（食品科学专业论文）大豆蛋白酶解产物中的糖肽及其对小鼠脾细胞增殖效果的研究.pdf

中因农业人学硕士学位论文 摘要 摘要 从二十世纪七十年代以来，大豆肽就逐渐成为蛋白质研究和利i | = j 领域的热点之一。研究发现 大豆肽具有降胆吲醇、抗氧化、降血压、减肥、抗疲劳等生理功能，但对于大豆糖肽生理活性的 研究至今尚未见报道。本论文以大豆糖蛋白s 一伴大豆球蛋白为底物，用酶法制各大豆糖肽， 通过细胞培养的方法研究糖肽对小鼠脾细胞增殖的影响作用，并探讨糖链在此功能中所起的作 用。 利用a l c a l a s e 和p r o n a s ee 酶解分别制备大豆肽，肽产物经过s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤分组， 通过糖在各组分中的分布及薄板层析对含糖的肽组分是否是糖肽进行鉴定。所得糖肽经过糖苷酶 ( n g l y c o s i d a s ef ) 酶解后，利用s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤获得去除糖链后的肽组分。利用 m t s p m s 比色法测定糖肽对小鼠脾细胞增殖的作用效果。 研究结果表明，以b 一伴大豆球蛋白为底物分别经a l c a l a s e 和p r o n a s e e 酶解，分离出两种平 均分子量为1 6 7 0 d a 和1 1 3 5 d a 的糖肽，含糖量分别为8 2 3 和9 6 6 。这两种糖肽对c o n a 诱导 的脾细胞增殖有抑制作用，而且在浓度为5 0 1 0 0ug m l 时抑制效果显著，能抑制c o n a 诱导活性 的4 0 5 0 。当用n g l y c o s i d a s e f 去除两种糖肽中的糖链后，a l e a l a s e 酶解物中的糖肽抑制活性 减弱而p r o n a s ee 酶解物中的糖肽活性不受影响。另一方面，在无c o n a 存在的条件下，两种 大豆糖肽对脾细胞表现出增殖促进作用。以上结果说明大豆糖肽对免疫功能有双向调节的作用。 关键词：大豆蛋白，酶解，糖肽，增殖，免疫调节 中国农业大学硕士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t s o yp e p t i d e sh a v eb e e no n eo ff o c u s e si nt h er e s e a r c ha n du t i l i t yo fp r o t e i ns i n c e 】9 7 0 s s t u d i e s s h o w e dt h a t s o yp e p t i d e s h a v e m a n yb i o l o g i c a l f u n c t i o n s ，s u c h a s h y p o c h o l e s t e r o la c t i v i t y ， a n t i o x i d a t i v i t y , h y p o t e n s i v ea c t i v i t y , c o n t r o lo fo b e s i t ya n df a t i g u ea n ds oo n b u tt h e r ei sn or e p o r t a b o u tt h eb i o l o g i c a l a c t i v i t yo fs o yg l y c o p e p t i d e s t h eo b j e c t i v e o ft h e s t u d yw a st oo b t a i ns o y g l y c o p e p t i d e s f r o m 1 5 - c o n g l y c i n i nh y d r o l y d a t e s a n dt oc o n f i r me f f e c t so fg l y c o p e p t i d e so nt h e p r o l i f e r a t i o no f m u r i n es p l e n o c y t e sb yt h em e t h o do fc e l li n c u b a t i o ni nv i t r o i na d d i t i o n ，t h er o l eo f c a r b o h y d r a t ec h a i n si nt h ee f f e c tw a s a l s oi n v e s t i g a t e d a l c a l a s ea n dp r o n a s eew e r eu s e dt oh y d r o l y z eb - - c o n g l y c i n i nt op r e p a r es o yp e p t i d e s a f t e r i s o l a t e df r o ms o yp e p t i d a sb ys e p h a d e xg 2 5 ，c a r b o h y