（植物病理学专业论文）灰葡萄孢除草活性物质的分离纯化与结构鉴定.pdf

摘要 环境和谐型绿色农药成为当代农药发展的必然趋势，从天然化合 物中筛选农药活性物质或农药先导化合物是绿色农药研发的重要途径 之一。本研究以能够引起番茄灰霉病的灰葡萄孢( b o t r y t i s c i n e r e a p e r s ) 的一个菌株b c 一4 为试材，对灰葡萄孢代谢产物中的除草活性 物质进行了纯化和结构研究，结果如下： 灰葡萄孢b c 一4 菌株在距离3 0 w 的紫外灯下3 0 c m 处照射6 0 m i n 可发生变异，通过单孢子分离得到3 6 个菌株，其生长情况和产生有除 草作用代谢物的水平不同，其中以菌株7 3 产生的代谢产物除草效果 最佳。通过对菌株7 3 产生除草代谢产物条件的摸索，发现在改良p d 液体培养基，初始p h 值为4 0 ，黑暗静止的培养条件下，18 2 8 程序 升温培养1 8 d 就可以达到除草代谢物质的产生高峰。 将菌株7 3 的培养滤液经过冷冻干燥，溶媒萃取，不同溶剂转溶 等手段，提取出了具有一定选择性除草作用的组分，对稗草、狗尾草、 虎尾草、牛筋草、播娘蒿、荠菜、拟南芥菜活性较强，致死率达8 0 ， 对反枝苋、马齿苋、藜作用一般，致死率在4 0 左右；活性组分可以 在番茄、黄瓜、高粱植株的叶片上产生大面积的枯斑，而对小麦、玉 米、棉花基本无危害作用。 通过t l c 、c c 及h p l c 等方法将有除草作用的组分进一步分离， 发现其中还至少含有5 个不同的有紫外吸收的组分，经过l c 制备，得 到个纯度达9 9 3 8 ，除草作用较强的纯组分。经过u v v i s 、i r 及 n m r 等方法对有除草活性的纯组分进行分析，鉴定其化学结构为1 0 一 顺一二氢化灰霉二醛。 以马唐为除草活性测定对象，发现1 0 一顺一二氢化灰霉二醛的除草 作用对热相对稳定，8 0 水浴6 h 除草活性不会下降，其除草活性受光 激活，黑暗条件下除草作用不强，将1 0 一顺一二氢化灰霉二醛制成水剂、 水悬剂和水乳荆，茎叶处理发现水剂的相对除草效果最优，在1 0 0 m g l 的浓度下使马唐的死亡率达9 4 。7 关键词：灰葡萄孢；生物农药；除草活性；高效液相色谱法；核磁共振波谱法 p u r i f i c a t i o na n ds t r u c t u r a ii d e n t i 6 c a t i o no fh e r b i c i d a la c t i v e f r a c t i o nf r o mm e t a b o l i t e so f b o t r y t i sc i n e r e a x u k u o m a j o r ：p a n tp a t h o l o g y s u p e r v i s o r ：d o n gj i n - g a o a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a tt h ec o m p a t i b l eg r e e np e s t i c i d ew i t he n v i r o n m e n th a sb e e nt h e i n e v i t a b l ed i r e c t i o no f t h e d e v e l o p m e n to f p e s t i c i d ef o r m u l a t i o ni nt h ec o n t e m p o r a r ye r a ， i ti so n eo f t h e i m p o r t a n ta p p r o a c h o nr e s e a r c hg r e e n p e s t i c i d et h a ts c r e e na c t i v ep e s t i c i d e s u b s t a n c e so rc h c m o i n f o r m a t i c si nm i l l i o n so fc r u d ec o m p o u n d s t h ef u n g ib o t r y t i s c i n e m ai sak n o w n p a t h o g e no f t o m a t og r a ym o u l d ，a l li s o l a t eo f 丑c i n e r e a m e t a b o l i t e s w a su s e dt or e s e a r c ha sg r e e n p e s t i c i d ei nt h i sp a p e r b c - 4i s o l a t eo fb c i n e m ah a db e e nm u t a t e db y3 0 w u l t r a v i o l e tl a m pi l l u m i n a t i n gf o r 6 0 r a i na w a yf r o m3 0 c m ，a n di s o l a t e7 - 3w a