（光学专业论文）k562细胞增殖与损伤过程中ca2i的荧光检测分析.pdf

摘要 c a 2 + 是细胞内重要的信息载体之一，在细胞生命活动中扮演饕极其重要的角 色。羚源馈号可竣；l 超缓瓣爨浆钙枣子浓爱( c a 】，) 鳃戆空交伲，影残锈信号， 激发一系列细胞内事俘豹教生，最终完成箕特定的生理功能。所以，研究钙信号 与细胞生命活动的关系，尤其是与肿瘤细胞增殖、损伤或凋亡的关系，以及物理 因索( 磁场、射线等) 作用下肿瘤细胞【c a 2 + 】。的变化，对于研究肿瘸细胞生物学 和磁场生物效应具毒重瑟的磅究价值和现实意义。 本论文对人瓣瘩缀熬系k 5 6 2 c a 一。送行比率荧光捡测，磷究了该细憨系在 增殖和损伤过程中【c a 2 + 】i 变化以及稳恒磁场对蕊 c a 2 + l 的影响。主要工作内容包 括： 1 建立了采用比率荧光屡微法检测细胞内钙离子浓度的实验系统，完善了实 验浚舔，并对系统戆霹冀镶遴毒亍了鞠关捡穗分辑。对k 5 6 2 _ n g 整 c a 2 + ；逡嚣了比 率荧光检测，发现增殖细胞群体中胞浆f c m 存在着明显差异。 2 ，对k 5 6 2 细胞进行阔步化处理并跟踪梭测了k 5 6 2 细胞增濑过程中不同周 期时相 c a 2 + 】i 变化，结果鼹示s 期细胞【c a ”1 i 保持较低水平，在细胞分裂前后( m 期) 爨瑷较大波动，表鹱f c a 2 + l 舞高可能；l 发缨您分裂过程躬寤劝和完成。 3 。建立了紫杉醇诱苷 l 一6 0 细德璃亡的经典模型，并在不糊时闽对吾浓疰 紫杉醇作用下h l 一6 0 细胞的f c a 2 + l 进行了检测，结果显示细胞 c a 2 + 】升高l _ i ：r 能是 细胞捌亡的上游信号。 4 + 聚用9 r o t 稳恒磁场对k 5 6 2 细胞进行处理并跟踪检测其 c a 2 + 1 。鲍变化，结 合缝狳弱麓【e 矗勺；交纯及浚式绥爨分撬等实黢绦菜，涯实装时潮懿连续罄磁会鬟j 制肿瘸细胞的生长，磁场处理下连续礞磁时细胞f c a 2 + 】升高应该怒其死亡信号。 关键词：比率荧光检测，细胞信号转导， c a ” 。，细胞增殖，细胞损伤，稳恒磁场 a b s t r a c t s a so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ti n f o r m a t i o nc a r r i e r s c 矿+ p l a y sac r u c i a lr o l ei n c e l lf u n c t i o ne x t e r n a ls i g n a l sm a k es p a t i o t e m p o r a lc h a n g e so fi n t r a c e l l u l a rf r e ec c o n c e n t r a t i o n ，a n dc a l c i u ms i g n a l sc o m e i n t ob e i n g ，w h i c hs t i m u l a t e sas e r i e so fi n n e r c e l ta f f a i r sa n df u l f i l l sc e l l p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s s t u d i e so nt h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nc a l c i u ms i g n a l sa n dc e l lp h y s i o l o g y ( e s p e c i a l l yt u m o rc e l lp r o l i f e r a t i o n ，c e l l l e s i o na n da p o p t o s i s ) ，a n do nt h er e s p o n s eo ft u m o rc e l l 【c a lt ot h ep h y s i c a lf a c t o r ( e g m a g n e t i cf i e l d ，r a d i a l ) ，a r ci m p o r t a n t t ot h et u m o rc e l l b i o l o g y a n dt ot h e b i o l o g i c a le f f e c t so f m a g n e t i c f i e l da c a d e m i c a l l ya n d p r a c t i c a l l y i nt h i s s t u d y , f c a 2 + j j o fh u m a nt u m o rc e l ll i n ek 5 6 2w a st e s t e d u s i n gr a t i o f l u o r e s c e n c et e s t t h e c h a n g e so f 【c a 2 + 1 w a sr e s e a r c h e di nt h e p r o c e s