc u r v e ( m m ) 0o1 0 00 20 1 1 0 0 0 l ( i s o c r a t i c ) 2 51 51 0 0o 6 ( 1 i n e 砷 1 41 55 05 0 5 ( n o n i i n e 岫 2 31 50l o o5 2 81 51 0 00 l l ( n o n - l 妯e 砷 3 501 0 001 1 2 9 色谱柱的维护 本实验的流动相为高浓度的缓冲盐，对色谱系统和色谱柱的寿命 都会产生一定的影响，因此在使用后进行以下的维护措施： 流动相必须严格过滤和脱气。 每天实验结束后，要注意分别用不小于5 0i i d 的蒸馏水、5 0 甲醇水液和1 0 0 甲醇先后清洗管路和色谱柱。 每隔六个月用6m o n 旧3 冲洗整个系统( 除去色谱柱) ，使 流路的不锈钢表面钝化。 3 结果与讨论 3 1 衍生的选择 1 4 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究 本法采用的是柱前衍生反相高效液相色谱法，即氨基酸样品在分 析前与o p a 试剂衍生反应，碱性条件下生成具有强荧光的物质，然 后由反相高效液相色谱法进行分离，最后用荧光检测器定性、定量分 析。与传统柱后衍生法比较，该法避免了氨基酸在柱后的稀释，从而 大大提高了分析的灵敏度。高效液相色谱荧光检测技术分析氨基酸克 服了紫外检测器分析周期长的缺点，更重要的是其灵敏度比紫外检测 器高，有良好的选择性，检测下限仅是紫外检测器的1 1 0 1 1 0 0 ，更 适于微量分析。 氨基酸是带正负电荷的极性化合物，他们的极性阻止了与非极性 固定相的相互作用，从而导致分辨率下降，然而o p a 的柱前衍生物 能够很容易在亚皮摩尔水平进行分离检测，因此如果要求高灵敏度且 仅检测伯胺的时候可以选用柱前衍生技术。衍生方式与柱后衍生方式 相同，衍生产物是o p a 衍生试剂与伯胺氨基酸的加和物。然而衍生 产物在反应介质中不稳定，为了获得好的结果，我们必须立即分析。 3 2 进样方式的选择 高效液相色谱法的进样系统分为手动进样和自动进样两种方式。 本实验过程中，首先采用手动进样方式，分别取2p l 氨基酸的混合标 准溶液( 或处理好的样品溶液) 和2p lo p a 衍生试剂混合，在注射 器中来回抽取五次，混合均匀后通过六通进样阀( 定量环为2 0p 1 ) 直 接注入高效液相色谱仪进行分析。以上过程在2 血n 之内完成，但重 现性很不理想，因为其衍生过程不能控制，绝对含量不能确定。在此 基础上进行改良实验，用棕色小瓶装1 0 0 “l 的混合氨基酸标样和1 0 0 i l l 的衍生剂，轻轻振荡摇匀，在避光条件下反应2m i i l 后加入o 1m o 磷酸二氢钾反应终止液，进样2 0p l ，以上过程在规定时间之内完成， 但效果仍不明显。 因此，本实验采用自动柱前衍生技术，取一部分衍生试剂和一部 1 5 硕士学位论文 分氨基酸溶液混合，然后把衍生产物自动进样。自动进样器通过程序 的设定与控制来实现定时定量的进样，这种方式轻松简便，即使在夜 间无人时也能自动工作，能充分提高仪器的利用率，更为重要的是由 于采用机器进样，减少了人工取样及进样所带来的误差，因而重现性 好，精确度和准确度高，成为氨基酸组成分析的首选方式。 3 3 衍生反应时间的选择 氨基酸与o p a 试剂反应的程度直接与衍生反应的时间相关。时 间过短会使反应不彻底，过长又会使生成物迅速破坏，直接影响检测 结果的准确性和重现性。因此，准确的控制衍生反应时间是整个测定 的关键。 本实验中氨基酸与0 p a 试剂的衍生在自动进样器上进行，由第 一套泵程序精确控制反应时间。实验过程中，衍生反应在室温下3 0s 内即可发生，随着反应时间的增加，衍生产物的峰面积增加。大多数 氨基酸在3m i n 时峰面积最大，之后随反应时间的延长，生成物反而 会分解，其峰面积下降，故反应时间以2m i i l 为宜。 3 4 色谱条件的选择 3 4 1 色谱柱的选择 反相键合相的柱效高，理论塔板数可达每米五万以上。由流动相 的组成和性质的改变，调节和控制溶质的保留行为，使种类繁多、性 质差异较大的氨基酸获得分离。本实验选用的是c 1 8 填料( 在硅胶基 质上键合十八烷烃基) ，氨基酸经衍生后在其结构上引入了大基团， 使得氨基酸的极性降低，得到更有效的分离。本实验对照使用了 s p h e r i g e lc 8 柱，分离效能不如s p h e r i g e lc 1 8 柱。 