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非水相体系中酶催化制备生物柴油 摘要 面对愈演愈烈的“能源危机”和“温室效应”，各国学者都致力 于研究环境友好性的可再生能源，生物柴油则是其中一种。转酯化制 备生物柴油的方法有化学法和生物法，对比传统化学法，生物法工艺 简单、选择性高、能耗低、对环境无污染。本文选取生物法在非水相 体系中制备生物柴油。 分析四种植物油脂肪酸组成，选择精制山茶油( 广西特产) 和煎炸 废油分别与甲醇反应制备生物柴油。 比较三种游离脂肪酶，选择l i p a s eo f 为催化剂。甲醇的强极- 陛 易造成酶失活，必须分次加入甲醇。得到最适反应条件：正已烷为溶 剂，醇油摩尔比= 1 ：1 ，甲醇每1 2 h 加入一次，反应1 h 后加入硅胶， 反应温度：4 0 c ，酶用量为原料油质量的7 ，反应4 8 h 最终转化率 可达9 4 5 。相同反应条件下催化废油，转化率为：8 7 7 。 考察影响固定化脂肪酶n o v o z y m e 睁4 3 5 催化效果的各因素：醇油 摩尔比、不同短链脂肪醇、有机溶剂、反应温度、反应时间、酶用量 对转化率的影响。发现甲醇含量超过3 2 0 m l l ，酶迅速失活，向反 应体系中加入硅胶吸附甲醇，迅速降低甲醇浓度，保护酶，形成甲醇 “缓冲瓶”；另一方面吸附反应生成的甘油推动转酯化反应，并消除 传质阻力。最适反应条件为：石油醚为溶液剂，醇油摩尔比- 3 ：1 ， 一次加入甲醇，反应3 0 m i n 后加入硅胶，硅胶的加入量：原料油质量 比= 0 8 3 ：1 ( 0 8 7 ：l ，废油) ，反应温度为：4 0 c ( 4 3 c ，废油) ，酶 用量为原料油质量的8 ，反应3 0 h ，催化精制茶油转化率可达9 1 2 。 催化废油转化率可达8 9 1 。 n o v o z y m e 4 3 5 的稳定性良好，重复1 5 批次反应转化率不下降。 关键词：生物柴油酶催化有机相转酯化废油脂 n b i o d i e s e lp r o d u c t i o nb ye n z y m 匣c 虹a l y s i si n n o n - a q u e o u sp h a s e a b s t r a c t f a c i n gs e v e r ee n e r g yc r i s i sa n dg r e e n h o u s e ，t h es c i e n t i s t sa l la r o u n dt h ew o r l d h a v eb e e nr e s e a r c h i n gt h ee n v i r o n m e n t a lf r i e n d l ya n dr e n e w a b l ee n e r g y b i o d i e s e l w a so n eo ft h o s e t h em e t h o d so ft r a n s e s t e r i f i c a t i o ns y n t h e s i z e db i o d i e s e lw e t e c h e m i c a lm e t h o da n db i o l o g i c a lm e t h o d c o n t r a s tt oc o n v e n t i o n a lc h e m i c a lp r o c e s s , e n z y m a t i cp r o d u c t i o np r o c e s sp r e s e n t e dm a n ya d v a n t a g e ss u c ha ss i m p l et e c h n o l o g y , b e t t e rr e a c t i o ns e l e c t i v i t y , l o w e re n e r g yc o n s u m e da n dl e s se n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n b i o l o g i c a lm e t h o d w a sc h o s et op r e p a r eb i o d i e s e li nn o n - a q u e o u s p h a s ei nt h i sp a p e r f a t t ya c i dc o m p o s i t i o no ff o u rp l a n to i lw e r ea n a l y z e di nt h i sp a p e r , a n dr e f i n e d t e ao i l ( s p e c i lp r o d u c ti ng u a n g x i ) a n dw a s t e 衔e do i lw e r es e l e c t e d 船m a t e r i a lt o s y n t h e s i z eb i o d i e s e lw i t hm e t h a n o lb yt r a n s e s t e r i f