so fc e l l p r o l i f e r a t i o n ，c e l ll e s i o na n da p o p t o s i s t h ee f f e c t so f s t a t i cm a g n e t i cf i e l do n c a 2 + 】1 w a s i n v e s t i g a t e d t h e m a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w e d ： 1 t h et e s t i n gs y s t e mo ft h er a t i of l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yw a se s t a b l i s h e da n d o p t i m i z e d ，a n dt h er e l i a b i l i t yo f t h et e s t i n gs y s t e mw a sa l s oa n a l y z e d t h et e s tr e s u l t o ft h ei n t r a c e l l u l a rf r e ec a 2 + c o n c e n t r a t i o ns h o w st h es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sa m o n g c e l lp o p u l a t i o n 2 t h ec e l lc y c l eo fk 5 6 2w a ss y n c h r o n i z e d ，a n dt h ep h a s eo ft h ee e l lc y c l e c h a n g e so f 【c a 2 + 】ii nk 5 6 2c e l lp r o l i f e r a t i o np r o c e s sw e r et e s t e d t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a t 【c a 2 + 】lk e p ta tar e l a t i v e l yl o w e rl e v e li ns - p h a s ea n df l u c t u a t e d c o n s i d e r a b l yi nm p h a s e ，w h i c hi n d i c a t e dt h ei n c r e a s eo ff c 矿】ic o u l ds t i m u l a t et h e s t a r t u pa n d f i n i s ho f t h em i t o s i s ， 3 e s t a b l i s h e dt h ec l a s s i c a le x p e r i m e n t a lm o d e lo f a p o p t o s i so fh l 一6 0i n d u c e d b yt a x o l ，a n dt e s t e d 【c a 2 + 】i o fh l 一6 0t r e a t e dw i t ht a x o la td i f f e r e n tt i m ea n d c o n c e n t r a t i o n sb yr a t i of l u o r e s c e n c et e s t ，t h er e s u l t so fe x p e r i m e n t ss h o w e dt h a t i n c r e a s i n go f 【c a 2 + lm a y b e u p s 拄e a ms i g n a lo f c e l la p o p t o s i s 4 + k 5 6 2c e l l sw e r ep l a c e di n9 m ts t a t i c m a g n e t i cf i e l d ，a n dm e a s u r e dt h e c h a n g eo f c a 2 + hb yr a t i of l u o r e s c e n c et e s t t h ed a t ao ft h ec h a n g eo f c a 2 + j ji nd i f f e r e n t c e l lc y c l ep h a s ea n dt h er e s u l t so f f l o wc y t o m e t e r ( f c m ) s h o w e dt h a ti n c r e a s i n go f f c a 2 + i s h o u l db et h ed e a t hs i g n a lo fk 5 6 2e x p o s e di ns t a t i c m a g n e t i cf i e l d t h e r e s u l t so fm t t a s s a yr e v