3 4 2 柱温的选择 柱温高，氨基酸出峰时间提前，但柱子易老化；柱温低，氨基酸 出峰时间推迟，且造成柱压过高，从而影响泵的寿命。实验结果表明 1 6 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究 柱温在2 5 4 0 之间分离效果较好，3 5 分离最佳。 3 4 3 流动相的选择 为了使结构相差较大的各种氨基酸从色谱柱上洗脱下来，首先需 要降低它们之间的亲和力，有效的方法是提高洗脱剂的p h 值和缓冲 盐的浓度( 离子强度) ，这样各种氨基酸以不同的速度被洗脱下来。 本实验首先对乙腈和甲醇两种有机相进行了选择。两种有机相的 分离效能差不多，但乙腈毒性大，色谱纯乙腈价格昂贵，因此甲醇 缓冲盐系统更有实用价值。 实验考察了不同种类的缓冲盐。磷酸缓冲盐的缓冲效能很大，但 使用高浓度的磷酸缓冲盐容易造成盐的凝结，堵塞分离系统；而甲酸 钠的缓冲能力低，达不到本实验分离要求。因此本实验使用醋酸钠 醋酸缓冲盐。 流动相配比的选择对氨基酸的出峰时间和分离效果有直接的影 响。选择原则应首先考虑能使欲分离组分与相邻组分的完全分离，其 次考虑使分离时间缩至最短。经过反复比较，确定流动相a 为o 0 5 m o l l 醋酸钠水液：四氢呋喃：甲醇= 9 6 ：2 ：2 ( v ：v ：v ) ，流动相 b 为甲醇：水= 6 5 ：3 5 ( v ：v ) 能实现各氨基酸的基线分离，而且 样品保留时间较短，故选用做最后流动相。 流动相的p h 值对洗脱会产生影响，相差不大的p h 值会造成峰 的保留行为和峰形发生较大的变化。p h 值在5 8 0 7 8 0 之间大部分氨 基酸可分离。当p h 值偏小，氨基酸全部洗脱所需时间增长；当p h 值偏大，苏氨酸与甘氨酸，异亮氨酸与亮氨酸峰形重叠。反复比较， 本实验最佳p h 值为7 5 0 。精确配制流动相a 液，使p h 为定值，保 证检测结果的重现性。 当流动相中存在少量气体时，一方面会造成泵压力不稳定，影响 出峰的保留时间；另一方面会产生较明显的基线漂移，故每次操作前 1 7 硕士学位论文 都需要对流动相彻底脱气。实践证明，过滤和透气能延长柱子的寿命。 3 4 4 流速的选择 最初2m i l l 的流速为0m i n 是为了保证样品与衍生剂的充分 反应，随后的分离时间，实验分别用过o 8 、1 o 、1 2 、1 5 、2 om l m i n 的流速进行洗脱。流速太小，氨基酸分离差且洗脱时间长，谱峰扩宽， 拖尾严重；流速太大，各组份保留时间均减小，相邻组份间t r 亦减 小，甚至造成峰重叠。因此本实验流速为1 5m l m i n ，能够使氨基酸 达到基线分离。 3 4 5 洗脱液的梯度选择 本试验采用w | a t e r sp u m p51 5 双泵高效液相色谱仪，高压梯度混 合( 最高耐压6 0 0 0p s i ) 。两个不同的输液泵分别输送流动相a 液和 b 液，通过控制各自的流速实施溶剂梯度洗脱程序。高压混合方式对 梯度的控制极为精确，重现性很好，因此本实验选用高压混合梯度洗 脱方式。 根据氨基酸出峰过早降低b 液比例，氨基酸出峰过迟降低a 液 比例的原则，并由分离情况试用了多种梯度曲线，设计了几种洗脱液 梯度。若2 5 1 4m i n 内，采用7 号曲线，1 4 2 3m i n 内，亦采用7 号 曲线，色谱峰整体推后，且l o 号峰( 蛋氨酸) 、1 1 号峰( 缬氨酸) 和1 2 号峰( 苯丙氨酸) 重叠，见图2 1a ；调整梯度曲线，1 4 2 3m i n 内，采用5 号曲线，l o 号峰( 蛋氨酸) 、1 1 号峰( 缬氨酸) 和1 2 号 峰( 苯丙氨酸) 得到很好的分离，但8 号峰( 丙氨酸) 和9 号峰( 酪 氨酸) 重叠，见图2 1b 。要得到较好的分离，需要使梯度起始的一 段时间内强度变化迅速，随着时间的增长，溶剂强度的变化缓慢，即 2 5 1 4i i l i n 内采用2 号曲线，1 4 2 3 面n 内采用5 号曲线，色谱峰整 体前移，大大缩短保留时间，且所有的色谱峰得到了基线的分离。基 线漂移是流动相中所用的甲醇不纯所致。结果表明：采用表2 3 的梯 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究 度程序，氨基酸的分离效果最好。 i a l !誊羹 l l a博 f 毒 j l ! i j 。 