d r a t e - c o n t a i n i n gp e p t i d e sw e r ep o o l e d ，a n d i d e n t i f i e dt h ec a r b o h y d r a t e - p e p t i d el i n k a g eb yt h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y s o yg l y c o p e p t i d e sw e r e t r e a t e dw i t h n - g l y c o s i d a s efa n d t h e n a p p l i e d t o s e p h a d e xg - 2 5 t oo b t a i np e p t i d e sw i t h o u t c a r b o h y d r a t e m t s p m s c o l o r i m e t r i c a s s a y w a su s e dt od e t e r m i n et h ep r o l i f e r a t i o no fm u r i n e s p l e n o c y t e s i nw h i c h a b s o r b a n c ea t4 9 2 n mw a sc o n s i s t e n tw i t ht h eh u m h e ro f c e l l s i nt h es t u d yt w ok i n d so fs o yg l y c o p e p f i d e sw e r ei s o l a t e df r o mh y d r o l y s a t e s ，w i t ha v e r a g e m o l e c u l a rw e i g h to f1 6 7 0 d aa n d1 1 3 5 d a t h ec a r b o h y d r a t ec o n t e n to f t w og l y c o p e p t i d e sw a s82 3 a n d 9 6 6 r e s p e c t i v e l y b o t h o fs o yg l y c o p e p t i d e sh a di n h i b i t o r ye f f e c t s o nc o n a 。s t i m u l a t e d p r o l i f e r a t i o no fm u r i n es p l e n o c y t e s t h ed e g r e e o fi n h i b i t o r ye f f e c to nc o n a s t i m u l a t e da c t i v i t y r e a c h e dt o4 0 - - 5 0 a tc o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o m5 0 - 1 0 0 l jg d m l w h e ne a r b o h y & a t ec h a i n si n g l y c o p e p t i d e sw e r e r e m o v e dw i t hn g l y c o s i d a s ef t h ei n h i b i t o r ye f f e c to fg l y c o p e p t i d ed e r i v e df r o m a l c a l a s eh y d r o l y s a t ed e c r e a s e d ，b u tt h a to fg l y c o p e p t i d ef r o mp r o n a s eeh y d r o l y s a t ec h a n g e dl i t t l e o nt h eo t h e rh a n d b o t ho fg l y c o p e p t i d e ss h o w e dp r o m o t i n ge f f e c t s o np r o l i f e r a t i o no fm u r i n e s p l e n o e y t e s i nt h ea b s e n c eo fc o n a t h er e s u l t s s h o w e dt h a t s o yg l y c o p e p t i d e s h a v e i m m u n o m o d u l a t o r y e f f e c tf r o mt w oa s p e c t s k e y w o r d s ：s o yp r o t e i n ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，g l y c o p e p t i d e s ，p r o l i f e r a t i o n ，i m m u n o m o d u l a t o r y i i 独创性声明 p s s s 7 7 7 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 说磅格 时间： a ”j 年5 月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： j 强鹰斗墨时间：。