i c a t i o n l i p a s eo f w a sc h o s ea sc a t a l y s ta r c rt h r e ef r e el i p a s e sw e i ec o m p a r e d l i p a s e s w e r ei n a c t i v a t e db e c a u s eo f h i g hp o l a r i t yo fm e t h a n 0 1 t h es t e pb a t c ha d d e dm e t h a n o l m u s tb ea d o p t e d t h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n ：s o l v e n tw a sn - h e x a n e ，m e t h a n o l ： o i l ( m o l a rr a t i o ) = l ：1 ，m e t h a n o lw a s e c t e de v e r y1 2 h , s i l i c ag e lw a sa d d e da f t e r r e a c t e dl h , t e m p e r a t u r eo f r e a c t i o nw a s4 0 。c ，t h ee i l z y m ea m o u n tw a s7 ( w t b yo i l ) ， r e a c t e d4 8 1 1 , t h ec o n v e r s i o ng o t9 4 5 a tl a s t c a t a l y z e dw a s t eo i l a tt h es a m e c o n d i t i o n , t h ec o n v e r s i o ng o t8 7 7 t h er e a c t i o nc o n d i t i o n sw h i c hi n f l u e n c e dt h ec a t a l y z e de f f e c to f n o v o z y m e4 3 5 w e l ei n v e s t i g a t e d , s u c ha sm o l a rr a t i oo fa l c o h o la n do i l ，s h o r tc h a i na l c o h o l ，o r g a n i c s o l v e n kr e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e ，a n de n z y m ea m o u n t i tw a sd i s c o v e r e d t h a te n z y m ew o u l db eq u i c k l yi n a c t i v a t e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f m e t h a n o lb e y o n d 3 2 0 m u l s i l i c ag e l sw e r ea d d e di n t or e a c t i o ns y s t e mt oa d s o r bm e t h a n o l ，q u i c k l y d e c r e a s e dm e t h a n o lc o n c e n t r a t i o na n dp r o t e c t e de n z y m e ，b e c a m e b u f f e rb o t t l e o f m e t h a n o l ；o nt h eo r d e rh a n d , t oa d s o r bg l y c e r o lp r o d u c e df r o mr e a c t i o n , p r o m o t e d t r a n s e s 把r i f i c a t i o n , a n dt oe l i m i n a t et h et r a n s f e r r e dr e s i s t a n c eo f g l y c e r 0 1 t h eo p t i m a l r e a c t i o nc o n d i t i o n ：s o l v e n tw a st h ep e t r o le s t e r , m e t h a n o l ：o i l ( m o l a rr a t i o ) = 3 ：1 i m e 也a n o lw a s 硒e c t e da to n et i m e ，3 0 r a i np a s t ，s i l i c ag e lw a sa d d e d , s i l i c a g e l ：o i l ( w t ) 卸8 3 ：1 ( o 8 7 ：1 ，w a s t e o i l ) ，t e m p e r a t u r e o f r e a c t i o n w a s 4 0 c ( 4 3 c ， w a