（动物遗传育种与繁殖专业论文）小鼠卵母细胞老化的分子调控及第一极体命运.pdf

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在卵母细胞在老化过程中 第一极体发生移动 退化甚至消失 这些变化 都影响克隆和精子注射显微受精等胚胎工程技术的实施 因此 有必要研 究卵母细胞老化的调控机制和第一极体的命运 我们研究了小鼠卵母细胞 在体内外老化过程中第一极体出现 移动与退化的时问 孤雌激活能力和 m p f 活性变化 结果表明 1 小鼠卵母细胞于注射h c g 后8 h 开始排出第一极体 而到h c g 后 1 0 h 排第一极体卵的比例达到最大 排卵时就有部分极体开始退化 至t j h c g 后2 0 h 时极体全部发生退化 到h c g 后3 2 h 时 大多数极体消失 2 在体外成熟过程中 培养8 h 开始有极体排出 到培养1 4 h 时极体 的排出率达到最大 培养1 0 h 极体开始退化 到培养3 4 h 极体全退化 但并不消失 3 体内和体外成熟的卵母细胞在体内和体外老化过程中 第一极体的 位置都随着卵母细胞卵龄的增加和卵周隙的增大而逐渐远离纺锤体 4 即便卵母细胞放在体外静止的环境 第一极体仍然发生移动 但体 外成熟卵母细胞第一极体要比体内成熟卵母细胞的移动得慢 排卵过程和 极体排出后脱卵丘都促进第一极体的移动 5 体内和体外成熟的卵母细胞在体内或体外老化过程中 卵母细胞 激活率逐渐升高 m p f 活性逐渐下降 关键词 第一极体卵母细胞老化m p f 小鼠 山东农业人学坝 i 研究生论文 2 0 0 4 m o l e c u l a rc o n t r o lo fa g i n ga n dt h ef a t eo ft h ef i r s t p o l a rb o d i e so fm o u s eo o c y t e s a b s t r c t i nm o s tm a m m a l s m a t u r e do o c y t e sa r ea r r e s t e da tm e t a p h a s e i i a n dw i l l n o tr e s u m em e i o s i su n t i lt h e ya r ea c t i v a t e db yp e n e t r a t i n gs p e r m a t o z o ao r o t h e rs t i m u l a t i o n s i fn o tf e r t i l i z e do ra c t i v a t e dt i m e l y t h em i io o c y t e sw i l l u n d e r g oa g i n g a g e da n dn o n a g e do c c y t e sa f ei d e n t i c a li nm o r p h o l o g yb u t t h em o l e c u l a rc h a n g e so c c u r r i n gi nt h ec y t o p l a s ma r ed i f f e r e n t d u r i n ga g i n g o fo o c y t e s f i r s tp o l a rb o d i e d f p b m o v e d e g e n e r a t ea n dd i s a p p e a ia tl a s t t h e s ec h a n g e sw o u l da f f e c tt h es u c c e s so fs o m ee m b r y ot e c h n o l o g i e s s u c ha s a n i m a lc l o n i n ga n di n t r a c y t o p l a s m i cs p e r mi n j e c t i o n i ti st h e r e f o r en e c e s s a r y t oi n v e s t i g a t et h em o l e c u l a rc h a n g e sd u r i n go o c y t ea g i n ga n dt h ef a t eo ff p b i nt h i ss t u d y t i m i n go ff o r m a t i o n d e v i a t i o na n dd e g e n e r a t i o no ff p b c h a n g e s i np a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o na n dt h ea c t i v i t yo fm 田fd u r i n gi nv i v oa n di n v i t r oa g i n go fb o t hi nv i v oa n di nv i t r om a t u r e dm o u s eo o c y t e sw e r es t u d i e d a n dt h ec o n t r o lo fo o c y t ea g i n gw a sa t t e m p t e dw i t hc a f f e i n ea n ds o d i u m v a n a d a t e 功er e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s 1 o o c y t e s s t a r t e df p be x t r u s i o na t8hp o s th c gd u r i n gi nv i v o m a t u r a t i o n a n dt h en u m b e ro ff p br e a c h e dm a x i m u m1 0hp o s th c g a n d s o m ef p bd e