e a l e dt h a ts t a t i cm a g n e t i c f i e l dc o u l dr e s t r a i nt h ec e l lg r o w t h k e y w o r d s ：r a t i of l u o r e s c e n c et e s t ，c e l ls i g n a lt r a n s d u c t i o n ， c a “ ，c e l lp r o l i f e r a t i o n , c e l ll e s i o n ，s t a t i cm a g n e t i cf i e l d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行研究工作及所取得的 磁究戏票。据我辑翔，除了文中特别鸯羁以标注和致谢的地方扑，论文中不包含其 他人发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其他教育机构的学位 或证书丽使用过的材料。与我一网工作过的同志对本磷究所做的任何贡献均以在 论文中作了明确的说嚼并表示了谢意。 学位论文作者签名：善$ 奄匆匀 签字f 1 期：翔呼年6 月g 臼 第一章引言 生物体在新陈代谢过程中，不但有物质与能量的交换。还存在着复杂的信息 交流。著名物理学家薛定谔在讨论“生命是什么”问题时，曾提出“生命的基本问 题是信息问题”，“生命是自然界三个量综合运动的表现，即物质、能量和信息在 生命系统中有组织、有秩序的活动是生命的基础”】。现代生命科学的发展已经 证明，生命科学的核心问题是遗传信息( 基因) 在时空上的有序表达，在基因的 表达过程中，生物体对外界信息的感知通过信息传递体系到达遗传物质贮存的场 所( 细胞核) ，对基因的表达进行调控，从而响应环境的刺激并做出对生命体有 利的反应。在这一过程中，生物体的信息系统起着核心作用，对于物质和能量的 代谢进行调节控制。 对于多细胞生物而言，构成生物有机体的大量细胞组成了一个繁忙而有序的 细胞社会，有机体的生命维持，不仅需要细胞的物质与能量代谢，更需要依赖细 胞之间的通讯和信息传递，以便协调细胞之间的行为，这种协调作用是通过细胞 间通讯来完成的。细胞通讯( c e l lc o m m u n i c a t i o n ) 通常表示一个细胞发出的信息传 递到另一个细胞产生相应的反应。而细胞接受外界信号，通过一整套特定机制， 将细胞外信号转变为细胞内信号，最终对真核细胞的基因表达进行调节，引起细 胞的应答反应，这就是细胞的信号转导( c e l ls i g n a lt r a n s d u c t i o n ) ，该特定机制 所需要的反应系列被称为细胞信号通路( c e l ls i g n a l i n gp a t h w a y ) 。 内外环境对细胞的影响( 例如微生物侵染、理化因素的干涉、细胞内环境中 各种细胞因子、激素、神经递质等) 通过各种方式为细胞所接收，经过细胞信号 通路引发细胞应答( r e s p o n s e ) 。那么，细胞通路是如何工作的呢? 在几十亿年 的进化过程中，真核细胞发展出了一整套成分结构复杂却又精巧细致的细胞内通 讯网络，这套网络系统是由不同的细胞通路构成的。细胞通路介导的外环境信息 ( 通常表现为化学分子的形式) 经由两种方式进入细胞：一是脂溶性小分子直接 进入细胞后与细胞内受体相结合发挥作用或传递信息到细胞核内，二是极性的或 水溶性的小分子( 又称配体) 通过与细胞膜表面受体结合引起受体分子的构象变 化，随即将细胞外的信号传递到细胞内并产生新的信号分子第二信使或其他 信号分子，引发细胞内一系列磷酸化级联反应( c a s c a d e ) 致使相关蛋白质被磷 酸化( 这一过程即为跨膜信号传递与信号通路传递) ，在细胞内形成各个传递信 号的级联放大过程，引起细胞内各种各样的生物化学变化，最终激活或抑制转录 因子，以调控基因的转录。 胞外信号通过信号转导途径进入细胞内进行传递时，由于信号通路的成分 ( 蛋白分子的类型) 不同，使信号进入细胞后因接头蛋白和岐化蛋白的作用，l 、 可以沿着多条通路向下游传递，造成信号的发散传递；2 、由多个受体接受刺激 后在体内收敛成一条通路传递，引发特定的反应。因此相同的刺激可以引起细胞 的不同反应，而不同的刺激也能使细胞产生相似的应答。其根本原因在于不同细 胞中信号通路的成分及组成既相同又有差异，而不同信号通路之间所具有的相似 组分使通路之间能够产生分子交谈( c r o s s t a l k i n g ) ，因而使信号通路之间构成 信号网络。 随生命科学前沿学科神经生物学、发育生物学、细胞生物学的发展，随 后基因组、功能基因组研究的层层深入，“细胞信号转导”概念的产生和发展极大 地深化了以往对生物信息流或细胞通讯的认识。在分子水平上提出了在细胞内除 了物质和能量代谢的分子途径和网络之外，还存在对其调节控制作用的、自成体 系的信号分子传递途径。在应答环境刺激和调节基因表达、生理反应的同时，不 仅维持着细胞正常代谢，而且最终决定了细胞增殖、生长、分化、衰老和死亡等 生命的基本现象“1 。 细胞信号分子种类繁多，既有化学分子也有物理信号( 例如电信号) 。