嘭年石月同 翩躲都m 砭冬 帆沁 年细，日 ) 一 中困农业大学硕士学位论文 第章绪论 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 蛋白质是生命活动的基础，过去人们一直认为蛋白质是在完全分解成氨基酸后被人体吸收 利用的。但是自n e w e y 和s m i t h 报道了蛋白质的一部分以二肮或三胶的形式吸收以来，现已明 确蛋白质经酶水解后得到的肽产物不仅具有与原蛋白不同的物理化学特性，如乳化性、起泡性、 广泛p hf 的溶解性等，而且更重要的是，肽因其分子量、氨基酸组成以及含有其它基团的不 同而表现出不同的营养特性和生理活性。如肽与同组成的氢基酸或蛋白质相比具有吸收速度快 的特点，并且许多食物源肽具有降血压、降血糖、抗疲劳、降低胆固醇等生理活性。 在膳食蛋白中，糖蛋白占有相当的比例，如牛乳、大豆、玉米、甘薯等食物中均舍有一定 量的糖蛋白。糖蛋白在人体内经消化产生的含糖寡肽即糖肽或在蛋白质水解产物中的糖肽具有 怎样的营养功能和生理活性，这在蛋白质和肽的研究、开发利用实践中是很有普遍性的问题。 然而在营养学和食品科学上有关糖肽的研究报道还很少，尤其是大豆蛋白水解产物中的糖肽， 还尚未引起人们足够的重视。 本课题着眼于大豆中的糖蛋白b 一伴大豆球蛋白，用酶法制备大豆糖肽，通过体外细胞 培养的方法研究大豆糖肽对小鼠脾细胞增殖的作用，明确大豆糖肽的免疫调节功能。探讨糖肤 在人们的营养和生理功能上的有利性和不利性及其影响因素，从而为食物源糖肽的开发、生产 和利用提供理论依据。这一研究不仅对完善食物蛋白源肽的营养理论而且对食品、保健营养 品的开发和提高蛋白质、肽的科学利用水平以及生产技术创新有重要的指导意义。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 肽在动物体内的吸收 蛋白质作为机体所需的重要营养素之一，一直以来倍受研究者的关注。传统的代谢理论认 为：人或动物体对蛋白质的需要即是对必需氨基酸和合成非必需氮基酸的需要，蛋白质必须水 解成为游离氪基酸后才能被吸收利用。因此，长期以来，人们认为机体所需要的氮源是以游离 氨基酸为主要的吸收形式。但是营养学研究表明，动物对不同来源的氨基酸在利用率上存在筹 异，而且按照理想模式配制的氨基酸混合物并不能使动物达到最佳的生长状态。因此t 一些学 者提出了动物体可能对蛋白质经水解后的肽有特殊吸收作用的能力。直到1 9 6 0 年，n e w a y 和 s m i t h 在兔反转小肠浆膜侧应用二肽g l y o l y 进行实验，从肠道静脉中检测到g l y - g l y 的存在， 而且用其它几种肽进行研究，结果也发现寡肽在肠道壁的转运，且寡肽在肠道中的吸收速率为： 三肽 二肽 游离氨基酸( a d i b i ，1 9 7 6 ) ，从而证实了肽可以被完整地转运吸收。s i l k ( 1 9 8 6 ) 也提 出肽作为蛋白质的主要消化产物，是肠道中氨基酸的一种重要吸收形式。同时其他研究表明 蛋白质被动物摄入后，经消化道中一系列酶的作用，降解为游离氨基酸和小肽，其中小肽在小 中国农业大学碗上学位论文 笫一章绪论 肠绒毛膜刷状缘受到氨肽酶a 利氨肽酶n 的作用，最终以游离氨基酸和寡肽的形式存在，它们 以完整的形式被吸收进入循环系统而被组织利用。可见除了游离氨基酸外，寡肽( 尤其是一 肽和三肽) 也能被机体直接吸收。 不但如此，寡肽的吸收具有速度快、耗能低、不易饱和、各肽之间转运无竞争- | 生或抑制性 等特点，而且动物体对肽中氨基酸的吸收比对游离氨基酸的吸收更迅速，这一点已被大量的实 验所证实：大鼠对酪蛋白、自蛋自在溶菌酶作用下的水解产物和对乳清蛋白在胰蛋白酶作用下 的水解产物的吸收率都高于相应的游离氨基酸混合物的吸收率( s i l k ，1 9 8 0 ) 。h a r a 等( 1 9 8 4 ) 的 研究结果表明，大鼠对蛋白质酶解产物中肽链上氪基酸残基的吸收强度比相应的游离氨基酸高 7 0 8 0 。施用晖等( 1 9 9 6 ) 在研究不同比例小肽与游离氨基酸对鸡体内氨基酸吸收的影响的过 程中发现，鸡对寡肽中大多数氨基酸残基的吸收比相应的游离氨基酸迅速，强度高，而在鼠、 猪等的消化吸收实验中也表明寡肽比游离氨基酸更易吸收。可见，肽尤其是寡肽不但能够被机 体吸收，并且其吸收速率高于游离氨基酸( h a r a e ta 1 ，1 9 8 4 ：s i l k ，1 9 8 0 ) 。 随着蛋白质营养理论研究的深入人们对肽和氨基酸吸收机制有了进一步的认识。研究发 现，肽也能在肠道中被直接吸收，这是因为肠道中存在一个和氢基酸转运体系完全不同的多肽 转运体系。氨基酸和寡肽都是通过主动运输进入机体，但是驱动力有所差异。