叭；豫 秉天足： j l b 舞嚣 高2 孽= 2 胍，、袱引要，曼胍 t f i g 2 一lt l l ec i 聃m a t o g r 锄o f 龇i l i n o a c i ds t 龇l d 矾m i ) 【t i l a ：2 5 一1 4 m i i l g r a d i tc u r v e ：7 ；1 4 一乏3 m i f l g r a d i e n tc u r v e ：7 b ：2 5 1 4 m i i l g r a d i e n ta l r v e ：7 ； 1 4 2 3 m i l l g 砌i e n tc u n ，e ：5 c ：2 5 1 4 m i i l g r a d i e n tc u r v e ：2 ；1 4 2 3 m i l l ，g r a d i e mc u e ：5 p e a km m i b e r 笛f o l l o w s ：l ：a s p ，2 ：g l u ，3 ：s e r 4 ：h i s ，5 ：g l m6 ：n 嵋7 ：a r g ，8 ：a l a ， 9 ：耽1 0 ：m 吡l l ：，1 2 ：p h e ，1 3 ：i l e ，1 4 ：k 屿1 5 ：l y s 宣 o o o o n n 骆罂。咖舡甾醐蜮g七b集凿禽爵翅趟密如罂楚较恒罂呕州浆柱堪韫旺将蒂旺趟q巷醐g碌器lij盈 uz口z uzqzfl uz，qzfl h工v一盈 _皇，i盈 a a _ - 一趸 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究 | | 1 斟4 n i c o t i n i ca c i d e s i ( + ) 1 1 2 51 1 7 52 2 2 52 2 7 53 3 2 53 辆4 0 04 巧4 5 04 7 5 1 2 6 3 t a u r i n e e s i ( + ) 2 5 1 3 星星 薹垂 零 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 2 0 0 2 2 52 5 0 2 7 5 3 0 0 3 2 53 3 7 54 0 04 2 54 5 0 4 7 5 0 星室 薹垂 零 1 8 0 5 h i p p u r i ca c i d e s i 3 5 9 5 | 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 2 0 0 2 2 52 5 02 7 5 3 0 03 2 53 5 03 7 5 4 0 04 2 5 4 5 0 4 7 5 0 1 7 8 5 h i p p u r i ca c i d e s i ( - ) 1 1 2 51 5 0 1 7 5 2 0 0 2 2 5 2 5 0 2 7 5 3 0 0 3 2 5 3 5 0 3 7 5 4 0 0 4 2 5 4 5 0 4 7 5 f i g 3 - 3e s i - m ss p e c t r a so fa n a l y t e s 择性实验，有些化合物正、负离子模式都有响应，但叶酸、维生素c 采用负离子模式比正离子模式的灵敏度要高2 3 个数量级，因此选择 灵敏度高的负离子模式，而其他的目标物优先选用正离子模式检测。 3 4 样品的稳定性 各种维生素的化学性质和结构因素相差悬殊，在含水介质中进行 3 9 o1qz 毫一闯岛 硕士学位论文 分析时，受到光、p h 值、空气和温度的影响。大多数水溶性维生素 易见光分解，因此本实验全部试样均储存在棕色容量瓶中，进样瓶也 选用棕色，避光保存。从整体稳定性考虑，系统的p h 值选择在2 5 3 5 之间较为适宜。维生素c 在分析前配制，且为防止维生素c 被空气 中的氧所氧化，样品制备和处理时应彻底脱气( 包括流动相) ，本实 验采用超声波脱气。为避免水溶性维生素的降解，所有的储备液和工 作液均在1 天内使用，且保存在4 冰箱中，使用之前让其恢复到室 汨 恤o 3 5 方法抗干扰能力 一般来说，复方制剂中某种待测物质的质谱信号强度往往低于相 同浓度的标准溶液，其原因主要是样品基质对被测物的离子化有影 响。本文通过在样品中加入内标，消除了复方制剂中所含的极性稀释 剂、填充剂、脂溶性维生素、无机盐、染料、防腐剂以及其它水溶性 维生素对目标物的干扰，故该法专属性强。