其中 钙离子是重要的细胞内通讯的化学信号分子 2 。3 “】。随着钙离子受体蛋白一钙调素 ( c a m ) 的发现，r a s m u s s e n 等提出了c a 2 十的第二信使学说( 5 】 从而引发了生物体 内钙信号的研究热潮，吸引着细胞生物学、分子生物学、生物化学、生物物理学、 生理学、免疫学等领域的各国科学工作者不断地投入这一前沿领域。 1 1 研究目的及意义 钙是人体的必需金属元素之一，在人体内总含量约1 3 0 0 克；这些钙元素在 体内以两种状态存在结合态和离子态( c a 2 + ) 。绝大部分钙元素( 约9 8 9 ) 以结合态构成生物体的骨骼，离子态的钙元素虽然在生物体中总量不多，但却在 生命活动中扮演着极其重要的角色，几乎参与调控生命体所有的生理活动：从生 命开始的受精过程及早期胚胎发育，到控制细胞发育和分化成为特定类型的细胞 2 及组织，并且调节细胞的各秽生理生化滤动，以及参与细胞的增殖与凋亡过程忡 7 一。 根据链离子凌生馥罄内分毒黥位墨及锋曩，瑶鼓将其分是绥照悫c 扩弱麴照 外c a 2 + ，大量的研究资料表明：难常细胞内外的锊离子浓度必须维持于定的水 平，细胞肉雏钙离子浓度懿失鬻会使缀熬娃子惫险境遮f 辨。在垒移锌肉，缨蔻乡 波的钙离子浓度即【c a 2 + 。( 下同) 约为1 0 一m o l l ，而绷胞内游离钙离子浓度 ( 【c a 2 + 】，下同) 粼低得多，约为1 0 。吐1 0 m o l l ，细胞保持胞内低浓度的钙离予 浓发使其能对【c 妁i 的变化做出迅速调节，也正怒在【c 舻+ 】i 变化的过程巾，细胞 备项重要的生理活动才自顺利进行 i - 4 1 缨魏逡钙离子在生愈活动审熬终弱主要表现在两个方嚣：一耪是终为效应分 子( e f f e c t c o m p o n e n t ) 。在可兴街细胞( 例如神经细胞、肌细胞和腺细胞) 中， 豳予钙离子浓度豹交诧孳| 发缀懿萼亍为静羧交，铡始襻经遽矮豹释藏致镬毒牵经信号 ( 动作电位) 在两相邻神经元之间传播、肌细胞的收缩和腺细胞的分泌等f 1 0 , 1 1 , 1 2 】。 舅一种燕仅作为信号分子( s i g n a lc o m p o n e n t ) 在不同蒺型的绷施中，戳不丽 【c a 2 + 】i 的墨寸间、勰闻和浓度分布，形成不同的钙信号组合，激发一系列细胞内事 件的发生，最终甜细胞的生命活动产生麓大影响，完成其特定的生理功能f 灌， 例如：纲胞运动、细魏迁移、细臌黏驸、细胞撼亡、纲腿分裂与增殪等溉1 4 , 1 5 。 肿瘸是威胁人类健康与生命的三大疾病之一，对肿瘸生物学的研究历来是医 学生兹攀潋及生甥物理学镶蠛戆磺究者 j 援为关注戆蘩、淤谋霆之一。繇突资料表 明，多种因素造成的细胞损伤或细胞死亡都与细胞内外钙稳态的失调相关，细胞 蠢钙稳态失调是众多露索雩l 起壤魏死亡( 礴亡及繇死) 馥熬露梳翎，许多戆维臆撩 制物在抑制癌细胞过程中均有钙离子浓度升高的过程相伴随，而细胞内钙离子浓 度的菲黧理性交忧在许多情况下均可导致细胞凋亡或损伤f 9 】。 能够特异性弓i 起【c a ”l 井高的物理和化学因素很多，例如某魑治疗肿瘤的化 学药物如紫杉醇等。还有能够引起细胞内钙离子变化的物理因素例如磁场、射线 等e 某些艘癯细爨具有多药抗药瞧，因此对黪癌瘸人进行单纯他学药物浚疗( 纯 疗) 时效果不理想，而磁场对肿瘤细胞的生长具有抑制作用，磁场结合化学药物 渗疗缝够褥裂较好豹疗效h q 。缨臆或缓级孛e 矿+ 浓瘦的燮镁二是弱毫磁场釜糍效 殿的中心课题之一【1 6 】，低频弱电磁场可以诱导【c a 2 十】j 发生变化，可以促j 矬或抑制 细胞内钙离子浓度的升高或降低，电磁场对细胞内钙显示出频率和振幅的窗口效 应 1 6 j ? 。 因此，检测细胞 c a 2 + 】的变化，研究常态与磁场处理下细胞钙信号的产生、 传递及其与细胞增殖、凋亡等过程的关系，是细胞生物学领域与生物电磁学领域 重要的研究课题之一。磁场对肿瘤细胞【c a 2 + 】i 的效应及相关动力学物理模型的研 究在生物物理学、肿瘤生物学以及生命科学领域具有重要的科学意义与研究价 值。 1 2 主要研究内容 本论文的主要研究内容包含以下几方面： 1 、建立用比率荧光成像技术实时检澳l c a 2 + 】。的实验方法与实验系统，测定 k 5 6 2 细胞静息状态下的 c a “1 i 。( 详见论文第三章) a 实验系统介绍、系统完善与可靠性分析。 b 确定钙离子荧光指示剂，筛选实验参数。 c k 5 6 2 静息状态 c a 2 + i 检测的实验研究。 2 、k 5 6 2 细胞增殖过程q 6 c a ” i 变化的检测。( 详见论文第四章) a 采用t d r 三标阻断法进行k 5 6 2 细胞同步化培养。同步化处理结果测 试( 细胞分裂指数测定、流式细胞仪细胞周期分析) 。 b k 5 6 2 细胞增殖过程不同周期时相中 c a 2 + 】j 变化的实验研究。 3 、紫杉醇诱导h l 一6 0 细胞凋亡过程中， c a 2 + i 的检测分析( 见论文第五章) a 紫杉醇诱导h l 一6 0 细胞凋亡的模型介绍。 b 紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡阳性模型的建立以及紫杉醇对h l 一6 0 细胞 c a 2 + 】i 影响的检测与分析。 