ss e l e c t e df r o m3 6m u t a t i v es i n g l e - - s p o r e s t r a i n s n l ec o n c e n t r a t i o no f w e e d i n ga c t i v i t ym e t a b o l i t e si ni t sc u l t u r e df i l t r a t ew a s t h e h i g h e s t t h eb e t t e rc o n d i t i o nt op r o d u c eh i g ha c t i v em e t a b o l i t e sf r o mc u l t u r ef i l t r a t eo f i s o l a t e7 - 3w a sc o n s t r u c t e db a s e do nt h er e s u t t so fb i o a s s a ya n dh p l ca n a l y s i s t h a t i n c l u d ei n o c u l a t i n gi s o l a t e7 - 3i n t om o d i f i e dp dl i q u i dm e d i ao fi n i t i a lp h4 0 ，a n d c u l t u r i n g1 8d a y su n d e r d a r ka n ds m i l ei nt h ep r o c e d u r eo f f i s et e m p e r a t u r ef r o m1 84 c t o 2 8 a na c t i v eh e r b i c i d ei n g r e d i e mv c a so b t a i n e df r o mc u l t u r ef i l t r a t e o fi s o l a t e 阳b y 丘e e z ed r y i n g ，e x t r a c t i n ga n dd i s s o l u t i o ni nd i f f e r e n ts o l v e n ta n ds oo n b i o a s s a yr e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h ei n g r e d i e n th a ss e l e c t i v ea c t i v i t yo nd i f f e r e mw e e d sb u ts a f e t yt oc e r e a l c r o p s t h ei n l a i b i t i o mt ow e e d 8e c h i n o c h l o ac r u s g a l l i ，s e t a r i av i r i d i s ，c h l o r i sv i r g a t a ， e l e u s i n ei n d i c a ，d e s c u r a i n i as o p h i a ，c a p s e l l ab u r s a p a s t o r i s ，a r a b i d o p s i st h a l i a n aw e r e h i g h e rt h a n a m a r a n t h u s r e t r o f l e x u s , p o r t u l a c ao l e r a e e a ，c h e n o p o d i u m a l b u m t h ed e a t h p e r c e n t a g eo f t h ef o m e ri sa b o v e8 0 b u tt h el a t e ri sa p p r o x i m a t e4 0 1 1 1 ei n g r e d i e n t 啪a l s o p r o d u c eb i ga c r e a g e n e c r o s i ss p o ti nl e a v e so f t o m a t o c u c u m b e ra n d j o w a r , b u t n oe f f e c to nw h e a t , 嫩i z ca n dc o t t o n t h u s ，t h ei n g r e d i e n tm a yc o n t a i ns o m eh e r b i c i d a l c o m p o n e n t s f i v ed i f f e r e n tu l t r a v i o l e ta b s o r p t i o nc o m p o n e n t sw e t i s o l a t e df r o mt h ei n g r e d i e n to f c u l t u r e df i l t r a t eo fi s o l a t e7 _ 3b yt l c ，c ca