（发育生物学专业论文）sos1+rnai对盐芥耐盐性的影响.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得 注 如没有其他需要特别声明 的 本栏可空 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料 与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 约a 块 导师签字 学位论文版权使用授权书 彳易钐 本学位论文作者完全了解 墩有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权 堂撞 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或 扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 弓壶集 导师签字 签字日期 矽f 年6 月7 日签字日期 纫6 年 月7 日 山东师范大学硕士学位论文 s o s li 矾m 对盐芥耐盐性的影响 马文英 山东师范大学生命科学学院 济南 2 5 0 0 1 4 中文摘要 盐胁迫下 植物细胞的离子均衡受到破坏 胞质中积累过多的n a 对植物细胞的代谢 产生毒害 植物细胞为适应胁迫环境 一方面积累可溶性有机物质 另一方面 则通过n a 外排或者区隔化 并调整k 肘a 比率的机制来消除n a 的毒害 拟南芥细胞内控制n a p b j j 的基因s o s l 及离子区隔化基因a t n h x l 均己克隆 s o s l 及a t n h x l 在拟南芥中的过量表达 显著提高了转基因植株的耐盐性 在拟南芥中 s o s l 及s o s 2 s o s 3 所组成的s o s 信号通 路的调控机制业已得到阐明 研究表明s o s 信号通路在调控离子均衡和植物耐盐性中发挥 重要作用 作为拟南芥近缘的盐生植物盐芥 短时间内能耐受高达5 0 0 m m n a c l 的冲击 在 盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化 表明其耐盐性很大程度上源于基本的 生理和生化机制 因此在盐芥中沉默s o s l 基因进行研究 对揭示盐生植物耐盐性的基础具 有重要意义 本实验将盐芥编码n 删逆向转运蛋白的s o s l 基因7 2 1 b p 的片断反向重复构建到基因 沉默载体p g s a l 2 5 2 中 导入农杆菌后 进行植物遗传转化 实现盐芥中s o s l 的转录水平 的下降 在用浓度为5 0 p p m 的g l u f o s i n a t ea m m o n i u m 筛选后 获得转基因株系 自交一代获 得足够的转基因种子后 对其进行了分子生物学的验证及生理指标的检验 转基因植株的分 子生物学检测如下 1 各转基因株系中 均能通过p c r 扩增出b a r 基因的5 0 0 b p 的特异性条带 表明 卜 d n a 已经携带b a r 基因及s o s l 基因片断整合进盐芥基因组中 2 r e a l t i m e p c r 结果显示 转基因株系在n a c l 处理条件下s o s l 转录水平会发生不同 程度的下降 进一步说明s o s i 基因的反向重复片段整合到拟南芥的基因组后已正常转录 并引起了s o s i r n a 的降解 耐盐生理指标分析表明 1 在含不同浓度n a c l o 一3 0 0 m m o l l 的培养基上 s o s l 基因的沉默降低了转基因盐 芥的耐盐性 2 通过比较各个转基因株系之间耐盐性的差异及s o s l 转录的水平 发现s o s l 转录水 平降低越多 盐芥的耐盐性越差 山东师范大学硕士学位论文 3 在用不同浓度的n a c i 0 4 0 0 r e t o o l l 处理后 结果表明转基因植株长势明显差于 对照 4 n a k 含量测定表明 0 2 0 0m m o l l n a c l 处理下转基因根和地上部分n a 的积累 显著高于对照 3 0 0 4 0 0m m o l l l n a c l 处理下则差异不是很明显 0 4 0 0 m m o l l n a c l 处理 后 转基因植株和对照中 根和地上部分k 含量均下降 但差异不明显 5 在盐胁迫下 对m d a 含量的测定表明 野生型植株及转基因植株m d a 含量都增 加 转基因植株明显高于对照 以上结果表明 盐渍生境下 利用n a 外排的策略 降低n a 十含量 使植物免受过多的 伤害 是盐芥耐盐机制的重要组成部分 s o s l 的基因沉默降低了盐芥的耐盐性 关键词 s o s l 基因n d i i 逆向转运蛋白盐芥基因沉默植物耐盐性 分类号 q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 e f f e c to fs o s lr n a io nt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a m aw e n y i n g s c h o o lo f l i f es c i e n c e s h a n d o n gn o r m a lu n i y e r s i t y j i n a