4 、稳恒磁场对k 5 6 2 细i i 包 c a 2 + 】i 影响的实验研究；( 详见论文第六章) a 磁场处理参数的筛选结果( m t t 实验结果) 。 b k 5 6 2 细胞在稳恒磁场处理下的f c a 2 + 】，检测实验。 c k 5 6 2 细胞在稳恒磁场处理后，细胞形态观察及流式细胞仪检测结果及 分析。 需要说明的是： l 、本论文所涉及实验项目较多，但均以检测细胞 c a 2 + 】i 为主线，围绕k 5 6 2 细胞【c a 2 + 】与细胞增殖和凋亡的关系，以及磁场对细胞的影响而展开。我们在建 立了比率荧光成像技术检n c a 2 + 1 的实验系统和实验方法后，测定了k 5 6 2 细胞 静息状态的【c a 2 + 】，并观察到随机细胞群体中细胞【c a 2 + 】i 具有较大差异。由此推 a ! i c a 2 + 1 ，的差异性可能与细胞处于不同周期时相有关，因此对k 5 6 2 细胞进行了 同步化处理，并对不同周期时相中的细胞进行了【c a ” i 的检测，以研究 c a 2 + 】i 变 化与细胞增殖过程的关系。本研究小组其他成员在研究稳恒磁场对k 5 6 2 细胞增 殖能力影响的实验，启发了我们对磁场与肿瘤细胞凋亡及【c a 2 + 之间的关系的研 究。为了证实实验结论，我们同时检测了一个经典的阳性凋亡模型( 紫杉醇诱导 的h l 一6 0 细胞凋亡) q p 细胞 c a 2 + 1 的变化。 2 、本论文的工作涉及到生命科学、 了许多细胞生物学技术和光学探测技术 物理学和化学诸多学科领域，综合采用 因此需要生命科学领域的工作者进行合 作。论文主要研究工作是在西北大学光子学与光子技术研究所开展的，同时也受 到了陕西师范大学生命科学学院动物细胞室的大力支持。凡涉及到合作研究者的 内容，在论文相关的地方均进行了说明。 参考文献： 1 】孙大业，郭艳林马力耕，崔素娟等，细胞信号转导，科学出版社，2 0 0 1 。 【2 】杨频，高飞，生物无机化学原理，科学山版社，2 0 0 2 。 【3 】张春阳，陈波马辉，细胞内钙离子的光学分析方法研究进展，分析科学学规2 0 0 0 ， 1 6 ( 6 ) ，5 1 6 5 2 4 。 【4 】邹寿彬，陈良怡，康华光，胞内钙信号系统，生命膨佑 毫2 0 0 0 ，2 0 ( 6 ) ，2 5 4 2 5 7 。 【5 】r a s m u s s e nh c a l c i u ma n dc a m pa sas y n a r c h i cm e s s e n g e ln e w y o r k ；j o h na n ds o n si n c 1 9 8 1 6 1y o n g m e ip u ，d o n a l dc c h a n g ，c y t o s ( i l i cc a ”s i g n a li si n v o l v e di n r e g u l a t i n gu v i n d u c e d a p o p t o s i s i n h e l a c e l l s ，b i o c h e m i c a l a n d b i o p h y s i c a l r e s e a r c h c o m m u n i c a t i o n s ，2 8 2 ( 2 0 0 1 ) ， 8 4 8 9 7 】m i c h a e l j b e r r i d g e ，m a r t i nd b o o t m a n ，p e t e 。l i p p ，c a l c i u m - al i f ea n dd e a t hs i g n a l n a t u r e 3 9 5 0 5 ) ，1 9 9 8 【8 】n a i h a nx u ，k a t h yq l u o ，a n dd o n a l dc c h a n g + c a 2 + s i g n a lb l o c k e r sc a n i n h i b i tm a r a n s i t i o ni nm a m m a l i a nc e l l sb yi n t e r f e r i n gw i t ht h es p i n d l e c h e c k p o i n t ，b i o c h e m i c a la n d b i o p h y s i c a l r e s e a r c hc o m m u n i c a t i o n s3 0 6 ( 2 0 0 3 ) ，7 3 7 - 7 4 5 9 】孙恩杰，闰玉华，徐运华，钙稳态失衡与璃细胞抑制，望笏街学与生物锄耀奠龌，2 0 0 1 2 8 ( 5 ) ，6 3 5 - 6 3 8 a 【1 0 1 金邦荃陈杰。钙离子与肌细胞代谢的荚系，动笏群影每动劲医g 专2 0 0 0 ，1 7 ( 5 ) ， 4 l - 4 2 。 【1l 】m ，t n e l s o n ，c h e n g , 珏，m 。r u b a r t ，l f s a n t a n a ，a d 、b o n e v ， j k n o t ，w j 。