n dh p l c o ft h ef i v ec o m p o n e n t s ，o n b s h o w e ds 订o n gk u l m ga c t i v i t yt od i g i t a r i as a n g u i n a l i s p u r i f i e dt h ec o m p o n e n tb yl c t o a c q u i r et h ea c t i v ep u r ef r a c t i o nw h o s e c o n c e n t r a t i o nw a sa b o u t9 9 3 8 s m a c t u r eo ft h e a c t i v ep u r ef r a c t i o nw a si d e n t i f i e da s1 0 - s y 栅i h y d r o b o t r y d i a lb yu 、，v i s ，i r ，n m r a n ds o o n t h es t a b i l i t yo f b i o a c f i v i t yo f1 0 - s y n - - d i h y d r o b o t r y d i a l t od i g i t a r i a s a n g u i n a l i sw a s t e s t e db yl i g h ta n dh i g ht e m p e 蝴t u r e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e 1 0 - s y n - - d i h y d r 9 - b o l x y d i a l r e m a i n e db i o a c t i v i t yt h r o u g hb e i n gt r e a t e d6h o u r sa t8 0 c i th a dh i g h e r b i o a c t i v i t yu n d e ru g h tt l 眦d a r k s ot h eb i o a c t i v i t yc o u l db ei m p r o v e db yl i g h t t h r e e d i f f e r e n tf o r m u l a t i o n s a q u e o u ss o l u t i o n ，w a t e rf l o w a b l e ，w a t e re m u l s i o n w c r c p r o d u c e d n l ca n a l y s i s o fb i o a c f i v i t yt o d i g i t a r i as a n g u i n a l i si n d i c a t e d t h a ta q u e o u s s o l u t i o nh a dh i g h e ra c t i v i t y , a n dt h ed e a t hp e r c e n t a g ew a s9 4 ，7 a tt h ec o n c e n t r a t i o n o f1 0 0m g t , k e yw o r d s ：b o t r y t i sc i n e r e a ；b i o p e s t i c i d e ；h e r b i c i d i a la c t i v i t y ；h p l c ；n m r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 垦盔些盘堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：徐打 签字f i 期：埘年月易r 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 垦盔些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑韭盔些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：徐拐 签字同期：潲年月z 三，同 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 新躲秀男 新躲嘭魂彳 签字同期：泖士年为1 r 电话： 邮编： 灰葡萄孢代谢产物中除草活性物质的分离纯化与结构鉴定 1 引言 据统计，全世界广泛分布的杂草有3 万余种，其中约有18 0 0 多种 对作物造成不同程度的危害。因杂草危害造成的农作物减产每年高达 9 7 1 1 1 。农阳杂草防除是农业生产中不可忽视的环节，传统的人工或 机械除草由于存在费工、费时、耗能高等缺点早已被化学除草所取代， 然而化学药剂的大量使用也引发了一系列的问题，诸如除草剂抗性杂 草植株的出现、土壤的污染、水质的退化、对非杂草生物( 特别是人、 畜) 的危害等。