n2 5 0 0 1 4 a b s t r a c t s o i ls a l i n i t yi so d eo ft h em o s ts i g n i f i c a n ta b i o t i cs t r e s s e sf o rc r o pp l a n t si na g r i c u l t u r a l f i e l d sw o r l d w i d e h i g hl e v e l so fs o d i u mi o nr n a 5a r et o x i ct op l a n t sb e c a u s eo ft h e i ra d v e r s e e f f e c t so nc e l l u a rm e t a b o l i s ma n di o nh o m e o s t a s i s t h e r e f o r e m a i n t a i n i n gl o wl e v e l so f n a 十i n t h ec e l l s p e c i f i c a l l yi nt h ec e l lc y t o s o l i se s s e n t i a lf o rp l a n t s p l a n t sa r et h o u g h tt or e m o v en a f r o mt h ec y t o p l a s mb yt r a n s p o r t i n gi ti n t ot h ev a c u o l eo ro u to ft h ec e l lu s i n gn a h e x c h a n g e r sl o c a l i z e di nt h ev a c u o l a ra n dp l a s m am e m b r a n e s r e s p e c t i v e l y s o s le n c o d i n ga p l a s m am e m b r a n en a h a n t i p o r t e ra n da t n h x le n c o d i n gav a c u o l a rn a wa n t i p o r t e rw e r e i s o l a t e df r o mg l y c o p h y t i ca r a b i d o p s i st h a l i a n a a n do v e r e x p r e s s i o no fa t n h x la n ds o s ii n a r a b i d o p s i st h a l i a n ai n c r e a s e dt h e s a l tt o l e r a n c eo ft r a n s g e n i cp l a n t s s i g n i f i c a n t l y t h e m o d u l a t em e c h a n i s mo ft h es o ss i g n a lp a t h w a yc o n s i s t e do fs o s l s o s 2a n ds o s 3i n a r a b i d o p s i sh a sb e e ni l l u m i n a t e d s t u d i e s s h o w e dt h a tt h es o ss i g n a lp a t h w a yp l a y sa n i m p o r t a n tr o l e i ni o nh o m e o s t a s i sa n ds a l tt o l e r a n c eo fp l a n t s a sac l o s er e l a t i v eo f a r a b i d o p s i s t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ai sa b l et ow i t h s t a n dd r a m a t i cs a l i n i t ys h o c ku pt o5 0 0 m i l ln a c la n dg r o wi ns a l t 曲i ne x c e s so ft h ec a p a b i l i t yo fa r a b i d o p s i s t h i sp l a n td o e sn o t p r o d u c es a l tg l a n d so ro t h e rc o m p l e xm o r p h o l o g i c a la l t e r a t i o n se i t h e rb e f o r eo ra f t e r s a l t a d a p t a t i o n i ta p p e a r st h a ts a l tt o l e r a n c ei nt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a i sl a r g e l yt h er e s u l to f b a s i c b i o c h e m i c a la