l e d e r e r , r e l a x a t i o n o f a r t e r i a ls m o o t hm u s c l eb yc a l c i u ms p a r k s ，s c o n c e ，1 9 9 5 ，2 7 0 ( 2 7 ) 6 3 3 - 6 3 7 【1 2 】b e n h a m ，c ，d t b o r o n ，t b ，s p o n t a n e o u st l _ a n s i e n to u t w a r dc u r r e n t si ns i n g l ev i s c e r a la n d v a s c u l a r s m o o t hc e l l s o f t h er a b b i t , j o u r n a l o f p h y s i o l o g y , 1 9 9 6 ，3 8 1 3 8 5 【1 3 】孔庆胜，胞内钙信号系统的研究进展，拶0 落髯结笋棚，2 0 0 0 ，2 3 ( 9 ) ，8 6 8 8 。 ( 14 】刘建康，胡必利，梁若斯嚣，细胞内游离铸离子在神经肽y 刺激血管平滑肌细胞增殖 中豹箨嗣，重复臻僦亩量2 0 0 0 ，8 ( 4 ) ，3 1 2 3 1 4 。 【1 5 】胡云章，李艳平，邵聪文等，升高细胞外钙离子能抑制和促进细胞凋亡的发生，矛再扩 大学学报( 盎然秘学霸。2 0 0 0 ，2 2 ( 3 ) 、2 3 2 。2 3 6 、 l 翻吴本臻，垒禽辩学孛静绣璞学一生穆磁学，j 袁，魏索大学出版幸，1 9 9 6 7 ，1 7 6 一1 9 l 。 【17 】j u f i sg a l v a n o v s k i s ，j o h ns a n d b l o m ，p e r i o d i cf o r c i n go fi n t r a c e l l u l a rc a l c i u mo s c i l l a t o r s t h e o r e t i c a ls t u d i e so ft h ee f f e c t so fl o wf r e q u e n c yf i e l do i lt h em a g n i t i t u d eo f o s c i l l a t i o n s ， b i o e l e c t r o c h e m i s t r y a m l b i o e n e r g e t i c s ，1 9 9 8 ，4 6 ，1 6 1 1 7 4 。 6 第二章相关生物学背景及【c a 2 + 】检测技术简介 本论文研究的对象是肿瘤细胞，必然要涉及到一些细胞生物学基础知识和实 验技术。本章简单介绍了与论文工作直接相关的一些细胞生物学的概念，以便后 续章节的阐述。另外，本论文的主线是k 5 6 2胞 c a 2 + 】i 的检测，本章对相关检 测技术进行了综述和比较，以使读者对【c a 2 + l 的检测有一个总体上的印象。 2 1 相关生物学背景知识 2 1 i 细胞钙信号( c a l c i u ms i g n a l s ) 的特点及功能 1 钙信号的产生与终止 大多数细胞内外自由c a 2 + 浓度相差3 4 个数量级，细胞内c a 2 + 分布也不均 匀，许多被称为“钙库”的细胞器( 细胞区室) 含钙量也比胞浆高1 个数量级左右 f l 】。细胞遭受到外界刺激时可以诱发细胞外c a 2 + 的内流和钙库c a 2 + 的释放，导致 胞浆 c a 2 + 】的升高，促使c a 2 + 与胞浆中某些蛋白质或酶结合并使其激活，最终影 响核内基因的表达调控，引起细胞应答，从而起到传递胞外信号的作用，即第二 信使功能。c a 2 + 发生转移后，致使细胞内自由c a 2 + 时空分布发生变化，此即钙信 号的产生。 钙信号由细胞外c a 2 + 内流与钙库c a 2 + 的释放2 1 而产生，细胞外c d + 内流主 要通过质膜c a 2 + 通道( c a 2 + c h a n n e l ) 进行。离子通道由一类膜结合蛋白构成， 通过改变蛋白的构象使通道开启或关闭，以控制c a 2 + 的跨膜流动。根据操纵离子 通道启闭的上游调控因子，可将目前已知的外钙内流方式分为四类【l 】= 电压门控 钙通道( v o t a g e o p e r a t e dc d + c h a n n e l ，v o c s ) 、激动剂一受体门控钙通道 ( r e c e p t o r - o p e r a t e dc a 2 + c h a n n e l ，r o c s ) 、机械操纵性钙离子通道( m e c h a n i c a l l y c a 2 + c h a n n e l ，m o c s ) 和钙库控制的钙通道( s t o r e o p e r a t e dc a 2 + c h a n n e l ，s o c s l 。 另外，还有仅在静息状态下使c a 2 + 少量内流，起着保持细胞内外钙离子平衡作用 的渗透c a 2 + 通道( 1 e a k c a 2 + c h a n n e l ) 。