近年来，随着人们环境意识的增强和农业可持续发展 的需要，化学农药的发展面临着环境质量问题的巨大压力，因此，丌 发生物活性高、选择性强、环境相容性好的生物农药或仿生农药己成 为当代农药发展的必然趋势【l 2 j 。 在这样的大趋势下，微生物除草剂应运而生，人们丌始考虑运用 微尘物或其代谢产物，以及这些代谢产物的人工模拟化合物来防除杂 草，其中植物病原真菌产生的毒素是人们考虑的重要微生物源除草剂 之一。 实践上利用生物防除杂草已有近2 0 0 年的历史【2 】。然而，微生物 或微生物代谢产物作为除草剂的研究只是在近2 0 多年开展起来的。微 生物除草剂是指能在人们控制的条件下有效地被使用，防除特定杂草 的活体微生物产品或微生物代谢产物【l ，。它具有生物农药的一般特性 【3 】：选择性强；不容易产生抗性；通常对人、畜、天敌等非靶 标生物比较安全：环境相容性好；生产工艺比较简单；丌发与 登记等费用低于化学药剂等。 微生物除草剂根据其有效成分是植物病原菌本身还是微生物的代 谢产物，可分为微生物制剂除草剂和微生物源除草剂。微生物制剂除 草剂必需具备以下几个条件【2 q 】：该病原菌可以进行人工繁殖；在 喷施处理后，其生长要迅速，能在一定时间内抑制杂草生长直至死亡； 要适合工业化生产；便于包装、运输和使用。迄今为止，约有1 0 0 种不同的侵染性微生物被研究，可防除约8 0 种有经济意义的杂草| 2 i 。 研究报道最多的是真菌【3 】，其次是细菌【3 2 ”此外还有病毒【16 1 等。 我国在研究利用植物病原微生物防除杂草方面起步较早2 0 世纪6 0 年代，山东省农科院植保所从感病的大豆菟丝子( c u s c u t aa u s t r a l i s ) 河北农业人学硕十学位论文 上分离得到胶孢炭疽菌菟丝子专化型( c o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o r i o d e s p e n z s a c c f s p c u s c u t a e ) ，并将其商品化，用于防治大豆田菟丝子， 直接防效可达7 0 9 0 t ，引。此外还有许多这方面的相关报道【m 2 5 1 。 微生物源除草剂是利用微生物产生的代谢产物进行杂草防除的一 种新型生物除草剂。根据其来源不同可分为真菌源、细菌源和链霉菌 源除草剂等主要是指微生物在代谢过程中产生的毒素或抗生物质。 已知的病原菌毒素和抗生物质都为有机化合物，包括多肽类、萜类、 大坏脂类和酚醛树脂类等【2 6 】。 研究报道最多的产生除草活性毒素的植物病原真菌，主要来自于 链格孢菌属( a l t e r n a r i a ) 、镰刀菌属( f u s a r i u m ) 、刺盘孢菌属 ( c o l l e t o t r i c h u m ) 等。从百同草链格孢( a l t e r n a r i az i n n i a e ) 内分离到 的毒素z i n n i o l ，可抑制番茄、西瓜、柑桔和胡萝卜种子萌发，引起西 瓜、西葫芦、燕麦等植物幼苗的萎蔫 2 7 】，可以干扰细胞的钙素调节过 程而使细胞致死1 2 8 】。从a l t e r n a r i a 其它的一些种和p h o m am a c d o n a l d i i 中也分离到z i n n i o l1 2 9 , 3 0 1 。a p o r r i 可产生一种z i n n i o l 的类似物 p o r r i t o x i n 也有相似的作用j 。a a l t e r n a t af s p t e n e s 和a l t e r n a r i a 的 其它几个种产生的环四肽( t e n t o x i n ) 是一种可造成绿色植物失绿或能 较强抑制一些难防除杂草生长的毒素 3 , 3 2 4 2 1 ，而对玉米、大豆等作物 却十分安全【3 】。由植物病原菌产生的倍半萜类抗生物质 p r e h e l m i n t h o s p o r o l 对难以防除的杂草白茅( i m p e r a t ac y l i n d r i c al ) 十 分有效。s u g a w a r a 等【4 3 1 从伤害狗牙根的真菌曰p o l a r i sc y n o d o n t i s 中 分离出一种毒素b i p o l a r o x i n ，在低浓度下对狗牙根有寄主选择毒性。 s c o p u l a r i o p s i ss p ，c e p h a l o s p o r i u ms p 和f u s a r i u ms p 产生的毒素 1 2 33 a 也有很好的除草剂丌发前景 4 4 , 4 5 】。v e n k a t a s u b b a i a h 等4 6 1 从藜一 种叶斑病的病原菌a s c o c 砂t a 砂a l o s o p o r a 中分离出毒素：a s c o c h y t i n e ， p y r e n o l i d ea 和h y a l o p y r o n e ，它们对藜( c h e n o p o d i u ma l b u m ) 、苍耳 ( x a n t h i u ms t r u m a r i u ml ) 、假高粱( h o l c u sh a l e p e n s el ) 等9 种杂 草都有毒性。