n dp h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s m s s og e n es i l e n c es t u d yo fs o s li nt h e l l u n g i e l l a h a l o p h i l ai si m p o r t a n tf o rr e v e a lt h e b a s eo f s a l tt o l e r a n c em e c h a n i s mo f h a l o p h y t e r n a io fs o s lf r o mt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ah a v eb e e nc o n s t r u c t e d a n d t h s o s l 一 p g s a l 2 5 2h a s b e e nt r a n s f e r r e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sg v l l 0 1 t h e l h i n g i e l l a h a l o p h i l aw a st r a n s f o r m e dw i t hb yf l o r a l d i pm e t h o d a n dt 1t r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e d w i t hh e r b i c i d ef i n a l e 回 f o r m e r l yn a m e db a s t a i nw h i c ht h ea c t i v eg r e d i e n ti sg l u f o s i n a t e a m m o n i u m f i n a l l y 15b a s r a r e s i s t a n tl i n e sw e r ea c q u i r e d a n daw e a l t h yo ft r a n s f o r m e dt 1 s e e d sw e r eh a r v e s t e d 3 山东师范大学硕士学位论文 4 t h em o l e c u l a rl d e n t i f i c a t i o no f t h e s eb a s t a r e s i s t a n tp l a n t sa r ea sb e l o w 1 p c rr e s u l ts h o w e dt h a ta l lb a s t a r e s i s t a n tp l a n t sh a ds t r o n gp o s i t i v es i g n a l s a n dn o s i g n a lw a ss h o w n i nw i l dt y p ep l a n t s 2 r e a lt i m ep c rr e s u l t ss h o w e dt h a tt h es o s lr n ad e c r e a s e di nd i f f e r e n tt r a n s f o r m e d p l a n t sw h e n t r e a t e dw i t ho rw i t h o u tn a c l t r a n s f o r m e da n dw i l dt y p ep l a n t s c o n t r 0 1 w e r ee v a l u a t e df o rs a l tt o l e r a n c e 1 o nm sm e d i u mc o n t a i n i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f n a c l o 3 0 0 m m o l l s i l e n c eo f s o s li nt h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ad e c r e a s e ds a l tt o l e r a n c e 2 b yc o m p a r i n gt h e d i f f e r e n c eo fs o s lr n al e v e la n ds a l tt o l e r a n c el e v e lo f t r a n s f o r m e da n dw i l dt y p ep l a n t s i ti sf o u n dt h a tt h em o r et h es o s lr n al e v e ld e c r e a s e d t h e m o r es a l ts e n s f f i v et h ep l a n t ss h o w e d 3 a f t e rt h et r e a t m e n to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sn a c l o 一4 0 0 m m o l l t h