由于钙库中存在很多种对c a 2 + 高容量、低 亲和力的存储蛋白( 如肌细胞中的集钙蛋白c a l s e q u e s t r i n 、小青蛋白p a r v a l b u m i n 、 c a l b i n d i n 等) ，所以能够对c a 2 + 进行存储。胞内钙库c a 2 + 的释放也通过钙通道完 成。主要有两种钙释放通道，即i p 3 受体钙通道和蓝尼啶( r y a n o d i n e ，r y 鼬受体 7 钙通道。由于细胞种类不同，i p 3 和r y r 受体又分为多种亚型l j l 。 由于细胞质中过高的c a 2 + 浓度会导致磷酸根沉淀，使细胞物质和能量代谢受 阻，伤害甚至致死细胞，所以，钙信号的及时终止对细胞也是至关重要的。钙信 号的终止与细胞胞浆对c a 2 + 缓冲作用以及胞浆c a 2 + 的外排和入库( 进入钙库) 机制有关。c a 2 + 进入细胞后，引起局部胞浆 c a 2 + 升高，随即被某些蛋白结合， 使其不能自由扩散。这不仅对c a 2 + 起到缓冲作用，而且使c 扩具有时空分布， 增加了钙信号的多样性。胞浆c a 2 + 外排可通过质膜上的两个c a 2 + 转移系统，即 普遍存在的高亲和力低容量的钙泵( c a 2 + a t p ) 与可兴奋细胞中存在的低亲和力 高容量的n a + c a 2 + 交换器来完成。由于内膜系统靠近c a 2 + 作用位点，表面积大， 而且细胞内钙库与细胞质的c a 2 + 浓度梯度相对较小，因此，细胞内膜系统能够迅 速完成c a 2 + 转移。钙进入钙库的主要途径是内质网钙泵和线粒体的c a 2 转移系 统。 2 钙信号的时空编码 钙信号变化主要包含c j + 的空间分布变化以及c a z + 浓度的时间变化( 频率 和幅度) n 2 ，钔。 极低水平的钙动员信使( 如：i p 3 等) 或环境刺激会导致单个通道的短暂开 放，释放出来的少量c a 2 + ，称为钙脉冲( b i p s ) 或钙夸克( q u a r k ) ，一组邻近钙通 道的协同开放，产生钙团( p u f f ) 或钙闪烁( s p a r k ) ，这些c a 2 + 释放过程称为基 本事件( e l e m e n t a r ye v e n t s ) 。基本事件的钙信号在通道打开时，c d + 浓度快速升 高并形成空间限制的局部钙信号，执行特定的功能；在通道关闭时，缓慢复原。 基本事件的钙信号具有量子化特征。当足够数量的一套钙信号基本单位协同作用 时，可产生整体响应，形成钙波( w a v e ) 。钙波可通过胞间联系到达相邻细胞。 局部钙信号和钙波体现了钙信号的空问性质。但是，同一空间变化的钙信号却可 能导致完全矛盾的结局一一细胞死亡或者增殖【2 ，4 ”。所以，必然有多样的时间 编码来参与调控不同的生理过程吐例如：平滑肌细胞的钙闪烁可维持0 1 0 5 秒，而肝细胞形成的钙波能持续l o 一2 0 秒，人类卵细胞受精后形成的钙波可延续 1 - 3 5 分钟，细胞增殖的钙信号周期则可达l o 2 0 小时i 到。 钙通道的周期性开放能够引起整体钙信号产生周期性的钙峰，即形成c a 2 + 振荡( c a 2 + o s c i l l a t i o n s ) 。钙信号的时阳j 特性可用钙振荡的频率来反映1 4 。胞浆 8 c a 2 + 浓度随时间的变化w 以定义为锚信号的振幅变化7 1 。对于相同细胞的特怒刺 激来说，c a 2 + 振荡的鬏搴往往是确定靛。已商实验诞据表明钙振荡频率与纂瓣瓣 转录激滔相关。但相对钙振荡韵频率而言，钙峰幅度( 即钙鹃浓度变化) 的精确 测定在实骏上存在相当大的困难，而钙振荡的振幅特征也能调控细胞的特定功能 盛4 t 熨。 3 细胞内钙信号的功能 c a 2 + 傣号系统调控的细胞功能十分广泛。从卵细胞受精、胚脸发弯到体细胞 分纯：扶纲胞分裂到麴胞凋亡；献慕因转录到蛋囱和酶静调控；从神经细臌产生 记忆、视网膜细胞的光电转换到各种分泌细胞的调控，钙信号的作用无处不在【1 ， 2 t 4 t5 ，酊。 许多实验证据显承在细慈掏亡时，细胞内c a 静浓度会显著升高。铡翔，将分 离的细胞核放在含有c a 2 + 的培养基中培养时，染甑质会发生凝集，细胞表现出典 型鲍凋亡特诬。反之，翔累使蠲钙离子螫合刻来降低细胞内e 扩浓度，则能延迟 或掷制缁胞凋亡翻。 2 1 2 细胞增殖( c e l lp r o l i f e r a t i o n ) 粲黥增蘩是指续稳在分裘之裁豹秘囊准备馥及缨瑰开始分裂毫至分爱宠成 的整个生命过程。细胞增殖是细胞生命活动的萋臻特征之一，是多细胞生物发 育的基础。细胞增殖怒个复杂而精密的生命活动过程，必须遵从一定的规德， 任嚣一个荧键步骤鹃锈误，都霹施导致严重熬君聚( 镶螽过凌穗整或貔癯发生) 。 细胞增殖的调控过程由一整套复杂的生物信息传递体系引发并通过对核基因转 录及复制的调控来进行【8 1 。 1 细骢髑期( c e l lc y c l e ) 细胞农分裂前，必须进行各种必要的物质准铸。其中，最熏要的就是遗传物 震豹载侮d n a 豹i e _ 璃葶爨臻康复测，瑟羚，其它缨鼹穆矮遣嚣赘送行准备。