s t eo i l ) ，t h ee n z y m ea m o u n tw a s8 ( w t b yo i l ) ，r e a c t e d3 0 h ，c a t a l y z e dt h er e f i n e d t e ao i lt h ec o n v e r s i o ng o t9 1 2 a tl a s t , a n dt h ew a s t eo i lg o t8 9 1 t h es t a b i l i t yo f n o v o z y m e 4 3 5w a se x c e l l e n t , r e u e s e d1 5t i m e s ，t h ec o n v e r s i o n y i e l dh a v en o td e c r e a s e d k e yw o r d s ：b i o d i e s e l ；o r g a n i cp h a s e ；e n z y m ec a t a l y s i s ；t r a n s e s t e r i f i c a t i o n ； w a s t eo i l i v 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 1 1 前言 第一章绪论 能源是人类文明进步的先决条件，是经济和社会发展的重要物质基础。1 9 0 0 年世界能源由柴草时期进入煤炭时期，煤炭时期持续了五六十年。7 0 年代的产 业革命以后，化石燃料的消费量急剧增长，同煤炭相比，石油和天然气热值高、 加工、转换、运输、储存和使用方便、效率高，而且是理想的化工原料。特别在 第二次世界大战以后，人们对石油和天然气的依赖越来越大，虽然近3 0 年来世 界已经经历了两次石油危机，但世界石油消费量丝毫没有减少的趋势。到2 0 0 3 年全球石油已探明储量为1 5 6 5 8 亿吨，产量已接近3 7 亿吨。其中9 4 分布在已 发现的1 3 1 1 个大油田中，每年产量按3 7 亿吨计，仅够开采4 2 年，到2 0 4 0 年全 世界将面临石油耗尽的局面。我国石油剩余可采储量为3 3 亿吨，占世界的2 3 ，列世界第十一位。我国是世界上少数以煤炭为主要能源的国家，与世界能源 结构相比，我国严重缺少石油和天然气，其储量人均值仅分别为世界平均值的 1 l 和1 4 ，我国石油消费的增长速度大大高于石油生产的增长速度，石油供 应前景严峻。自1 9 9 3 年起我国已成为石油的净进口国，预计到2 0 1 0 年石油缺口 为1 2 亿吨，2 0 2 0 年为2 1 亿吨。对石油的进口依赖度将达到7 6 9 。能源危机 已经刻不容缓地摆在我们面前 i 。3 1 。 与此同时，大量化石燃料的使用，加速了对人类赖以生存的生态环境的破坏。 从1 9 世纪末到2 0 世纪末的一百年中，全球平均气温上升了o 7 ，c 0 2 和s 0 2 全球平均浓度的升高与化石燃料的使用有着最直接的关系。2 0 世纪中叶，著名 的“伦敦大气污染事件”更给人们敲响了警钟。化石燃料燃烧后的主要污染情况见 表1 1 。 因此，生物质能源就以其可再生性和环境友好性引起广泛关注。生物质是指 地球上从光合作用获得的各种物质，它是以化学形式储存的太阳能，也是以可再 生形式储存在生物圈中的碳。因此，它是地球上一个巨大的能源库。1 8 9 5 年， 德国工程师d r r u d o l f d i e s e l 发现普通植物油脂同样具备燃料油特性，基于此提 出生物柴油( b i o d i e s e l ) 这一概念，并在1 9 0 0 年巴黎博览会上展示了使用花生油作 燃料的发动机，引发轰动。但由于各种原因，直到了上世纪5 0 年代末6 0 年代初， 生物柴油较系统的研究工作才真正开始，7 0 年代的石油危机之后，生物柴油得 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 到了大力发展【5 卅。 表1 1 化石燃料产生的主要大气污染物的特征及其对健康和环境的影响f 4 】 t a b l e1 一lc h a r a c t e ro fa l rc o n t a m i n a t i o nf o s s i lf u e lb u r n e da n de 仃音c t so f h e a l t ha n de n v i r o n m e n t 1 2 本课题研究目的及意义 1 2 1 研究目的 ( 1 ) 目前，国外生物柴油的研究已进入产业化生产，许多发达国家都已建 立了相应的生物柴油的标准，而且国外一政府对发展生物柴油予以大力支持，提 供很多优惠政策。而在国内，生物柴油的研究才刚起步，基本还处于实验室研究 2 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 阶段，多采用化学法制备，选择的原料成本也较高，因此，开发成熟的生物法工 艺和寻找廉价的原料势在必行。 ( 2 ) 酶是一类由细胞产生具有催化活性的特殊蛋白质，酶催化的反应具有 专一性强，催化效率高的特点。八十年代以来，大量的研究发现，与过去认为酶 只能在水溶液中反应相反，在非水相中( n o n a q u e o u sm e d i a 也称非水介质) 中 也具有催化活性。