eg r o w t hs t a t u s o f t h et r a n s g e n i cl i n e sw a sd r a m a t i c a l l yw o r s et h a nt h a to f w i l dt y p ep l a n t s 4 i nt h i ss t u d y t h et r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e dat e n d e n c yt oa c c u m u l a t em o r en a u n d e r s a l i n ec o n d i t i o nt h a nw i l dt y p ep l a n t sd o 5 i nt h i ss t u d y t h et r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e dat e n d e n c yt op r o d u c em o r em d au n d e r s a l i n ec o n d i t i o nt h a nw i l dt y p ep l a n t sd o f r o mt h ea b o v er e s u l t si ti sc o n c l u d e dt h a tg e n es i l e n c i n go fs o s1i nt h e l l u n g i e l l a h a l o p h i l ad e c r e a s e di t ss a l tt o l e r a n c e a n ds o s lp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ne x p o r t i n gn a d u r i n gzh a l o p h i l aa d a p t i n gt os a l i n ee n v i r o n m e n t k e yw o r d s s o s l g e n es i l e n c e n d wa n t i p o r t e r t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a s a l tt o l e r a n c e c a t e g o r y q 7 8 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 土壤盐渍化问题是困扰农业生产的一大难题 世界上约有2 0 可耕地及4 0 的灌溉地 受到不同程度的盐渍化影响 l 我国有3 亿多亩盐渍化土地 约占全国可耕地面积的2 5 随着我国人口的剧增及工业的高速发展 可耕地面积急剧下降 而不合理灌溉又造成了大量 良田的次生盐渍化 因此 如何开发和利用大面积的盐渍化土地 提高作物产量就成为我国 农业生产中十分重要的问题 长期以来 国内外对盐碱化土地的改良和利用开展了广泛的研 究 过去的改良工作多是利用工程措施 例如 淡水压碱 挖沟排碱 引黄放淤 平地深翻 和筑堤种植等 虽然这些工程措施取得了一定成绩 但有许多不可克服的缺点 费用昂贵 效果不持久 淡水资源不足 淡水冲洗后土壤中的养分和盐分同时排走等 因而要从根本上 改良和利用盐碱地 必须转移到生物学措施方面 包括进行有价值的盐生植物的开发 进行 植物抗盐机理研究 以期找到和提出提高植物抗盐能力的有效措施 并利用基因工程改造植 物 最终解决开发利用盐碱地问题 1 植物对n a 的吸收 转运与细胞离子均衡 1 1n a 进入植物细胞的途径 钾离子是植物重要的必需元素 而与之化学性质 离子半径与水合能力最为相近的钠离 子对绝大多数植物而言却是有害的 细胞内过量的n a 可竞争性地取代钾离子而改变许多以 铡离子为激活剂的酶的性质 2 3 4 1 然而外界环境中常常含有过量的n a 而k 却常常处于匮乏 状态 所以植物在吸收k 的同时 常不可避免地吸收n a 植物细胞存在多种吸收k 的途径 而每种途径都可以同时吸收n a 十 图1 植物细胞通 过高亲和力与低亲和力钾通道吸收外界的钾离子 高亲和力钾通道如h k t l 可以在外界钾 浓度很低 微摩尔级 时激活钾的吸收 5 1 尽管早期认为是一种k i i 逆向转动蛋白 但是 现在证明它具有k n a 共转动体的活性 6 l 低n a 可以促进h k t l 对k 的转运 但是在外界 高浓度的n a 可以抑制k 十的吸收的对n a 的吸收 7 1 是细胞一种重要的吸n a 途径f 8 低亲和 力钾通道如a k t l 对k 的吸收在生理浓度范围内不具有饱和效应 是一种内整流离子通 道 在细胞膜超极化可使k 进入植物细胞 在细胞外k 浓度处于生理浓度范围时具有很好 的k 十 n a 选择性 但是细胞外n a 浓度很高时a k t l 可以吸收大量的n 矿 外整流离子通道 也可以吸收大量的n a 如非选择性外整流通道n o r c 可以在细胞膜去极化期间打开 9 1 导 致k 的外流与n a 十的内流 n o r c 在胞内c a 2 浓度升高时被激活且不区分阳离子种类而依 赖于各种离子的跨膜电化学梯度 由于细胞内外n a k 浓度的差异 常导致k 的泄漏与 山东师范大学硕士学位论文 