v e n k a t a s u b b a i a h 等1 4 7 还从罗布麻叶斑病菌s t a g o n o s p o r a a p o c y n i 的培养物中分离出4 种毒素：c i t r i n i n ，m e l l e i n ，t y r o s o l 和 一a c e t y l o r c i n o l ，它们对藜( c a l b u m ) 、罗柿麻( a p o c y n u ml ) 、曼 佗罗( d a t u r as t r a m o n i u ml ) 等杂草有较高的毒性。k i m 【4 8 】从d r e c h s l e r a p o r t u l a c a e 的培养滤液中分离出毒素z e a e n o l ，在1 0 “m 时就可以抑制 西来稗( e c h i n o c h l o ac r u s g a l l i ) 和茼麻( a b u t i l o nt h e o p h r a s t im e d i c ) 灰葡萄孢代谢产物中除草活性物质的分离纯化与结构鉴定 的生长。j u n k oo h r a 等1 4 9 l 从盘长孢状刺盘孢( c o l l e t o t r i c h u m g l o e o s p o r i o i d e s ) 中分离出一种植物毒素，该毒素对7 个不同种杂草有 一定的抑制生长或杀伤作用。e v i d e n t e 等睁o j 从p h o m ap u t a m i n u m 中分 离出的毒素在寄主和非寄主植物上均可引起叶部坏死。e v i d e n t e 等】 还从a s c o c h y t ac a u l i n a 的代谢产物中分离出t r a n s 一4 一a m i n o p r o l i n e ，对 双子叶植物有一定的杀伤作用。v u r r o 等【5 2 】从引起x a n t h i u mo c c i d e n t a l e 叶斑病害的百日草链格孢( a z i n n i a e ) 的培养滤液中也分离出了两种 毒素b r e f e l d i na 和，b d e h y d r o c u r v u l a r i n ，同样有较好的杀草效果。 z o n n o 等p3 】从f u s a r i u ms p 中分离出的t 一2 毒素，在1 0 。m 时对独角金 ( t y p h o n i u mg i g a n t e u me n g l e r ) 种子萌发抑制率达10 0 k a s t a n i a s f 5 4 1 从核腔菌d r e c h s e r aa v e n a e 中分离出两种代谢产物p y r e n o p h o r i n 和 p y r e n o p h o r o l ，其中p y r e n o p h o r i n 在7 0 1 0 。7 m 可抑制所有供试禾本科 植物的生长；而p y r e n o p h o r o l 效力较低。但具有一定选择性，在6 4 m g l 时可抑制野燕麦( a r e n af a t u a l ) 叶绿素合成并引起叶片坏死。z e n g r e n s e n 等 5 5 5 6 】研究发现，同本曲霉( a s p e r g i l l u sj a p a n e s a ) 的代谢产 物黑麦酮酸f ( s a f ) 在o 0 3 8 m g l 浓度下就能明显抑制双子叶植物的 种子萌发和幼苗生长。 其他作用机制较明确的真菌霉素如：出侵染番茄的交链孢面产生 的a a l 一毒素及a u s t r a l i f u n g i n 、c o r n e x i s t i n ，由壳二孢菌、茎点霉菌产 生的莎草素( c y p e r i n ) 和从黑斑病菌中分离而得的a l t e i c h i n 等都具有 一定的除草活性5 0 1 。 产生对杂草有致病或致毒作用毒素的植物病原细菌多为革兰氏阴 性菌，少数为革兰氏阳性菌1 5 7 1 。其中丁香假单孢丰下菌丁香变种 ( p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v s y r i n g a e ) 可产生系列有除草活性的毒 素，包括丁香霉素( s y r i n g o m y e i n s ) t 3 s s 】，s y r i n g o s t a i n s 5 9 1 ，s y r i n g o t o x i n l 6 0 】 及s y r i n g o p e p t i n s i “1 ，所有这些毒素都可以直接抑制质膜的h + 一a t p 酶 活性 6 2 1 ，从而具有一定的除草活性。由假单孢菌产生的假单孢菌酸类 物质可作为阔叶杂草除草剂，如c o n m e x i s t i n 对单、双子叶杂草均有防 效1 3 1 。