氨基酸的吸收是 因为n a + 梯度的存在( v i n c e n z i n ie t a l ，1 9 8 9 ) ，而寡肽转运体系则是因为h + 和c 矿为驱动力之故 ( w e b b 1 9 9 0 ；w e b be la l ，1 9 9 3 ) ，该体系能直接将小分子肽转运至小肠粘膜的内皮细胞内而迅 速被吸收，吸收效果优于一般蛋白质和游离氨基酸。而且肽与游离氨基酸在动物体内的吸收机 制相互独立( r u b i n o e ta 1 ，1 9 7 1 ) ，二者互不干扰，减轻了由于游离氨基酸相互竞争共同吸收位点 产生的吸收抑制，进而促进动物体内蛋白质的代谢。 营养学研究已明确，肽类在营养方面优于氨基酸和蛋白质主要表现在以下几个方面：与游 离氨基酸相比，寡肽更易于通过肠壁转运。且吸收速度快于游离氨基酸：寡肽比游离氨基酸渗 透压低；寡肽的抗原性比多肽或蛋白质的抗原性低( 王志军等，2 0 0 1 ) 。基于以上的吸收特点， 肽类可以为有特殊饮食需要的患者提供重要的营养补充，是机体对氨基酸吸收的一种重要途径。 1 2 2 肽链结构和组成与肽的生理功能 近年来，利用膳食蛋白开发各种肽类食品已经成为蛋白质加工利用研究宴勺热点之一。研究 表明，膳食蛋白经酶水解后的肽，除了作为氮源补充人体对氨基酸的需求外，还具有多种不同 的生理活性，如降血脂、降血压、降胆固醇、免疫调节、促进微量元素的输送和吸收、促进生 长及调节神经活性等。而且研究还发现，膳食蛋白源肽的这些生理功能与其结构和组成有很大 的关系。 抗氧化肽存在于多种膳食蛋白中，如大豆蛋白、小麦蛋白、酵母蛋白等。c h e n 等( 1 9 9 5 1 9 9 8 ) 用多种蛋白酶对大豆蛋白进行酶解，得到6 种具有抗亚麻酸过氧化的抗氧化肽，对所得抗氧化 肽的序列研究后发现，这些肽段中均含有脯氨酸( p r o ) 和组氨酸( h i s ) 。在对抗氧化肽 l e u - l e u - p r o - h i s h i s 的抗氧化性分析的过程中发现，当除去c 一末端的h i s 时，该肽段的抗氧化 性减弱，而且肽链中的p r o 的存在与否也影响着肽段的抗氧化性，但当除去n - 末端的亮氨酸( l e u ) 后。抗氧化性并不受到影响，可见在大豆抗氧化肽中，p r o 和h i s 存在与否与抗氧化性的强弱 2 中国农业火学硼l 士学位论文 第一章绪论 有密切的关系。对大豆肽抗氧化性的体外研究发现，大豆肽具有的对o h 的清除作用，在很 火程度上是由于具有提供氢质子的能力使具有高度氧化性的自由基还原，从而起到清除或抑 制自由基的目的，表现出抗氧化活性( 荣建华等，2 0 0 2 ) 。此外，犬豆蛋白的赖氨酸( l 、，s ) 含 量相对比较高，促使赖氨酸的侧链基团e 氨基和还原糖发生非酶褐变反应( 即美拉德反应) ， 由此产生的反应产物具有很强的抗氧化性( 沈培英，1 9 9 6 ) 。来源子脊椎动物骨骼肌的肌肽( b 丙酰胺。组氮酸) 是一种水溶性内源性二肽，它在多个体系中可抑制脂质过氧化，这是由于肌 肽分子中含有咪唑基能够鏊合金属离子，特别是具有氧化能力的铜离子( d e c k e re l a l ，1 9 9 1 ) ： 而且肌肽分子侧链上的组氨酸残基可以作为氢的受体，具有捕捉羟基自由基、单质氧和过氧化 自由基的作用，可以抑制非金属离子引起的脂肪氧化作用，然而游离的1 3 丙酰胺和组氨酸却没 有显著的抗氧化功能( 赵赣等2 0 0 0 ) 。谷胱甘肽( g s h ) 是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通过 肽键缩合而成的三肽化合物，其结构中含有一个活泼的巯基( s h ) ，易被氧化脱氢，因而g s h 具有抗氧化性，清除自由基，使生物大分子、生物膜免受损害( 石岗，2 0 0 2 , 程时等，2 0 0 2 ) 。 可见，肽的抗氧化功能与肽链的氨基酸组成和肽链上其它特殊基团的存在有关。 血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 是引起高血压的主要因素。a c e 作用于血管紧张素i ，除去其c 末端的h i s l e u 而生成的血管紧张素i i 是肾素一血管紧张素系统 中已知的最强血管收缩剂，作用于小动脉，使血管平滑肌收缩，引起血压迅速升高：同时，a c e 也使激肽释放酶激肽系统中的舒缓激肽丧失c 一末端的p h e - a r g 或s e v p r o 而失去降压效果，也 引起血压升高( 吴建平等，1 9 9 8 ) 。可见，降血压的本质也就是抑制a c e 的活性，使血管紧张 素l i 的生成和舒缓激肽的破坏减少，血压下降，从而达到治疗高血压的目的。最早针对a c e 开发的膳食蛋白肽是a c e l 肽( o s h i m ae la 1 ，1 9 7 9 ) ，a c e ! 肽是明胶经细菌胶原酶降解后的产 物，具有抑制活性的部分在1 5 0 0 d a 以下。1 9 8 2 年m a r u y a m a s 等从牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水 解产物中分离出具有a c e 抑制活性的1 2 肽，对自发性高血压大鼠( s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s i v e r a t s ，s h r ) 有显著的降压作用。