n a 的吸收 在细胞外有高浓度n a 取代细胞膜表面的c a 2 时 也可诱导细胞膜的去极化而 促时对n a 的吸收 1 0 1 有研究表明植物细胞膜上存在非电压依赖性阳离子通道 v i c v i c 与电压依赖性通道不同 对n a 的选择性高于对k 的选择性 被认为是植物细胞吸收n a 的 主要途径 p h 5 s 一基7 i r k a n a r 辩 瓣矿k n a 辩 h 舢铷 一1 m v n o r cv i ca k t i f i k l p h 球篇7 o 7 4 图1 植物细胞n a 跨膜转运的几种主要途径 引自e d u a r d ob l u m w a l d 2 0 0 0 n o r c 非选择性外向整流通道 v i c 非电压依赖性离子通道 a k t l 低亲性性钾 载体 h k t l 高亲和性钾载体 f i g 1 n a u p t a k ea n de x t r u s i o na tt h ep l a n tp l a s m am e m b r a n e n o r c n o n s e l e c t i v eo u t w a r dr e c t i f y i n gc h a n n e l s w h i c ha r ea c t i v a t e db yc a 2 a n dd on o t d i s c r i m i n a t eb e t w e e nn a a n dk v i c v o l t a g e i n d e p e n d e n tc h a n n e l sh a v eah i g h e rn a k s e l e c t i v i t y a k t i l o w a f f i n i t yk c h a n n e lw i t hah i g h e rk n a s e l e c t i v i t y h k t i h i g h a f f i n i t yk n a s y m p o r t e r 1 2n a 排出植物细胞的途径 由于n a 跨膜电化学梯度的存在 植物细胞向外排出n a 的过程总是耗能的主动运输过 程 无论是直接主动运输还是间接主动运输 朱健康通过e m s 诱变获得了拟南芥盐敏感突变体s o s 并最终鉴定了定位于细胞质膜 上的n a 旷反向运输蛋白s o s l 它以质膜h a t p a s e 建立的跨膜质子电化学梯度为驱动 机 介导n a 的跨膜外排 s o s l 的同源基因目前已经在多种高等植物中发现 目前被认为 是高等植物细胞向细胞排n a 的主要机制 酵母e n a l 突变体的发现促进了植物细胞质膜n a a t p a s e 的研究 w a d a 等在金藻h e t e r o s i g m a a k a s h i w o 中首先发现了具有p 型a t p a s e 活性的n 矿 a t p a s e 并发现它可与动物细胞n a k a t p a s e 的抗体有免疫相互作用 在苔藓植物小立碗藓 p h y s c o m i t r e l l ap a t e n s 中也发现了e m 基因的同源基 习p p e n a l 尽管与酵母e n a l 基因的同源性并不高 但是具有可以互补酵母 山东师范大学硕士学位论文 e n a l 突变体的功能 这是在高等植物中首次也是目前唯一发现存在n a 十 a t p a s e 的报道 但 是对拟南芥与水稻基因组进行搜索 并没有发现它的同源基因 1 3n a 在植物细胞内的区隔化 植物细胞除向细胞外排出n a 外 更为普遍的细胞n a 调节机制是细胞内n a 的区隔化 即将n a 局限在液泡内以避免n a 对细胞原生质的伤害 液泡膜n a 一反向运输蛋白魁a 毋e x c h a n g e r n h x 被认为是n a 在液泡内区隔化的关键基因 目前在多种植物中已得到 克隆鉴定 通常耐盐的植物具有较高的n h x 活性 通过将n 矿区隔化入液泡 不仅消除了 对细胞原生质的伤害 而且可以n a 为渗透保护物质提高植物的吸水能力 而盐敏感植物通 常n h x 活性较低 液泡膜n a 十 矿反向运输蛋白以液泡膜i q a t p a s e 与焦磷酸酶h p r i i a s e 为跨膜运输的 驱动力 前者通过水解a t p 将质子泵入液泡 而后者通过水解焦磷酸p p i 将质子泵入液泡建 立质子电化学梯度为n a 跨膜转运提供驱动力 在拟南芥中最早鉴定的液泡n a 一反向运输蛋白为a t n h x l 对拟南芥全基因组的搜 索又发现了该家族的其它成员 分别为n h x 2 n i i x 3 n h x 4 n h x 5 与n h x 6 口3 1 y o k o i 等人对基因表达分析表明这些基因在表达丰度 器官特异性 诱导特性及离子选择性上都有 所不同 推测该家族的不同成员具有不同的作用 在这六个基因中 a t n h x l 与a t n h x 2 具 有较高的表达水平且在根与地上部分都有表达 a t n h x 5 在根与地上部分都有表达但表达水 平较低 a t n h x 3 只在根部有表达 而a t n h x 4 与6 的表达水平极低 只有通过r t p c r 才可以检测到 a t n h x l 2 5 都可在不同程度上互补酵母n