这些 物质的准铸包括数量上的积累以及它们被及时地装配成需要的结构或者被修饰 到一定的分子结构和功能状态。经过完备的物质准备之后，细胞才能开始分裂， 形戏子伐缀藏。予缨稳形成磊，又稔西始瑟一轮翁糍震获累，漆器下一轮懿缀魏 分裂。如此周而复始，细胞数量不断增加。这种细胞物质积累与细胞分裂的循环 9 过程，称为细胞周期。从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下 次缨胞分裂结束为止，称为一个细胞周款( c e l lc y c l e ) 。一个细胞周欺就怒一个 缨臆的整个生命过稷，帮由一个缨激变藏了两个子细胞。因魄，绍臆周期穗可称 为细胞生活周期( c e l ll i f ec y c l e ) 或细胞繁殖周期( c e l lr e p r o d u c t i v ec y c l e ) 。 一个细胞厨期一般人为划分为4 个畦期，鄹：g l 期、s 期、g 2 期和m 期， 这四个时期是一个动态的、连续的过程。绝大 多数真核细胞的细胞周期都包含这4 个时期， 只是时阕长短有所不燃。通常将含露这4 个不 同霹麓的细脆周鬻称为标准缁德璃期 ( s t a n d a r dc e l lc y c l e ) ，细胞周期中的备个时期 选称为时榍【s l 。另捧，鸯些细胞会暂融离开缨 瞧羯期，停止细戆分裂，去执行某种生物学功 一 能，这些细胞称为静止期细胞( q u i e s c e n tc e l l ) ，溅g o 期细胞，g o 期细胞一+ 阻得 到特定信母指使，又会快速返回绷戆周期。 细穗髑期中各个不阍豺期及荬熏要事件： g 1 期：g i 期是一个细胞周期的篇一阶段。上一次细胞分裂之后，子代细胞 生成，餐立即进入一个纲腿生长时嬲( g l 期) 。绸骢在姥除段( 瓣相) ，主要合 成生长联需要豹各种鬣黩质、糖类、精质等，但不合成d n a 。在g l 期的晚期阶 段有一个特定时期( 称为起始点s t a r t 、限制点r e s t r i c t i o np o i n t 或检验点 c h e c k p o i n t ) ，如果细胞继续走向分裂，藏可默逮避这个特定聪期，进入s 期，开 始合成d n a ，并继续篱迸，直到完成细胞分裂。 s 期：8 期即d n a 合成期。细胞经过g l 期，为d n a 复制的起始做好了各 方瑟兹准餐。进入s 期矮，立邸开戆含成d n a 。d n a 复翱黪起始窥复铡避程 受到多种细胞周期调节围素的严密调控。 g 2 期：d n a 复制宪成以后，细胞就进入g 2 期。此时细胞梭内d n a 的含量 已经增热一镶，由g i 期的2 n 交成了碡n ，鞠每个染色葵含有2 个拷妥麴d n a 。 其它物葳帮相关的亚细胞结构也已进行了进入m 斓的必要准备。但细胞能街顺 利地进入m 期，要受到g 2 期检验点的控制。g 2 期捡验点要检控d n a 复制懋否 完成，绥熬怒虿已生长瓣合适大小，环境毽素是否裂予缨魏分裂等。只有当掰畜 有利于细胞分裂的困豢得到满足以焉，细胞才能顺利实现从g 2 期向m 期的转化。 m 期：m 期即细胞分裂期。真核细胞的细胞分裂主要包括两种方式，即有 丝分裂和减数分裂( m e i o s i s ) 。体细胞一般进行有丝分裂；成熟过程中的生殖细 胞进行减数分裂，也称为成熟分裂，减数分裂是有丝分裂的特殊形式。细胞经过 分裂，将其遗传物质载体d n a 平均分配到两个子细胞中，由于m 期细胞核内染 色体开始发生凝集，因此可以用光学显微镜来观察处于分裂期中的细胞。 2 细胞周期测定 细胞种类众多，繁殖速度有快有慢，因此细胞周期长短差别很大。单细胞生 物是如此，多细胞生物也是如此。就人体细胞而言，如神经细胞、肌肉细胞、血 细胞、肝细胞、小肠上皮细胞等，生长繁殖速度差异很大。有的细胞的其间期可 以长达十几年甚至几十年，有的则短至几天或几小时，甚至几十分钟。体外培养 的细胞也是如此，细胞来源不同，其细胞周期长短各异。细胞周期的测定方法多 种多样，我们仅介绍流式细胞分选仪测定法。 流式细胞分选仪是一种快速测定和分析流体中细胞或颗粒物各种参数的大 型实验仪器。它可以逐个地分析细胞或颗粒物的某个参数，也可以结合各种细胞 标记技术，同时分析多个参数，诸如细胞种类、d n a 、r n a 、蛋白质含量以及 这些物质在细胞周期中的变化等。还可以用作对某个细胞群体中的各种细胞进行 分检，流式细胞分选仪在细胞周期研究中应用广泛。 由于g i 期和g 2 m 期细胞 有固定的d n a 含量，分别为2 n 和4 n ，s 期细胞的d n a 含量介于2 n 和4 n 之间。 流式细胞分选仪测定细胞周期，可以通过荧光探针标记，监测细胞d n a 含量， 经过统计细胞数量和被标记的不同d n a 含量的细胞的百分比，对细胞周期进行 综合分析。若应用流式细胞分选仪并结合细胞周期同步化技术，综合分析细胞周 期时间，将会使实验结果分析更加简便可靠。 3 细胞周期同步化处理 在同种细胞组成的一个细胞群体中，不同的细胞可能处于细胞周期的不同时 相，为了实验目的，人们经常需要整个细胞群体处于细胞周期的同一个时相。在 自然界中存在着一些细胞群体，它们在某些情况下可以处于细胞周期的同一时 相，这类细胞群体称为自然同步化细胞群体( 例如早期卵裂的胚胎细胞群)