随后m a r u y a m a s 等又从口s 1 - 酪蛋白中获得一种抑制a c e 活性 的6 肽，并提出了膳食蛋白源中确实存在某些具有a c e 抑制活性的特定氨基酸序列。研究发现， 其他膳食蛋白源如磷虾、沙丁鱼、玉米、大豆、酪蛋白( s e k i e t a l ，1 9 9 6 ；h i t o y u k ie t a l ，2 0 0 2 ) 、 卵清蛋白( f u j i t a e ta l ，2 0 0 2 ) 等中均有a c e 抑制肽的存在。对这些肽结构与a c e 抑制活性关 系的研究表明，a c e 抑制肽的c 一末端均有p r o 、p h e 、t y r 或疏水氨基酸的存在，而且对于二肽 而言n 末端的芳香族氨基酸与a c e 的结合最有效( k o h m u r ae ta l ，1 9 8 9 ) 。许多从酪蛋白、醇 溶蛋白、胶原蛋白、鱼爵蛋白中获得的a c e 抑制肽至少都含有一个脯氨酸( p r o ) ，如从酪蛋白 中获得的a c e 抑制肽中，c 末端含有a l a - p r o 序列的a c e l 5 比不含p r o 的a c e l 2 具有更强的 抑制活性 5 8 掌 4 0 01 02 0 3 04 05 06 07 08 09 01 0 0 时闻( r a i n ) 01 0 2 03 0柏s 0 6 07 08 09 0 1 0 0 时旧( r a i n ) 1 6 1 2 ； s8 h 脚 4 0 01 02 0 3 04 05 0b 07 08 0 9 01 0 0 时闻( r a i n ) 图2 - 6 产物ac a ) 及其组分a i ( b ) 和a i ( c ) 的r p - h p l c 图谱 f i g u r e 2 - 6 r p h p l c p a t t e r n so f h y d r o l y s a t e a ( a ) ，f r a c t i o n a l ( b ) a n d f r a c t i o n a 2 ( c ) 结果表明，b 伴大豆球蛋白经a l c a l a s e 酶解所得的肽产物a 是多种肽的混合物( 图2 - 6 a ) ， 其中a l 是保留时间o 1 0 r a i n 的亲水性部分( 图2 - 6 b ) ，a 2 为保留时间1 0 , q s 0 m i n 的疏水性部分( 图 2 - 6 c ) 。 以杆菌肽( m r l 4 5 0 d a ) 、n a d ( m r 6 6 3 4 d a ) 和半胱氨酸( m r 3 3 7d a ) 为分子量标准物质t 经s e p h a d e x g 一2 5 凝胶过滤后得到l g m w - k a 标准曲线1 ，如图2 - 7 。 1 o8 o6 蟹 0 4 0 2 0 图2 - 7s e p h a d e xg - 2 5 凝胶过滤分子量标准曲线1 f i g u r e2 - 7 f i r s ts t a n d a r dc u l v ! o f m o l e c u l a rw e i g h ta n a l y z e db ys e p h a d e xg - 2 5 通过分子量标准曲线1 ，对a l c a l a s e 水解产物中两种组分a 1 和a 2 的平均分子量进行了推 算，结果见表2 - 2 。 6 中国农业人学硕十学位论文 第二章大豆蛋白酶解产物中台糖肚纽分的分离牦定 表2 - 2 产物a 中各组分的平均分子量和古糖量 t a b l e2 - 2a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t sa n dc a r b o h y d r a t ec o n c e n t r a t i o n so ff r a c t i o na 】a n df r a c t i o na 2 图2 - 5 和表2 2 的结果表明，a 2 是多种低分子量的二、三肽和游离氨基酸的混合物，而a 是由平均分子量低于1 5 个氨基酸构成的糖肤、具有相同分子量的糖与胨的混合物。 同样，对b - 伴大豆球蛋白经p r o n a s ee 酶解所得的肽产物p 避行了s e 曲a d e xg 一2 5 凝胶过 滤，结果如图2 - 8 。 善 癸 篓； 垂 薯 4 65 56 47 3b 29 11 0 01 0 91 1 8 洗脱时阃( 5 m i n ) e l u t i o nt i m e s m i n ) 图2 - 8 产物p 经s e p h a d e xg - 2 5 凝胶过滤的图谱 f i g u r e 2 - 8 g e lc h r e m a t e g r a p h y p r o f i l ee f h y d r e l y s a t e p o n s e p h a d e x g - 2 5 o o 茎 耋 三 u o 篓 躯 在图2 - 8 中，产物p 被分离为三个主要部分，分别是洗脱峰时间为2 6 0 m i n 的p l 、洗脱峰 时间为4 5 5 r a i n 的p 2 和洗脱峰时间为5 3 0 r a i n 的p 3 。