h x l 突变体的n a 的敏感 性 而a t n i t x 5 对酵母n h x l 突变体对l i 敏感性只有很有限的改善 a t n h x l 和2 既受盐诱 导 1 4 也受渗透胁迫诱导 而a t n h x 5 只受盐诱导 a t n h x 的诱导表达并不依赖于s o s 通 路 但在s o s l s o s 2 与s o s 3 突变体中 在没有盐和干旱的条件下 其表达水平比野生型高 说明在非胁迫条件下 s o s 信号通路对n i i x 的表达有抑制作用 a t n h x l 与2 在盐胁迫下 的上调是依赖于a b a 丽不是n a c l 而a t n h x 5 更以一种未知的但不依赖于a b a 或s o s 的方式在盐冲击下被上调表达 a t n h x 2 被认为是控制n a 区隔化的主要成员 而a t n h x l 可能是基因冗余或有互补作用 二者的表达水平较高可能因为它们主要表达在可以积累n a 的细胞类型中 1 4n a 在植物细胞与组织器官内的转移 植物除了细胞水平对盐胁迫的适应外 在整体水平上通过盐分在不同组织器官问的转移 也是保护植物免受伤害的重要适应策略 因此不能把多细胞的植物视同 绿色酵母 山东师范大学硕士学位论文 早期研究植物耐盐机理提出的一种 脉内再循环 学说认为植物可以将维管束内将木质 部汁液中多余的n a 通过韧皮部向下运输到根中 以此来解释木质部不断向上运输盐分而地 上部盐分较少的现象 拟南芥s a s l 突变体的发现与鉴定为这一理论提供了新的解释 n u b l a t 等人在拟南芥中发现一个命名为s a s l s o d i u mo v e r a c c u m u l a t i o ni ns h o o t 的突变体 1 5 发现 与野生型相比 s a s l 在地上部分积累更多的n a 而不在根中积累 为了区分该突变体是在 细胞水平上吸收了更多的n a 还是缺乏细胞间转动能力 他们将s a s l 的离体叶片或愈伤组织 培养在含盐的培养基中 结果发现在这种情况下 s a s l 突变体与野生型在盐积累方面并没有 差别 说明该突变体在细胞水平上n a 十的吸收与野生型相同 但影响了n a 从根系向地上部 分的运输 根据推测 s a s l 突变体可能影响了盐分在从根系到地上部分运输过程中在木质部 与周围组织间的径向转移 该性状定位于拟南芥3 号染色体的下端 距离分子标记a f c 约 0 6 c m n g a 6 约2 6 c m 的位置 但遗憾的是 迄今为止 并没有控制该性状的相关基因克隆 和被鉴定出来 s o s l 也在木质部对水盐的长距离运输中发挥作用 施华中等人研究s o s l 在拟南芥中的 组织特异性表达 发现s o s l 主要表达在维管束与周围组织的边界区域 i 2 植物的盐害 盐渍土壤通常以钠盐 钙盐和 或镁盐为主 但是除了c 4 植物以外 大多数植物并不需 要钠 尤其是对绝大多数农作物来说 土壤中钠含量太高会对其产生毒害作用 盐渍环境中 n a 离子过多 会影响植物特别是甜土植物从种子萌发到生长发育等多个生理过程 n a 离子 毒害表现为 抑制根的伸长 增加根冠比 使过多的n a 离子运输到地上部 引起叶子受伤 害 生长率及产量降低甚至造成植株死亡 1 7 1 8 1 9 n a 离子这种毒害作用主要因为n a 离子对 植物代谢施加渗透胁迫及离子胁迫及其造成的一系列次级胁迫如营养失衡和过氧化胁迫等 严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态 造成植物细胞分子损 伤 生长减缓甚至死亡 2 1 渗透胁迫 植物需要维持内部水势低于外界土壤的水势 以维持膨压 保证水分吸收和持续生 长 因此随着外界环境中渗透压升高伴随而来的是根部首先受到渗透胁迫伤害 植物生长在 盐渍环境叶 会造成吸水困难 或根本不能吸水 甚至排水 从而导致生理干旱 膨压降 低 生长下降 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 渗透胁迫也发生在叶质外体 质外体过高的n a 离子引起细胞失 水 膨压降低 细胞渗透失水影响膜 超分子结构 扰乱细胞正常活动 甚至引起死亡 山东师范大学硕士学位论文 2 2 离子胁迫 盐胁迫降低钾钠比 提高钠含量 这对植物极为不利 钠离子和钾离子具有相似的离子 半径 质外体中过多的钠离子会取代钾离子 干扰钾离子功能 破坏细胞壁和细胞膜结构的 稳定性 细胞膜的去极化 钙离子浓度的降低破坏了k n a 选择性 使大量n a 进入细胞 k 渗漏出胞 2 5 2 6 2 7 l k 是细胞内5 0 多种酶的激活剂 n a 水合离子半径与k 十相似 当n a 浓 度超过1 0 0 m m o l l 就会竞争k 结合位点 破坏胞质内多种酶促过程 即使是盐生植物 其 胞质中的酶类对n a 也是敏感的 这与甜土植物类似 蛋白质合成也需要高浓度的k 它在 t r n a 与核糖体的结合以及核糖体其他方面的功能中发挥作用 高n a 高n a 十瓜 抑制蛋白 质的合成 这可能是n a 毒害的重要原因 n a 还能破坏微丝 微管 核糖体等 抑制细胞分 裂和生长 加速叶片衰老 降低光和面积 从而降低光合效率 植物生长和产量 有时甚至 导致死亡 2 8 2 9 钠离子可以通过多种离子通道与转运体进入植物细胞 在植物吸收钾离子的同时 如果 