三肽毒素( p h a s e o l o t o x i n ) 是由大豆晕枯病菌( p s e u d o m o n a s s y r i n g a ep v p h a s e o l i c o l a ) 产生的细菌毒素 6 3 6 5 1 ，也有一定的除草开 发价值。丁香假单孢杆菌的一个变种产生的t a g e t i t o x i n 也是一种可以 引起叶片失绿的植物毒素 6 6 , 6 7 1 。此外，丁香假单孢杆菌的一些致病变 种产尘的c o r o n a t i n e 是一种非寄主专化性毒素，可以抑制植物生长和 河北农业人学硕十学何论文 造成叶片失绿1 6 8 6 9 。p a t i c k 等1 7 0 1 将导致早雀麦病害的p s e u d o m o n a s j ，7 u o r e s c e n sd 7 菌株发酵液的致病机理进行研究，g a r u s i d d a i a h i ”1 ( 19 9 4 ) 对该菌株的发酵液初步纯化后得到一种毒素，进一步纯化几 乎丧失了致毒活性。但从该毒素对植物细胞的作用机理上看，对除草 剂的研究有一定的参考价值。 直接来源于微生物代谢产物的商品化的除草嗣并不多，最成功的 事例当属双丙氨磷( b i a l a p h o s ) 。b i a l a p h o s 是从一株链霉菌s t r e p t o m y c e s h y g r o s c o p i c u s 培养物中分离并开发的一中广谱性内吸型除草剂，化学 结构为2 - 氨基4 甲基磷酰- 乙酰丙氨酰丙氨酸，它对杂草的作用比百 草枯缓慢，但比草甘膦迅速1 7 2 】。从链霉菌属放线菌所得的茄香霉素， 对稗草( e c h i n o c h l o ac r u s g a l l il ) 和马唐( d i g i t a r i as a n g u i n a l i sl ) 等具有除草活性，但对栽培作物，如水稻等则无毒害作用【l 3 1 。 我国微生物源除草剂的研究近年来也有一些重要成就。王明旭等 深入研究了稗叶枯菌( h e l m i n t h o s p o r i u mm o n o c e r a s ) 的生物学特征及 毒素的寄主范围【73 1 。高昭远开展了胶孢炭疽菌s 2 2 毒素防除杂草的可 行性研究，并取得了一定结果【7 4 1 ，周荣仁丌展了放线菌代谢产物防除 杂草的有益探索【75 1 。万佐玺、强胜等从紫茎泽兰叶斑病的病斑上分离 到一株链格孢菌，所产生的毒素对鸭趾草( c o m m e l i n ac o m m u n i sl ) 和水花生( a l t e r n a n t h e r a p h i l o x e r o i d e s ) 等杂草有明显的抑制作用p 。 张会林、董会皋等研究发现，葱叶枯病菌s t e m p h y l i u mb o t r y o s u m 毒素 对稗草( e c r u $ g a l l i ) 、马唐( d s a n g u i n a l i s ) 等杂草种子的萌发和幼 苗生长有较强的抑制作用7 1 。上述工作的丌展，扩大了我国微生物源 除草的研究范围，极大地促进了我国微生物除草剂的研究与应用。 狄葡萄孢( b o t r y t i sc i n e r e ap e r s ) 是一种重要的植物病原真菌，无 性世代属于半知菌亚门狄葡萄孢菌属，有性世代属于富克尔核盘菌 ( b o t r y o t i n i a f u c k e l i a n a ( d eb a r y ) w h e t z e l ) 。在植物体内或体外均可产 生多种代谢产物，主要包括酶类 7 8 - 9 2 1 、多糖 9 3 9 6 1 、植物激素【卯一。叭、 毒素【1 0 1 1 、脂肪酸酯类【1 0 2 】等，其中酶类、毒素和植物激素是重要的致 病因子( p a t h o g e n i c i t yf a c t o r ) 。扶葡萄孢毒素中研究和报道最多的是 以狄霉二醛为骨架的一类低分子量的有机化合物【3 “们】，这类化合物 既可以在被侵染的寄主组织中分离到，也可以在离体的培养条件下产 生l i ”】。这类毒素中有的具很高活性，其中狄霉二醛在1 0 m g l 的浓度 下就有生物活性，而且这些化合物多数在黑暗条件下毒性较低或几乎 4 灰葡萄孢代谢产物中除草活性物质的分离纯化与结构鉴定 没有活性，表明这类化合物的作用是受光激活或光依赖性的1 1 0 9 l 。 我国在扶葡萄孢毒素的研究上也有一些成就，郑晓莲等o 】研究发 现狄葡萄孢毒素具有一定的广谱作用对不同科属的植物都具有毒害 作用。周豌君等u 发现该毒素经高温灭菌后，毒力基本不变。朱建兰 等【1 12 1 也得到了类似的结果。本实验室前期在狄葡萄孢代谢产物的研究 上也有一些进展，王朝华等3j 研究发现，灰葡萄孢一些菌株的代谢产 物具有较强的除草活性。李春格【1 l 从中获得了一种能强烈抑制双子叶 杂草种子萌发的单组分物质，但由于其量太少没能做进一步研究。王 惠 “n 9 】在这方面也作了大量有意义的工作。实践证明，将灰葡萄孢 代谢产物开发成生物除草剂，应用于农业生产实际是有广阔前景的， 因此本试验欲在这方面展开一些工作。