通过非水相酶催化可以完成多种化学反应：氧化、还原、脱氢、 脱氨、羟基化、烷化、酯化、酰胺化、环氧化等。尤其在不对称合成和手性拆分 方面有独特优势。其中，脂肪酶以其水解、酯化活力高，底物适应范围广，价格 便宜，而被广泛应用。考察酶在有机相中催化底物的各反应参数，优化反应条件， 为生物法制备生物柴油的商业化应用打下基础。 1 2 2 研究意义 广西是西部大开发省区之一，是农林大省，可再生资源又很丰富，但能源贫 乏。本文使用广西本地特产的茶油和餐饮行业食用过的廉价废油脂为原料，开展 制备生物柴油的技术研究，不仅可作为解决广西能源贫乏的途径之一，同时廉价 的废弃油脂变成一种有用的工业资源，从而切断其重新流入食用领域的途径，有 效保障人们身体健康，并改善城市环境。最重要的是所形成的生物柴油制备技术 具有知识产权，符合目前国家增强自主创新和发展循环经济的要求。 1 3 文献综述 在长期研究中人们发现将动、植物油脂酯化后，所得的长链脂肪酸单酯炭原 子数在1 5 1 8 之间，与以石油裂化为基础的普通柴油非常相似，其十六烷值、黏 度、燃烧热指标均达到普通柴油的标准；对比普通柴油其闪点高和怜点( c l o u d p o i n t ) 低，作为燃料更具安全性和抗冻性。人们将这种脂肪酸单酯命名为生物柴 油。由于生物柴油由可再生的动、植物油脂制得，属于可降解的再生能源，且含 硫量极低，燃烧时产生的废物、废气少，对环境污染小，因此生物柴油受到广泛 关注 7 1 。 运用动、植物油脂代替石油在第二次世界大战期间就已被提出，最初采用直 接与汽油、柴油混合使用发现最大的问题是动、植物油脂的黏度太大，长时间使 用对发动机造成严重损害。后采用高温裂解、微乳化等方法试图降低动、植物油 脂黏度，但成效不大。现阶段较为成功的方法是转酯化法，即动、植物油脂与短 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 链脂肪醇在催化荆的作用下发生转酯化反应，生成相应的脂肪酸单酯和甘油。欧 美等国研究工作开展较早，目前生物柴油在欧洲、美国已开始实现工业化生产， 生产的重点问题在于不断改进生产工艺，降低成本，减少环境污染。总体而言， 生物柴油的生产成本主要来至两方面：一方面源于原料的价格和来源，占整个生 产成本的7 0 - 9 5 ，另一方面则是生产过程中的额外耗能。 1 3 1 生物柴油的定义及性质 根据1 9 9 2 年美国生物柴油协会( n a t i o n a lb i o d i e s e lb o a r d ，n b b ) 的定义，生物 柴油是指：以植物、动物油脂等可再生生物资源生产的可用于压燃式发动机的清 洁替代燃油。从化学成分上讲，生物柴油是一系列长链脂肪酸甲酯。现阶段的生 产方法是转酯化法，即：动、植物油脂与短链脂肪醇在催化剂的作用下发生转酯 化反应，生成相应的脂肪酸单酯和甘油。反应方程式如下所示： h 2 午一o o c r 1 h g o o c r 2 + 3 r o h i h 2 c o o c r 3 g l y c e r i d ea l c o h o l c a t a l y s t r 一c o o r r 2 一c o o - r i r 3 一c o o - r t g l y c e r i o l 1 3 1 1 生物柴油的性质 1 2 - 1 4 1 燃料油性质 发火性 十六烷值是衡量燃料在压燃式发动机中发火性能的指标，十六烷值低则滞燃 期长，不易发火。适宜的柴油十六烷值在4 5 6 0 ，常见植物油制备的长链脂肪 酸甲酯十六烷值都在4 0 6 0 之间，可见生物柴油的发火性良好； 燃烧热效 生物柴油中含碳比例比柴油低，是因为其含氧比例增加，氧在燃烧时起到一 定的补尝作用，燃烧热效与柴油基本相当； 低温流动性 生物柴油的凝点低，具有良好的低温启动性和润滑性； 安全性 生物柴油的闪点与是柴油的三倍，无论在运输、储存、使用等方面安全性都 超过柴油； 腐蚀性 4 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制备生物柴油 生物柴油含硫量极低，燃烧后的酸值一般都在o 5 m g k o h g ，优于柴油。 表1 - 20 4 柴油与生物柴油的比较 t a b l e1 2c o m p a r i s o nb e t w e e no 。d i e s e la n db i o d t e s e l 项目质茸指标 。以大豆油制备的生物柴油为例 环境友好性 生物柴油中硫含量低，使得二氧化硫和硫化物的排放明显降低，可减少约 3 0 ；生物柴油中不含对环境造成污染的芳香族烷烃，因而废气对人体损害低于 柴油；由于生物柴油含氧量高，使其燃烧时排烟少，一氧化碳的排放与柴油相比 减少约1 0 ；与普通柴油相比，使用生物柴油可降低9 0 的空气毒性，降低9 4 的患癌率。 生产生物柴油的原料是自然生长的动、植物油脂，因此，生物柴油具有优良 的生物降解性。 1 3 2 化学转酯化法及工业研究进展 以无机酸、碱作催化剂进行转酯化反应即为化学转酯化法。反应为3 个连续 可逆过程【l5 l 从三酯最终转化为单酯。