环境中存在较多的n a 植物细胞通常会不可避免地吸收部分n a 如通过各种钾转运体与 阳离予通道 植物细胞可能并不具备特异性的n a 十受体 也没有专一性响应n a 的信号传导 过程 植物对n a 毒害所作出的反应可能是植物细胞内k n r 失调后代谢紊乱后的综合反 应 除了造成渗透胁迫和离子毒害 高盐还会产生次级胁迫 高浓度的n a 削弱k c a 2 的 利用 可使植物中k c a 2 缺乏 进而影响植物生长和产量 3 0 3 1 1 盐胁迫还会造成毒性化合 物的积累 比如活性氧 r o s 的产生 在正常情况下 r o s 是由正常的细胞活动产生 但 是生物及非生物胁迫却大大提高了r o s 的水平 活性氧对细胞膜 膜结构 超分子产生伤 害 尤其是对线粒体 叶绿体中膜脂 酶和d n a 的伤害 因此严重影响植物的生长和生存 3 2 综上所述 高盐胁迫引起渗透胁迫和离子毒害以及由此产生营养亏缺 氧化胁迫 造成 分子损伤 生长停滞甚至死亡 因此 植物获得耐盐性的一个重要策略是在新的胁迫环境下 重建植物体的稳态 包括重建离子稳态和渗透稳态 另外还需减弱伤害 恢复生长 3 离子稳态的重建及其调控机制 高盐环境可打破植物细胞的离子稳态 即主要由n a c l 引起的盐胁迫不仅破坏了植物细 胞中业已形成的n a c 1 平衡状态 而且也影响k 和c a 2 的胞内分布 越来越多的研究结 山东师范大学硕士学位论文 果表明 在盐胁迫环境中 植物获得耐盐能力的一个重要策略是建立新的离子稳态 离子稳 态包括离子的吸收 区隔化 外排和长距离转运 朱健康及其合作者从拟南芥中确定了与控制离子稳态及耐盐性有关的胁迫信号传导通路 中的三个成分 s o s l s o s 2 s o s 3 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 s o s 信号通路在调控离子均衡和植物耐盐性中发挥重要作用 3 8 3 9 这个信号通路与酵母 中的c a l c i n e u r i n 通路 调控穿过质膜的n a 外流 存在功能相似之处 4 0 1 在酵母或植物 中 表达具有活性的c a l c i n e u t i n 能提高它们的耐盐性 更加证实c a l c i n e u r i n 与s o s 通路在 功能上的相似之处h 1 4 2 s o s 通路已经从遗传 分子及生化方面进行了分析 4 3 1 对s o j 突变 体n a l i 敏感性进行遗传分析发现 s o s l s o s 2 s o s 3 位点位于同一通路并且s o s l 对后 两个基因是上位的 应处于通路的最下游 4 4 1 这些s o s 突变体在含微摩尔k 和c a 2 培养基 上出现缺k 症状 当外界补充毫摩尔c a 时 能缓解s o s 2 和s o s 3 突变体中n a k 含量低 的现象 s o s l 表现出高渗敏感 而s o s 2 和s o s 3 不表现高渗敏感 这些现象充分表明s o s 信 号通路调控n a 和k 稳态并且此通路被c a 2 活化 该通路的框架表述如下 图2 4 5 4 6 1 h 图2s o s 信号通路调控的离子均衡 如n a 十 k 引自z h uj k 2 0 0 2 外部n a 胁迫引发c 2 信号 激活s o s 3 一s o s 2 蛋白激酶复合物 该复合物激活s o s l 的 n a h 交换活性并在转录及转录后水平调控某些基因的表达 s o s 3 一s o s 2 也激活或抑制盐胁 迫下离子均衡中其它的转运体的活性 如液泡的h a t p a s e s h p p a s e n a h 交换器 质 膜的k n a 转运体 f i g 2r e g u l a t i o no fi o n e g n a 十a n dk h o m e o s t a s i sb yt h es o sp a t h w a y h i g hn a 十s t r e s si n i t i a t e sac a l c i u ms i g n a lt h a ta c t i v a t e st h es o s 3 s o s 2p r o t e i nk i n a s e c o m p l e x w h i c ht h e ns t i m u l a t e st h en a i i e x c h a n g ea c t i v i t yo fs o s 1a n dr e g u l a t e s 山东师范大学硕士学位论文 t r a n s c r i p t i o n a l l ya n dp o s t t r a n s e r i p t i o n a l l y t h ee x p r e s s i o no fs o m eg e n e s s o s 3 一s o s 2m a ya l s o s t i m u l a t eo rs u p p r e s st h ea c t i v i t i e so f o t h e rt r a n s p o r t e r si n v o l v e di ni o nh o m e o s t a s i su n d e rs a l t s t r e s s s u c ha sv a c u o l a rh 十一a t p