此外，值得一提的是，近年来 随着仿生化学的发展。以微生物天然产物为先导化合物开发新颖除草 剂引起了杂草科学家和农药化学家的极大兴趣【2 叭，这也是本研究的出 发点之一。 当前发展微生物除草剂有许多有利条件，第一，随着人们环境意 识的增强，世界人民对可持续发展的渴求以及我国农业可持续发展战 略的实施，为微生物除草剂等生物农药提供了巨大的发展契机；第二， 微生物除草剂的研发已经有了一定的基础和成功的经验；第三，世界 各国对其研究与- 丌发投入了大量的人力物力，在相当一批科研院所和 高等院校进行着广泛的研究。总之，在不久的将来，微生物除草剂的 研究与开发将会取得巨大的进展，人类与有害生物斗争的武器将会得 到新的加强。 塑! ! 坐些查主堡主兰生笙茎 2 1 材料 2 1 1 供试菌株 2 材料和方法 狄葡萄孢b o t r y t i sc i n e r e a 毒素实验室保存，寄主：番茄， 2 1 2 供试植物 p e r s ( 编号b c 一4 ，河北农业大学真菌 采集地；河北保定) 马唐、反技苋、稗草、狗尾草、虎尾草、牛筋革、马齿苋、播娘 蒿、荠菜、藜、拟南芥菜、番茄、黄瓜、小麦、玉米、棉花、高梁等。 2 1 3 供试培养基 培养基种类及用途见表1 表i 供试培养基组成及用途 t a b l e it h et y p e sa n do b j e c t 8o fr e e d i aus e di nt h i ss l u d y 培养基成分用途 坚! 璺! ! ! 璺! ! 璺! ! 里! !q 堕! ! ! ! p d a 马铃薯2 0 0 9 葡萄糖2 0 9 ，琼脂2 0 9 j i l 馏水1 0 0 0 m l 菌种保存及扩繁 p d 马铃薯2 0 0g t 葡萄糖2 0g 燕馏水10 0 0 m l制蔷培养滤液 6 改良p d 改良f r i c s p c b e r d y 马铃蔷2 7 0 h 0 9 , 0 蔼5 萄g , 糖n 2 h 。4 9 n o 酵ji 母o g 膏, o 蒸s 馏g , 水k h i2po,limgs042 005 9 nn o 0 9 0 0 0 m 。g 制符培养滤液 7 h 蒸馏水il 蔗糖3 0 9 - 酒石艘铵5 0 9 ，n i l4 n o 3 1 0 9 k h2 p 0 410 9 t m g s 0 4 7 h2 0o 5 9 ，n a c io ，5 9 c a c l 20 1 9 酵母膏制斋培莽滤渡 05 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 葡葡糖1 0 9 拧檬艘钠30 9 k h ：p 0 。5 o g n h n o 】2 o g ， m g s o 4 7 h2 00 2 9 ，c a c l 20 i g ，酵母膏0 2 5 9 燕馏水制蔷培荐滤液 c z a p e k - d o x a g a r i o 地5 糖g ，3 0 9 l , n a n ，。32 0 9 , ，kz h p 0 蒸4 馏i 水0 9 , lmgmso5 9 k c05 9f e s o00 l g0 0 0 ：。7 h 2 。 制蔷培养滤液 ，1 ， ，蒸馏水l m l 黄豆粉蚺养攮 下米粉培养璀 黄豆粉5 0 9 茼暂楮f 5 9 胡萝 f o o g m g s o 7 h ：o 05 9 tk h 2 p 0 41 0 9 f e s 0 405 9 rc a c o 31 0 9 ，蒸馏水 1 0 0 0 ml 下米粉2 0 9 ，确萄糖l5 9 ，k h2 p 0 4l + 0 9 ( n h ) 2 1 4 p o4 1 0 9 tm g s 0 4 7 h2 005 9 - c a c o ，1o g ，n a c l25 9 ，蒸 馏水1 0 0 0 r nl 制薪培养滤液 制蔷培释滤液 灰葡萄孢代澍产物中除草活性物质的分离纯化与结构鉴定 2 1 4 试剂及主要仪器 无水乙醇( 分析纯，天津市永大化学试剂开发中心) ，乙酸乙酯、 氯仿、二氯甲烷、石油醚、乙醚、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、碳酸氢 钠( 以上试剂均为分析纯，天津市天大化工实验厂) ，甲醇( 分析纯、 色谱纯，北京市华准化学试剂科技开发部) ，苯( 分析纯，天津市化学 试剂批发公司) ，四氯化碳( 分析纯，河北省保定化学试剂厂) ，j 下己 烷( 分析纯，天津市福晨化学试剂厂) ，1 ，4 一二氧六环( 分析纯，北 京化学试剂公司) ，氢氧化钠( 分析纯，天津化学试剂三厂) ，3 6 盐 酸( 分析纯，天律化学试剂一厂) 等。 