用于转酯化反应的醇包括甲醇、乙醇、丙 醇、丁醇和戊醇，其中最为常用的是甲醇，这是由于甲醇的价格较低，同时其碳 链短、极性强，能够很快地与脂肪酸甘油酯发生反应，且碱性催化剂易溶于甲醇。 催化剂可以是均相的( 液态的酸、碱) ，也可以是异相的( 固态的金属氧化物) 。 其中碱性催化剂包括氢氧化钠、氢氧化钾、各种碳酸盐以及钠和钾的醇盐，酸性 催化剂常用的是硫酸、磷酸或盐酸。碱性催化剂的效率比酸性高，因此商业化生 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 产中以碱性催化剂为主。醇、油的化学计量比是l ：3 ，但是在实际生产中为使反 应平衡向产物方向移动，醇通常是过量的：同时为防止反应过程中发生皂化反应， 所用的甘油酯和醇必须无水。如果体系中水和自由脂肪酸的含最较高，则先用酸 性催化剂。由g v i c e n t e 等1 16 j 设计的二维工业化生产模型可见，温度和催化剂浓 度是影响反应的最主要因素，其中催化剂浓度比温度的影响效果更明显。最佳反 应条件是；温度2 0 5 0 ，催化剂的最大质量分数为1 3 。经转酯化反应后， 产物是脂肪酸单酯、醇、催化剂、甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯的混合物。要 获得纯净的脂肪酸单酯，必须经过复杂的分离工段。 生产规模较小时可采用间歇式反应器，而生产规模大于4 0 0 万t a 则需使用 连续搅拌槽式反应器( c s t r ) 或活塞流反应器( p f r ) ，反应分为2 步【1 7 1 ：在第一 阶段先加入8 0 的醇和催化剂，然后通过一个甘油移除装置将余下的2 0 醇和 催化剂加入第2 个c s t r 中，这样得到的转化率比仅使用一步反应要明显提高。 反应结束反应液分为2 层：上层为甲酯层，下层为甘油层。由于甘油在甲酯中的 溶解度很小，因此能迅速分离而不需要额外离心。为防止逆反应发生，待分离甘 油和甲酯后，再将反应体系中过量的甲醇去除。最后用水洗涤产物，除去残留的 催化剂、皂液、盐及部分溶解在酯中的甘油。中和工段的作用是去除残余的催化 剂和在反应过程中可能生成的皂化物。图1 - 1 为生物柴油制备流程示意图。 甲岸 油 僵化刹 图l - l 生物柴油制备流程示意图 。f 培1 - 1p r o c e s sf l o ws c h e m a i i cf o rb i o d i e s e ip r o d u c t i o n 为降低成本，人们开始寻找更便宜的原料。m i c h a e lj h a 嬲【1 8 l 提出使用皂脚 料为原料，这是一种植物油精炼过程中的副产物，是含有大量油脂的碱溶液，其 中水质量分数为5 0 ，并包括自由脂肪酸、磷酸酰基甘油、色素、三酰基甘油和 其他非极性大豆油成分。目前市场价格约o 1 1 美元瓜g ，比常用的大豆油( o 4 8 0 5 7 美元d k g ) 便宜许多。更多的科学家提出以用过的废油为原料，既降低成本， 6 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 又解决了废物再生问题，保护环境。加拿大的学者们1 1 9 1 设计出非常完整的工业 生产方案：在连续化碱式催化过程中，以废油为原料需在原工艺基础之前加一个 预处理工段，包括自由脂肪酸的酯化、甘油的沈涤和甲醇的再生。他们还进行了 经济核算和统计分析，得出制备生物柴油经济可行性的最关键因素是工厂的生产 能力( 年产量) 、原料油( 废油) 的价格以及成品生物柴油的价格。 另一方面，转酯化过程中的副产物甘油以及甘油衍生物( 单甘油酯和三 甘油酯) 是优良的合成中间体，回收高附加值甘油是一条行之有效的降低成本的 方法。通常是直接蒸馏回收甘油，也可将甘油转化为单、三甘油酯的形式，这个 过程是反应中甘油与未反应的三酰基甘油自然形成【2 0 l 。单、三甘油酯是制备醇 酸树脂，清洁剂和其他表面活性剂的重要修饰基团。单甘油酯还广泛应用于化妆 品、颜料地蜡、合成橡胶、衣料、纺织品等的制造过程中。 1 3 3 生物转酯化法及工业研究进展 化学转酯化法最大的问题在于工艺复杂、能耗高、易造成环境污染。若以酶 或细胞为催化剂的生物转酯化法代替传统的化学转酯化法则可克服以上缺点。从 目前报道情况来看，生物转酯化法工艺较为简单、反应条件温和、选择性高、醇 用量小、副产物少、生成的甘油易回收且无需进行废液处理【2 1 1 。 生物转酯化法首要解决的问题是找到适合的生物催化剂，一般可以选用现有 的商品酶，也可利用产酶细胞。对于制备生物柴油，通常选择脂肪酶作催化剂， 脂肪酶可用于催化无水条件下的酯化和转酯化反应。 1 3 3 1 游离脂肪酶作催化剂 已经报道有多种脂肪酶可用于催化合成生物柴油，其中活力较高的有：假单 胞脂肪酶( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) 、假丝酵母脂肪酶( c a n d i d ac y l i n d r a c e a ) 、 根霉脂肪酶( r h i z o p u so r y z a e ) 等，但各类脂肪酶之间的催化特性和在不同介质 中表现出的催化效果各有不同。m k a i e d a 等1 2 2 】研究发现，根霉脂肪酶能在初始含 水质量分数为4 3 0 的反应系统中催化植物油生成生物柴油。