对凝胶过滤后各组分中含糖量分析发现， 糖主要分布在p 】组分中，这一结果也表明，b 伴大豆球蛋白经p r o n a s ee 酶解后所得的肽产物 中有含糖的肽组分且主要分布在p l 组分中。经计算该含糖的肽组分约占肽产物p 总量的 3 8 1 2 。分别收集p 1 、p 2 和p 3 并冻干，并测定了各组分的含糖量，结果如表2 3 所示。 由于在对p r o n a s ee 进行凝胶过滤的过程中，柱床体积发生了变化，因此以杆菌肽 ( m r l 4 5 0 d a ) 、n a d ( m r 6 6 3 4 d a ) 和半胱氨酸( m r3 3 7 d a ) 为分子量标准物质，经s e p h a d e x g - 2 5 凝胶过滤后得到i g m w k 。标准芭线2 ，如图2 - 9 所示。 1 7 中固农业火学硕上学位论文 第二章大豆蛋白酶解产物中含糖肤组分的分离鉴定 0 8 o 06 o 。4 02 0 o 一 i g m w 图2 - 9s e p h a d e xg - 2 5 凝胶过滤分于量标准曲线2 f i g u r e2 - 9s e c o n ds t a n d a r dc u r v e o fm o l e c u l a rw e i g h ta n a l y z e db ys e p h a d e xg 一2 5 通过图2 - 9 中的标准分子量曲线2 ，结合图2 - 8 中各峰的洗脱体积，对产物p 经凝胶过滤 后各组分的平均分子量进行了推算，结果如表2 3 所示。 表2 - 3 产物p 中各组分的平均分子量和舍糖量 t a b l e2 - 3a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h ba n d c a r b o h y d r a t e c o n c e n t r a t i o n so f f r a c t i o n s i nh y d r o l y s a t e p 图2 - 8 和表2 - 3 的结果表明，p 2 主要是平均4 5 个氨基酸构成的寡肽，p 3 是二、三肽和游 离氨基酸的混合物。而p l 则是平均为1 1 个以下氨基酸构成的糖肽或具有相同分子量的糖与肽 的混合物。 、 比较表2 - 2 和表2 - 3 的结果可以看出，从8 伴大豆球蛋白分别经a l c a l a s e 和p r o n a s ce 酶解 后所得产物中分离的含糖组分，其分子量、肽链结构及糖含量都有很大差异。 2 4 4 结合性糖肽的鉴定 为了明确a l 中糖与肽链的结合，以正丁醇、丙酮、醋酸、5 氨水和水( 体积比为 4 5 ：1 ：5 ：1 ：1 ：2 1 为肽展开剂，对含糖的肽组分a l 进行了薄板层析，显色后结果如图2 - l o 。 主垦农业大学钡士学位论文 第一章大豆蛋白酶解产物中含糖胝组分的分离鉴定 a i a 2 a 3 a bc 圉2 - 1 0 组分a l 的薄板层析图谱 a 、用茚三酮氯化亚锡显色b 、用苯酚一硫酸显色 c 、用葸酮显色 展开剂：i ：f 丁醇丙酮，醋酸- 5 氨水- 水= 45 ：i 5 ：1 ：l ：2 f i g u r e2 - 1 0t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) p a t t e r no f f r a c t i o n sa l ( a ) s t a i n e db yn i n h y d r i n s t m i r o u sc h l o r i d e ，( b ) s t a i n e db yp h e n o l s u l f u r i ca c i d ，( c ) s t a i n e db ya n t hr o o e d e v e l o p i n gs o l u t i o n ：n - b u t a n o l - a c e t o n e - a c e t i ca c i d 一5 a m m o n i a w a t e r ( 45 ：11 。1 ：2 ，b yv o l u m e ) 用茚三酮。氯化亚锡肽显色剂显色结果表明( 图2 - 1 0 a ) ，a i 在该展开剂条件f 分离为三个 组分，分别为a 】、a 2 、a 3 ，其r f 值分别为07 3 、0 6 、o 4 4 ( 表2 - 4 ) 。当样品展开后用糖显色剂 苯酚硫酸或葸酮处理时，在点样原点处呈色明显，同时在薄板的上端分别有一处显色( 幽2 - 1 0 b 和c ) ，b i 和。1 ，其r f 值分别为o 6 2 和0 7 2 ( 表2 - 4 ) ，分别与图谱a 中a 2 和a l 的r f 值相近， 这一结果表明a ，和a 2 是糖结合性肽，即糖肽。但在原点处有明显的糖显色，而无肽的显色，说 明组分a ；中也有游离糖存在。 