智能光照培养箱( z p g 2 8 0 型，哈尔滨东拓科技开发有限公司) ， 全温振荡器( h z q q ，哈尔滨东联电子技术开发有限公司) ，旋转蒸发 器及真空泵( r e 5 2 9 8 型，上海亚荣生化仪器厂) 冷冻干燥机 ( l a b c o n c o 型，美国) ，液相色谱仪( l c 5 5 0 0 和l c 5 5 1 0 型，北京 东西电子技术研究所) ，超声波振荡器( s k f 系列，上海科导超声仪器 有限公司) ，紫外一可见分光光度计( u v 2 0 8 2 型，上海龙尼科光谱仪 器有限公司) ，光照度计( s t - 8 0 c ，北京师范大学光电仪器厂) ，显微 熔点测定仪( x 6 型，北京泰克仪器有限公司) ，傅立叶红外变换光谱 仪( t e n s o r 3 7 型，德国b r u k e r 光谱仪器公司，河北保定乐凯胶片公 司分析测试中心提供) ，核磁共振仪( a v a n c e 型4 0 0 m h z 超导核磁 共振仪，德国b r u k e r 光谱仪器公司，河北保定乐凯胶片公司分析测试 中心提供) 等。 2 2 方法 2 2 i 菌株的紫外诱变 将菌株b c 一4 以针刺法接种于离体番茄幼果上复壮，l8 2 0 保湿 培养，待发病后按常规方法进行分离纯化，纯化后的菌种培养7 1 0 d ， 挑取一小块接种于p d a 培养基平板( 巾= 1 2 0 m m ) 上，在1 8 2 0 条件 下培养2 d ，当见到有新鲜菌丝出现时，将老菌丝挖去，留下新菌丝。 将此培养皿放在3 0 w 紫外灯下3 0 c m 处，打开皿盖，开启紫外灯，分 别照射5 ，1 0 15 ，2 0 ，2 5 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 m i n ，以未经紫外线 照射的野生菌株( b c 一4 ) 为对照，每个处理重复6 次。照射后迅速盖 河北农业火学硕十学能论文 上皿盖，用黑纸包好，18 2 0 培养2 3 d ，十字交叉法测量菌落直径， 按下列公式计算菌株的净生长量和生长抑制率。以抑制率在9 5 以上 的照射时间作为诱变剂量对菌株进行处理，挑取生长速度快而健壮的 新菌丝，分别移植到p d a 培养基平板上进行培养，待长出大量分生孢 子，用平板稀释法进行单孢子分离，得到纯化的菌株作为供试的诱变 菌株备用。 菌蒋净，上i ：= 量( r a m ) ；诱变培养后茁落直释( r a m ) 一诱变前菌萍直释( r a m ) 生长抑制率c ，= 茎堑塑翌塑墅警! 轰曩基；暴嚣主要耋蓦羔：笋i 堡! i 竺堕x - 0 0 2 2 2 除草活性测定方法 2 2 2 1 对杂草种子萌发抑制作用测定一种子萌发法纸床法：在巾 = 9 0 m m 的培养皿中放入与皿底大小相同的双层滤纸，灭菌后备用。在 皿底滤纸上均匀滴加2 m l 病菌培养滤液或稀释1 0 倍液( 病菌培养滤 液：灭菌水= 1 ：9 ) ，将供试植物种子用3 5 n a c i o 溶液消毒 5 1 5 m i n ，灭菌水冲洗2 3 次，选取均匀一致的2 5 粒杂草种子均匀摆 放在上述培养皿中。置于2 5 ，1 2 h 光照，12 h 黑暗条件下培养，并分 别设培养基稀释1 0 倍液( 培养基：灭菌水= l ：9 ) 和灭菌水的处理作 对照，每个处理重复3 次，7 2 h 后检查种子萌发情况。种子萌发标准为： 种子发芽长度超过种子自身长度按萌发计。按下列公式计算种子萌发 率和种子萌发抑制率。 种了奶蝴= 器1 0 。 种了荫发抑制半t ，= 型曼塑堑生三箦蔫嵩l ；云筹蓑警告等生! ! ! i 羔塑x - 。 沙床法：在中= 9 0 m m 的培养皿中放入细沙土( 细沙：壤土= 1 ：1 ) 2 0 9 ，均匀植入2 5 粒杂草种子，上覆1 0 9 细沙土，均匀滴加1 0 m l 病 菌培养滤液或稀释l o 倍液。其它条件同上，计算种子萌发抑制率。 2 2 2 2 对杂草生长抑制及杀伤作用测定一茎叶处理法在口径6 c m ， 高1 2 c m 的塑料小杯中放入3 1 4 容积的蛭石( 3 0 9 左右，预先将小杯底 上扎4 个小孔) ，再均匀撒上杂草种籽，然后覆盖上一层蛭石( 1 0 2 左 右) 。把杯子放入搪瓷托盘中，在托盘中加入适量的水( 杂草出茁前保 灰葡萄孢代谢产物中除草活性物质的分离纯化与结构鉴定 持2 c m 左右的水层，出苗后根据情况适时加水) ，然后置于室外( 2 5 3 0 ) 让其自然生长，马唐生长至2 3 叶龄，反枝苋生长至2 3 片真叶 时供测试用。喉头喷雾器均匀喷洒各供试测定液，以杂草叶片湿润为 宜( 为增加测定液在杂草叶片上的湿展性，在每9 8 m l 病菌培养滤液 中加入2 m l l 16 0 1 溶液) ，分别设培养基、0 2 16 0 l 溶液和清水的处 理作对照，每个处理重复3 次，一定光照下2 5 培养，4 8 h 后用目测 法观察抑制结果，目测法的抑制作用分级标准见表2 【l 圳。 表2 除草抑制作用分级标准 t a b i e2t h eg r a d es t a n d a r do fh e r b i c i d ei i l h i b i t i o n 2 2 3 高除草活性变异菌株的筛选 2 2 3 1 菌盘的制备将保存于斜面上的供试菌株接种于p d a 培养基 平板( 击= 9 0 m m ) 上，l8 2 0 黑暗培养，待菌落长至巾8 0 m m 时， 用内径6 r a m 打孔器切取菌落外缘菌丝，制备菌盘。 2 2 3 2 诱变菌株生长量比较将菌盘接于p d a 培养基平板中央，以 未经紫外线处理的野生菌株( b c 一4 ) 作为对照，重复4 次，l8 2