某一维生素的其它物质含 m l b l e3 2t h er e m a n e n tc o n t e n t so fak i n do fm u l t i v i t a m i nt a b l e t u n i t ：m g t a b l e t u n i t ：i u 量见表3 2 。 3 6 混合标准样品的h p l c e s i m s 分析 在本实验优化的色谱条件下各分析物都能达到基线分离。图3 4 食品营养强化剂及保健食品中的违禁药物分析方法研究 是十二种混合标准品的选择离子色谱图。表3 3 归纳了各目标物色谱 和质谱结果，+ 以及各目标物的特征离子。结果所示，在优化的质谱条 件下，大多数分析物具有稳定且显著的准分子离子峰。 1 1 7 1 2 。八 f i g 3 。4h p l c ，e s i s i re h r o m a t o g r a mo f a0 2m g ls t a n d a r dm i x t u r e p e a kn u m b e ra sf o l l o w s ：1 ：t a u r i n e ，2 ：n i c o t i n i ca c i d ，3 ：n i c o t i n a m i d e ， 4 ：p a n t o t h e n i ca c i d ，5 ：p y r i d o x a l ，6 ：p y r i d o x i n e ，7 ：h i p p u r i ca c i d ， 8 ：t h i a m i n e ，9 ：b i o t i n , 1 0 ：r i b o f l a v i n , 1 1 ：a s e o r b i ca c i d ，1 2 ：f o l i ea c i d 3 7 校正曲线、最低检测限( l o d ) 和最低定量检测限( l l o q ) 一系列不同浓度的工作液可以通过加5 0m g l 内标液稀释储备液来 制得，以确保每份工作液的内标含量为5 0m g l ，各目标物在0 0 1 - 5 0 4 1 硕士学位论文 m g l 或0 0 2 - - 5 0m g l 浓度范围内绘制校正曲线，其至少有六个不同 ! 塾! 堕三曼丛全! 竺竺! 坚i 垡0 里巴型i q 望璺鲤婴望塑曼堕! 皇坚q ! 璺墅型连兰 s e l e c t e di o n i o n i z a t i o n q u a s i - m o l e c u l a r a n a l y t e f w f o r m o d e i o n r e t e n t i o n o t h e ri o n s t i m e * a s c o r b i ca c i d 1 7 6 e s i 一1 7 5 b i o t i n2 4 4 e s i +2 4 5 f o l i ca c i d4 4 1esi440 1 7 5 2 2 7 【m - h 2 0 恬i 】+ 4 4 0 3 6 l i - 0 1 3 21 6 7 ：l - 0 0 4 2 2 3l i - 0 0 2 h i p p u r i ca c i d 1 7 9e s i + 1 8 01 8 01 6 9 0 士0 o l h i p p u r i ca c i d n i c o t i n a m i d e 1 7 9 1 2 2 n i c o t i n i ca c i d12 3 p a n t o t h e n i c 2 1 9 a c i d e s i e s i + e s i + e s i + 1 7 8 1 2 3 1 2 4 1 7 8 1 2 3 1 2 4 1 6 9 0 - 士- 0 0 1 8 9 7 ：- 0 0 3 7 3 5 士o 0 1 2 5 8 【m + k 】+ 1 2 2 1 1 - 0 0 1 p y r i d o x a l 1 6 7 e s i +1 6 81 5 01 3 7 5 ：t - 0 0 2 p y r i d o x i n e 1 6 9e s i +1 7 0 1 7 01 5 5 5 ：k - 0 0 2 r i b o f l a v i n t a u r i n e 3 7 6 1 2 5 e s i + e s i + 3 7 7 1 2 6 2 6 7 【m + n a 】+ 3 5 9 【2 m + h + 4 7 7 【2 m + k 】+ 1 5 0 【m h 2 0 小】+ 1 5 2 m - h 2 删+ 3 9 9 【m + n a 】+ 2 5