a s e sa n dp y r o p h o s p h a t a s e s p p a s e v a c u o l a rn a h e x c h a n g e r n h x a n dp l a s m am e m b r a n ek m a dn gt r a n s p o r t e r s 盐胁迫引发胞内c a 2 信号 4 7 1 然而此c a 2 十信号与由干旱 冷害及其它刺激所产生的信 号不同 由s o s 3 编码的一个豆蔻酰化的c a 2 结合蛋白可能感知c a 2 信号并将此信号传给下 游反应 1 s o s 3 激活s o s 2 并与之相互作用 s o s 2 是一个丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶 4 9 5 0 s o s 2 及s o s 3 调控s o s l 的表达水平 s o s l 的转运活性的激活需要s o s 2 及s o s 3 的相互 作用 它自身只能轻微增加缺失所有内源n a a t p a s e 和n a 十 h 逆向转运蛋白的酵母突变体 的耐盐性 而s o s 3 s o s 2 及s o s l 的协同表达 能显著增强该酵母突变体的耐盐性i5 1 1 一 个组成型激活的s o s 2 突变体的表达也能增加s o s l 在酵母突变体中的耐盐性 这表明s o s 2 激酶活性对s o s l 激活是必须的 在一个互补实验中 5 2 q i u 等表明 s o s 2 激酶组成性激活 能增强来自于野生型而不是s o s l 突变体植物纯化的质膜微囊的n a w 交换活性 在s o s 2 2 s o s 3 一 突变体中 质膜n a h 交换的活性非常低 但是 在体外将激活的s o s 2 加入制 备的膜囊泡中也能使其恢复至接近于野生型的水平 4 引 s o s 3 是e f 手型c a 2 结合蛋白的新的亚家蒯53 1 这些蛋白与钙调磷酸酶 c a l c i l l e 嘶n 2 b 型蛋白磷酸酶 的b 亚基及动物神经传感器有高的序列相似性 与钙调蛋白 c a l m o d u l i n 或钙牵蛋白 c a l t r a c t i n 相比 钙调磷酸酶预测有3 个e f 一臂 以低亲和力 结合c a 2 5 这些蛋白家族中仅某些成员包含一个n 端豆蔻酰化的基序 m o t i f s o s 3 豆蔻酰化 帮助将s o s 3 及与它相互作用的蛋白 如s o s 2 定位于膜上 因为 它们的目 标转运蛋白 如s o s l 定位于膜上 然而 在植物细胞中并不是所有s o s 3 蛋白与膜相关 联 这与s o s 3 一s o s 2 复合物能以无膜结合的蛋白为靶目标一致 除与s o s 2 相互作用在耐 盐中发挥作用外 s o s 3 也可与其它一些蛋白包括s o s 2 一类似的蛋白 如p k s 蛋白激酶 s 相互作用 与s o s 3 类似的蛋白 如s c a b p s s o s 3 类似的c a 2 结合蛋白 特异性地与 某些p k s 蛋白相互作用 形成特定的蛋白激酶复合物 调控由其它刺激而引起的c a 2 信 号 在植物中s o s 3 作为耐盐决定子需要c a 2 的结合以及n 末端豆蔻酰化 s o s 2 也代表目前仅在植物中发现的一类新的蛋白家族 p k s 它编码4 4 6 个氨基酸 的丝氨酸 苏氨酸激酶 s o s 2n 一末端有一个2 6 7 个氨基酸形成的催化结构域 d o m a i n 这 一结构域与酵母s n f l 蔗糖非发酵s u c r o s en o n f e r m e n t i n g 激酶 以及哺乳动物a m p k a m p 一活化的蛋白激酶 序列有高度相似性 c 一末端含有一个独特的与s o s 3 相互作用的 山东师范大学硕士学位论文 调控域 s o s 2 的调控域及催化域相互作用使该酶在底物磷酸化时失去活性 其机理可能是 阻止底物接近催化位点 s o s 3 结合在调控区似乎破坏s o s 2 内部分子的相互作用 因此开 放催化位点 图3 一系列的缺失分析表明 在s o s 2 调控域的一个2 1 个氨基酸序列 例 如f i s l 基序 保守的氨基酸残基 对于s o s 3 的结合是必须的 缺失整个s o s 2 调控域或仅 f i s l 基序 1 可导致该酶的组成型激活 在s o s 2 及s o s 3 突变体植物中以c a m v 3 5 s 启动子组 成型表达s o s 2 在突变体植株的茎中能恢复盐敏感表型 然而奇怪的是 在根中却不行 5 6 这表明s o s 2 激酶活性是其发挥耐盐作用所必需的 至少在茎中是必需的 图3 由s o s 3 c a 2 结合的蛋白 激活s o s 2 蛋白激酶 引自z h uj k 2 0 0 2 a 在缺失活化的s o s 3 的情况下 由c 末端与激酶域通过f i s l 基序相互作用抑制s o s 2 蛋白激酶的活性 b 与c a 2 结合后 s o s 3 具有活性 与f i s l 基序相互作用 解除了对 s o s 2 蛋白激酶活性的抑制 使底物易于结合到s o s 2 激酶域 通过蛋白磷酸化 s o s 2 调控 离子转运体的活性并在盐胁迫下维持离子的均衡 通过豆蔻酰化 s o s 3 可帮助s o s 2 到特 定的膜位置 未显示 对