n 1 lk a m i n i 等】研究了影响隐球菌( c r y p t o c o c c u ss ps - 2 ) 在水相中催化植物油转酯化的各 种因素，得出反应最佳条件是：油甲醇摩尔比是1 ：4 ，含水质量分数为8 0 ，在 转速1 6 0 r m i n 、3 0 下反应1 2 0 h ，最终脂肪酸甲酯的质量分数可达8 0 2 。a m v 等刚研究了r h i z o p u so r y z a e 在含水量7 5 的体系中( 以底物的重量计) 催化 转酯化活性白土中吸附的废油( 含大豆油、棕榈油、油菜籽油) ，油醇摩尔比1 ： 4 ，加入6 7 i u g 的底物，摇床转速：1 7 5 r p m ，3 5 下反应9 6 小时，转化率可达 7 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 5 5 。 脂肪酶选择性好，催化活力高，但若直接将其作为大规模工业生产的催化剂 还面临不少问题。首先，脂肪酶价格昂贵，使用量大，成本太高；其次，作为底 物的短链脂肪醇对酶有毒性，尤其是甲醇会导致脂肪酶发生不可逆失活；再次， 一些脂肪酶在有机相中的分散性不佳，需要对其作修饰；另外，其对长链脂肪醇 不起催化作用。 1 3 3 2 固定化脂肪酶作催化剂 将固定化技术引入生物柴油的工业化生产中，可大大提高酶的稳定性和重复 使用率，降低成本。早在2 0 世纪9 0 年代末日本大坂市政科技研究所( o s a k a m u n i c i p a lt e c h n i c a lr e s e a r c hi n s t i t u t e ) 对固定化脂肪酶催化转酯化植物油脂做了 大量研究，并进行了初步工业化设计。利用丹麦诺维信公司( n o v o z y m c s ) 生产 的固定化假丝酵母脂肪酶n o v o z y m4 3 5 ，ys h i m a d a 等1 2 5 l 成功利用三步法，即 每次分别加入1 3 摩尔当量的甲醇，在3 0 * ( 2 下反应4 8 h 转化率达9 7 3 。他们还 发现，甲醇在三酰基甘油与脂肪酸甲酯的混合体系中，其溶解性要优于其在纯三 酰基甘油体系的，这样可在第一步反应后将剩余的2 3 甲醇一次加入，使得三步 法简化成两步法，反应3 6 h 后转化率达到9 6 8 。但把两步法用于固定床连续反 应时，酶却发生失活现象。研究发现，当反应副产物甘油不断在反应器底部积累 时，其高黏性阻碍了酶分子在底物分子中的扩散，降低了催化效率，最终导致酶 失活。 为实现工业化应用，他们设计了以废食用油为原料应用三步法连续生产生物 柴油的反应器。废食用油中含水、自由脂肪酸及部分酰基甘油的质量分数分别为 0 1 9 8 、2 5 和4 6 。由于含水质量分数大于0 0 5 ，会降低反应速率，但通过 增加反应循环次数可以消除水对转化率的影响。设计三步分批进料，分别在1 0 h ， 1 4 h 和2 4 h 加入i 3 m o l 当量的甲醇。经过4 8 h 转化率达到9 0 4 ，比使用植物油为底 物9 5 9 的转化率略低一些。从反应进程曲线上看，第一、第二步与植物油为底 物时没有区别，转化率降低的原因在于：油品在煎炸后，一些脂肪酸被氧化和热 解为环氧化物、醛、聚合物等，积累以后酶无法识别这些组分，到了反应后期这 种累积作用开始体现。考察酶的稳定性，反应循环5 0 次( 共1 0 0 天) 转化率没有 明显的降低。将反应设计成固定床三步连续溢流反应，将废油和1 3 m o l 当量的甲 醇混合开始第一步反应，一段时间后反应液移入储罐中，静置去除甘油，再将洗 脱液移入下一反应器继续第二步反应，如此循环。以6 m l h 的流速，在3 0 下反 应1 0 0 天，每三步反应后转化率都在8 9 以上。( 反应装置如图2 ) 反应结束将酶 8 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 从每个反应器中取出，测定其活力与分批进料第一步反应时使用的酶活力一致， 说明在上述条件下酶的稳定性极高。 图1 - 2 三步法连续生产生物柴油固定床生物反应器示意图 f i g 1 - 2c o n t i n u o u sf l o wp r o d u c t i o no f b i o d i e s e lf u e lw i t ht h r e ef i x e d - b e db i o r e a c t o ri ns e r i e s 同样，法国学者 2 6 1 研究发现，在填充床连续反应器中，甘油不溶于正己烷， 吸附到酶表面形成亲水性阻碍，限制了疏水性底物从有机相向酶扩散，造成酶失 活。改用三步法，并将产物洗提，放置过夜除去甘油，反应1 0 0 天仍未发现酶有 任何失活，转化率可达9 3 。 为了避免由甲醇引发的酶失活，清华大学的d u 等【2 7 】用乙酸甲酯代替甲醇作 为酰基受体与大豆油( 摩尔比= 1 2 ：1 ) 进行酯交换反应，同样以n o v o z y m4 3 5 为 催化剂，其相应的甲酯收率为9 2 。但是其最大缺陷在于酶的用量过大，都要加 入质量分数为3 0 ( 与油质量相比) 的酶。 