表2 - 4a 1 和p l 的层析图谱中各组分的迁移率 t a b l e2 - 4 m o b i l i t i e so f f r a c t i o n so f a ta n d p i i n t l cp a t t e r n s 1 9 可见，从b 一伴大豆球蛋白经a l c a l a s e 酶解后所得的肽产物a 中分离的含糖组分a 含有糖 结合性肽( c a r b o h y d r a t e ，b i n d i n gp e p t i d e a ) ，在本研究中将其命名为c b p a 。 按照上述方法，对从产物p 中分离出的含糖组分p 。中的糖和肽链的结合性进行分析，如图 2 - 1 】所示。 a l a 2 ab 图2 ，1 1 组分b 的薄板层折图谱 a 、用茚三酮- 氯化亚锡显色b 、用苯酚- 硫酸显色 展开剂：正丁醇丙酮醋酸一5 氨水- 水= 4 5 ：i5 ：l ：1 ：2 f i g u r e2 - i it h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l ap a t t e r no ff r a c t i o np t ( a ) s t a i n e db yn i n h y d r i n - s t a n n o u sc h l o r i d e ，( b ) s t a i n e db yp h e n o l s u l f u r i ca c i d d e v e l o p i n gs o l u t i o n ：n b u t a n o l - a c e t o n e a c e t i ca c i d - 5 a m m o n a - w a t e r ( 45 ：l ：1 1 2 ，b yv o l u m e ) 组分p l 经肽展开剂展开，用茚三酮氯化_ = ：锡和苯酚搞i 酸显色后，在a l ( 图2 - 1 1 a ) 处出 现肽显色斑点，同时b l ( 图2 - l l b ) 处也出现糖显色，二者的r f 分别为0 2 2 和0 2 1 7 ( 表2 - 4 ) 。 可见组分p ，在薄板层析中肽和糖的迁移速率基本一致。另一方面，在点样原点及其它部 7 没有 糖显色，这表明组分p i 几乎无游离糖，且糖与肽结合在一起，即组分p 1 是糖结合性肽 ( c a r b o h y d r a t e b i n d i n gp e p t i d ep ) ，在此命名为c b p p 。 2 4 5 糖肽中糖链的去除效果 以0 伴大豆球蛋白为底物获得的糖肽组分c b p a 和c b p - p ，其糖链的结合性应与b 一伴 人豆球蛋白致，即以n 乙酰葡糖胺一天冬酰胺的形式与肽链相连接( k o s h i y a m ae f a l ，1 9 6 6 ) 。 用具专一性水解n 乙酰葡糖胺天冬酰胺之间连接的糖营酶( n - g | y c o s i d a s ef ) 分别作h j 于 c b p a 和c b p - p 组分后，将产物又经s e p h a d e xg - 2 5 凝胶过滤进行分析，结果如幽2 - 1 2 雨i2 - 1 3 所示。 主壁! 垒些_ 人学坝：l 学位论文 第二章大豆蛋白酶解产物中台糖肚组分的分离鉴定 11 01 92 83 74 65 56 47 38 29 11 0 0 1 0 91 1 8 洗脱时间( x 5 m i n ) e l u t i o nt i m e ( 5 s i n ) 图2 - 1 2c b p - a 经n - g l y c o s i d a s ef 酶解后产物的s e p h a d e xg - 2 5 凝胶过滤图谱 f i g u r e2 - 1 2g e lc h r o m a t o g r a p h yp r o f i l eo f h y d r o l y s a t eo f c b p - a t r e a t e dw i t hn - g l y c o s i d a s ef o ns e p h a d e xg - 2 5 在图2 1 2 中，c b p a 经n - g l y c o s i d a s ef 酶解后的产物被分成三个组分，分别是洗脱峰时 间为2 5 5 m i n 的a g l 、洗脱峰时间为3 3 0 m i n 的a g 2 和洗脱峰时间为5 1 5 m i n 的a g 3 。从a g l 洗 脱位置来看与图2 - 5 的a l 组分比较一致，说明a g l 是未被n - g l y c o s i d a s ef 水解的a l 组分。a g 2 在a g l 峰之后，说明它是a g l 因糖苷酶作用后，分子量变小使峰位置向后移动。收集a g 2 中 洗脱时间为3 2 0 m i n 4 5 0 m i n 之间的组分冻千后，经测定该部分糖含量为o7 ，几乎不含糖，可 见，该部分是糖肽c b p - a 经n o l y c o s i d a s ef 酶解后除去糖链后的肽组分( c a r b o h y d a t e f r e e p e p t i d e a ) 。