德国学者 2 s j 和日本东京农业科技大学( t o k y ou n i v e r s i t yo fa g r i c u l t u r ea n d t e c h n o l o g y ) 的学者f 2 9 j 则是以固定化的假单胞脂肪酶作催化剂，分别催化转酯化 向日葵仔油与短链脂肪醇和红花油与短链脂肪醇的底物，生物柴油的转化率都超 过9 0 。北京化工大学将自有菌株发酵提取的脂肪酶( c a n d i d as p 9 9 1 2 5 ) 1 3 0 1 经过 用硅藻土吸附固定化后作为催化剂，用于酯交换来制备生物柴油。当采用正已烷 作溶剂，使用1 5 固定化脂肪酶( 相当于油的质量，酶活1 8 0 0 0 i u g ) 加入2 0 质 量分数的水，温度为4 0 ( 2 在p h 值为7 时，采用每1 0 h 流加1 t o o l 当量的甲醇共分3 次 流加，反应的最高转化率可以达n 9 6 ，并且固定化酶使用半衰期达2 0 0 h 以上。 9 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 固定化技术的运用为实现生物柴油工业化生产迈出了坚实的一步，其在许多 方面都优于游离酶，但时至今日用于工作化的实例仍然很少。最主要的原因是廉 价、制备方法简单、活化效果好的固定化载体尚未找到。加之存在低碳醇和甘油 对酶的失活问题，这都迫使科学家们在开发新型固定化载体、方法和改进生产工 艺上不懈努力。 1 3 3 3 全细胞作催化剂 上述反应都是以脂肪酶作催化剂，如果使用全细胞作生物催化剂，并将其吸 附在一些多孔可渗透生物质支撑物中，就可省去复杂的酶纯化和固定化过程，大 大降低工业生产的成本。h i d e k if l l l ( u d a 所领导的小组在这方面做了比较全面和深 入的研究。由于酵母细胞的细胞壁刚性较强，在有机化合物和有机溶剂存在的条 件下仍能保持其结构。t m a t s u m o t o 等 3 l l 首先构建出产米根霉脂肪酶的酿酒酵母 m t 8 1 ，其脂肪酶活力可达4 7 4 5i u l ，采用预先冻融或风干方法增强酵母细胞 的渗透性后将其用于催化由大豆油合成脂肪酸甲酯，反应液中甲酯质量分数为 7 1 。在进一步的研究【3 2 l 中，将细胞与多孔载体共同培养8 0 9 0 h 后直接将甲醇 分3 次加入发酵液，所获得的甲酯质量分数达到9 0 ，与用胞外酶作催化剂的效 果相当。k b a n 等1 3 3 j 还研究了m t 8 1 全细胞的稳定性，细胞经戊二醛交联处理 后，经过6 批次反应，胞内酶的活力仍无明显降低。s h a m a 等瞰】研究了细胞膜脂 肪酸的组成对制备生物柴油的影响，研究发现，富含油酸或亚油酸的细胞比富含 饱和脂肪酸的细胞表现出更高的反应初速度；而富含棕榈酸的细胞比富含不饱和 脂肪酸的细胞表现出更好的稳定性。他们认为这是由于细胞膜的脂肪酸组成不同 使得细胞膜的渗透性有明显区别，从而影响反应的初速度和酶的稳定性。全细胞 生物催化剂在工业生产中的应用潜力巨大，通过基因工程技术提高脂肪酶的表达 水平和对甲醇的耐受性等，可以进一步提高全细胞的使用效率。 1 3 4 国内外工业化现状 美国是最早研究生物柴油的国家，早在1 9 9 0 年就有相关的法规。1 9 9 2 年美 国能源署( e p a c t ) 及环保署都提出用生物柴油做燃料，美国前总统克林顿于1 9 9 9 年签署了开发物质能的法令，其中生物柴油被列为重点发展的清洁燃料之一，采 取免税策。表1 3 列出了1 9 9 8 年统计的全球生产生物柴油的数据。 我国也正逐步加大相关方面的研究工作，清华大学、北京化工大学、江苏工 业学院、江苏大学、湘潭大学等已在生物柴油研究工作上取得了一定进展，同时 在四川和海南已建成拥有自主知识产权的企业，海南正和生物能源有限公司于 l o 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制备生物柴油 2 0 0 1 年在河北邯郸建成以回收废油、野生油料为原料、年产1 万t 生物柴油的试 验厂，其技术和产品己于2 0 0 2 年1 0 月通过了国家经贸委新产品技术鉴定。经石 油化工科学研究院检测，产品质量优于国家轻柴油质量标准，并达到美国a s t m 生物柴油标准，海南正和公司的成功，标志着我国生物柴油产业的诞生。四川古 杉汕脂化学公司采用高科技提炼加工方法，利用植物油和潜水油为原料生产的生 物柴油，2 0 0 2 年己完成中试，形成了l 万“年的生产规模。目前，生物柴油产业 得到了国务院领导和国家发改委、国家经贸委、科技部等政府部门的支持，并已 列入有关国家计划。但是，与国外相比，我国在发展生物柴油方面还有相当大的 差距，长期徘徊在仞级研究阶段，未能形成生物柴油的产业化。 我国应该走以国家政策大力扶持，地方政府全力支持，各种社会资金积极投 入的科学生产模式，加快从实验室到建厂投产的速度，形成从原料供给工厂 生产全国销售的完善产业链 3 4 - 3 7 】。 