命名为c f p - a 。 1 5 0 1 0 0 5 0 0 171 31 92 5 3 l 3 74 34 95 56 l 6 7 7 3 7 9 8 59 19 1 0 3i 0 91 1 5 洗脱时间( m i n ) e l u t i o nt i m e ( 5 m i n ) 固2 1 3c b p - p 经n - g l y c o s i d a s ef 酶解后产物的s e p h a d e xg - 2 5 凝胶过滤图谱 f i g u r e 2 1 3 g e lc h r o m a t o g r a p h y p r o f i l eo f h y d r o l y s a t e o f c b p - p t r e a t e d w i t h n - g l y c o s i d a s e f o ns e p h a d e x g - 2 5 2 l n ：_ 一q 一目j一oh_目hll一。u_-ou-日h上oo-日u 繁霉蠢瓷1)|苍杠誊 0 2 1 1 5 d 1 0 2 5 1 5 0 一田uoini=苣岂穹：og口 目。高v掣采营薹 苟_ ；d m 一日=一=o!_口h_口u口ou。p日hhlo丑hu 罄墨岱i4)葺妊嚣 5 2 5 l 5 置 l o 亩口。品)apr置ad j0吕q墨g丑 目01zv删掣昏餐 中国农业大学硕士学位论文第二章大豆蛋白酶解产物中含糖脓钮分的舒高鉴定 在图2 1 3 中，c b p p 经n g l y c o s i d a s ef 酶解后的产物被分成三个组分，分别是洗脱峰时 间为2 8 0 m i n 的p g l 、洗脱峰时间为3 8 5 m i n 的p g 2 和洗脱峰时间为5 1 5 m i n 的p g3 。从p g i 洗脱 位置来看与图2 8 的p l 组分比较一致，说明p g l 是未被n - g l y c o s i d a s ef 水解的p 】组分。与图 2 1 2 一样，p g 2 和糖分布均发生了后移。收集p g 2 中洗脱时间为3 7 0 m i n 4 4 0 m i n 之间的组分冻 干后，经测定该部分糖含量为0 6 6 ，几乎不含糖，可见，该部分是糖肽c b p - p 经n - g l y c o s i d a s e f 酶解后除去糖链后的肽组分( c a r b o h y d a t e f r e ep e p t i d ep ) ，命名为c f p - p 。 2 5 本章小结 本章主要内容是以脱脂豆粉为原料，分离得到相对纯度较商的b 伴大豆球蛋白，其含糖量 为3 2 3 。分别用a l c a l a s e 和p m n a s ee 对粗b 伴大豆球蛋白进行酶解，获得两种含糖的大豆 蛋白肽产物a 和p 。利用s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤，从这两种产物中进一步分别分离出含糖的 肽c b p a 和c b p ，并通过薄板层析确定了糖肽中的糖链与肽链的结台，这两种糖肽的宙糖量 分别为8 2 3 和9 6 6 ，分子量分别为1 6 7 0 d a 和1 1 3 5 d a 。经糖苷酶( n - g l y c o s i d a s ef ) 分别酶 解c b p a 和c b p p 后，利用s e p h a d e xg 一2 5 凝胶过滤分离出由c b p a 和c b p p 分别去除糖链 后的两种肽，分别是c f p - a 和c f p - p 。 中网农业大学硕士学位论文 第三章大豆糖肽对小鼠脾蜘 胞增硪的作用效黑 3 1 前言 第三章大豆糖肽对小鼠脾细胞增殖的作用效果 在免疫系统中，免疫器官占非常重要的地位，它发育的好坏、功能是否健全直接关系到免疫 细胞和免疫分子的产生，影响着机体的免疫功能。脾脏是人体最大的免疫器官，它含有大量的t 淋巴细胞和b 淋巴细胞，分别介导细胞免疫和体液免疫。其中，t 细腿介导的细胞免疫应答是清 除胞内寄生物的最有效防御反应( 杨廷彬等，1 9 9 8 ) 。当异物入侵机体后，免疫系统首先启动特 异性细胞免疫，淋巴细胞大量增殖以产生足够数量的效应细胞，从而起到排除异物，保护机体的 作用。研究发现，多克隆有丝分裂原加入到体外淋巴细胞培养区后，能刺激大量的淋巴细胞增殖， 因为这些物质能诱导不同特异性淋巴细胞的有丝分裂。如t 细胞能在多克隆有丝分裂原植物凝集 素( p h y t o h e m a g g l u t i n i n , p h a ) 或伴刀豆凝集素a ( c o n c a n a v a l i n ，c o n a ) 的作用下大量增殖( 周 光炎，2 0 0 0 ：刘建欣等，2 0 0 2 ) 。本研究以小鼠脾细胞为实验对象，检测了在c o n a 诱导以及无 c o n a 的情况下，大豆糖肽对小鼠脾细胞增殖的作用效果。 3 2 实验材料 3 2 1 材料和主要试剂 实验样品：b 伴大豆球蛋白经a l e a l a s e 和p r o n a s ee 分别酶解得到产物a 和p 。产物a 经 s e p h a d e x g