表1 - 31 9 9 8 年全球生物柴油生产情况 t 如l e1 - 3b i o d i e s e | p r o d u c t i o no f w h o | ew o r ni n1 9 9 8 括号中的数据代表正在建设之中 广西大学硕士学位论文 非水相体系中酶催化制各生物柴油 参考文献 【1 】唐炼世界能源供需现状与发展趋势【j 】国际石油经济，2 0 0 5 ，1 3 ( 1 ) ：3 0 3 3 【2 】赵庆波，单葆国世界能源需求现状及展望 j 】中国能源，2 0 0 2 ( 2 ) ：3 4 3 6 【3 】张波，张进江，陈晨，等中国能源安全现状及其可持续发展叨。国土与自然 资源研究，2 0 0 4 ( 3 ) ：7 5 7 6 4 】王庆一中国与世界能源数据2 0 0 3 版( 6 ) 【j 】煤炭经济研究，2 0 0 4 ( 8 ) ：7 4 7 8 【5 】常振明，韩平，曲春洪可再生能源利用现状与未来展望阴当代石油石化， 2 0 0 4 1 2 ( 1 2 ) ：1 9 - 2 3 【6 】谭天伟，王芳，邓立生物能源的研究现状及展望阴现代化工，2 0 0 3 ，2 3 ( 9 ) ： 8 1 2 【7 】王一平，翟怡，张金利，等生物柴油制备方法研究进展【j 】化工进展，2 0 0 3 ， 2 2 ( 1 ) ：8 - 1 2 【8 】谭天伟，王芳，邓立，等生物柴油的生产和应用叨现代化工，2 0 0 2 ，2 ( 2 ) ：4 - 6 1 9 f r e o d m a nb ，p r y d eeh ，m o u n t st l v a r i a b l e sa f f e c t i n gt h ey i e l d so ff a t t ye s t e r s f r o m t r a n s e s t e r i f i e d v e g e t a b l e o i l s 明j a o c s ，1 9 8 4 ，6 1 ：1 6 3 8 1 6 4 3 【1 0 g e m m avm e r c e d e sm ，j o 始a o p t i m i z a t i o no fb r a s s i c ac a r i n a t ao i i m e t h a n o l y s i sf o rb i o d i e s e lp r o d u c t i o n j 1 j a o c s ，2 0 0 5 ，8 2 ( 1 2 ) ：8 9 9 9 0 4 【11 n e l s o nla ，f o g l i at 气m a n n e rwn l i p a s e - e a t a l y z e dp r o d u c t i o no f b i o d i e s e l 明j a o c s ，1 9 9 6 ，7 3 ( 8 ) ：1 1 9 1 1 1 9 5 【1 2 】忻耀年，s o n d e m a n nb 现代生物柴油的生产工艺及产品质量阴中国油脂， 2 0 0 3 ，2 8 ( 11 ) ：6 2 - 6 4 【1 3 】徐鸽，邬国莼生物柴油与0 4 柴油调和性能研究叨江苏工业学院学报，2 0 0 3 ， 1 5 ( 2 ) ：1 6 - 1 8 【1 4 】梅德清，袁银南，王忠生物柴油燃料特性的研究川研究与实验，2 0 0 4 ， 1 1 “5 ) ：2 0 - 2 2 【1 5 f g 梅，李为民，邬国英生物柴油研究进展川中国油脂，2 0 0 3 ，2 8 ( 4 ) ：6 6 7 0 1 6 v i e e n t eg c o t e r o na m a r t i n e zm ，e ta 1 a p p l i c a t i o no f t h ef a c t o r i a ld e s i g no f e x p e r i m e n t sa n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yt oo p f i m i z eb i o d i e s e lp r o d u c t i o n 阴 i n d u s t r i a lc r o p sa n dp r o d u c t s ，1 9 9 8 ，8 ( 1 ) ：2 9 3 5 【1 7 g e r p ejv b i o d i e s e lp r o c e s s i n ga n dp r o d u c t i o n j f u e lp r o c e s s i n gt e c h n o l o g y 。 2 0 0 5 。8 6 ( 1 0 ) ：1 0 9 7 - 1 1 0 7 【1 8 h a a sm j i m p r o v i n gt h ee c o n o m i c so f b i o d i e s e lp r o d u c t i o nt h r o u g ht h eu s eo f l o wv a l u el i p i d s 嬲f e e d s t o c k s ：v e g e t a b l eo i ls o a p s t o c k 四f u e lp r o c e s s i n g t e c h n o l o g y ，2 0 0 5 ，8 6 ( 1 0 ) ：1 0 8 7 - 1 0 9 6 广西大学硕士学位论文非水相体系中酶催化制各生物柴油 19 z h a n gy ，d uma ，m c l e a n add ，e