g e n e r a t e da to v u l a t i o n a l lf p bd e g e n e r a t e da t2 0h p o s th c g a n dm o s tf p bd i s a p p e a ra t3 2hp o s th c g 2 d u r i n gi n v i t r om a t u r a t i o n o o c y t e ss t a r t e df p be x t r u s i o na t8ho f c u l t u r e a n dt h en u m b e ro ff p br e a c h e dm a x i m u ma t1 4 ho fc u l t u r e s o m e f p bb e g a nt od e g e n e r a t ea t10o fc u l t u r e a n da l lf p bd e g e n e r a t e d3 4ho f c u l t u r eb u tf e wd i s a p p e a r e db yt h i st i m e 3 d u r i n gi nv i v oa n di nv i t r oa g i n go fb o t hi nv i v oa n di nv i t r om a t u r e d m o u s eo o c y t e s t h ed i s t a n c eb e t w e e nf p ba n dt h es p i n d l ei n c r e a s e dw i t ht i m e a n dp v se n l a r g e m e n t 3 山东农业人学硕1 l i f 究生论文 2 0 0 4 4 e v e ni fp u ti nt h er e l a t i v es t i l lc o n d i t i o n si nv i t r o f p bd e v i a t e d b u t t h e ym i g r a t e dm o r es l o w l yi nt h ei nv i t r om a t u r e do o c y t e st h a ni nt h ei nv i v o m a t u r e d o v u l a t i o na n dd e n u d a t i o np e r f o r m e da f t e rf p be x t r u s i o nm a r k e d l y e n h a n c e di t sd e v i a t i o n 5 d u r i n gi nv i v oa n di nv i t r oa g i n go ft h ei nv i v om a t u r e do o c y t e s t h e a c t i v a t i o nr a t eo f t h eo o c y t e si n c r e a s e da n dt h ea c t i v i t yo f m p fd e c r e a s e d k e yw o r d s f i r s tp o l a rb o d y o o e y t e a g i n g m p f m i c e 4 山东农业人学坝i 研究生论文 2 0 0 4 1 引言 动物胚胎工程技术研究与开发所用的成熟卵母细胞都停滞在m i i 期 直到有精子穿入或给予电或化学药品刺激时才能解除停滞并恢复减数分 裂 在这一停滞过程中 卵母细胞形态及其核状念不发生明显的改变 但 卵母细胞的胞质会随停滞时间的延长而发生某些变化 如延长培养时间的 猪卵母细胞其活化率和碎裂率都增高 n a g a je ta 1 1 9 8 7 k i k u c h ie ta 1 1 9 9 5 1 活化后卵裂不正常 出现不均等的卵裂球 s a t oe ta 1 1 9 7 9 k i k u c h i e ta 1 1 9 9 5 这种mi i 期卵母细胞延长培养时质量下降的现象称为老化 老化的卵母细胞受精或用于胚胎工程技术会产生异常胚胎和影响成功率 因此 有必要了解卵母细胞老化的分子机理 进而调控卵母细胞老化 另 外 卵母细胞在老化过程中第一极体也会发生退化 移动和消失 克隆技 术 精子注射及人类胚胎的遗传诊断都需要准确掌握极体的情况 因此有 必要研究卵母细胞中第一极体的命运 1 1 卵母细胞老化引起的危害 很早人们就发现 包括人在内的许多哺乳动物的异常发育都与卵母细 胞在输卵管内发生老化有着密切的联系 这些异常往往表现为染色体异 常 如出现三倍体 混倍体 三体或单体 在许多动物 如兔 仓鼠 y a n a g i m a c h ie ta 1 1 9 6 1 小鼠 大鼠 猪和牛 拖延交配或推迟输精时 间会导致受孕率降低 发育异常和胚胎死亡率增加 在人 卵母细胞的老 化也会增加自发性流产的发病率 g u e r r e r oe ta 1 1 9 7 5 在猪 拖延1 2 h 交 配就可大大降低卵母细胞的受精率而且即使能被受精也会发生多精受精 从而导致胚胎发育异常或死亡 h u n t e r 1 9 6 7 体内老化的仓鼠 小鼠和兔 卵母细胞的体内或体外的受精率和发育率都大大下降 y a n a g i m a c h ie ta 1 1 9 6 1 a d a m se ta 1 1 9 6 2 s m i t he ta 1 1 9 8 7 在哺乳动物细胞核移植中 多数采用去核的m i i 期卵母细胞作为受体 胞质 尽管已经发展了多种去核方法 蔗糖辅助去核 化学去核 末期去 核 荧光辅助去核 偏振光显微镜辅助去核等 但是最常采用的仍是盲 吸的方法 即吸去第一极体及附近的胞质 w i l l a d s e n 1 9 8 6 m e n ge ta 1 1 9 9 7 w a k a y a m ae ta 1 1 9 9 8 另外 在进行单精子胞质内注射 山东农业人学硼 研究生论文 2 0 0 4 i n t t a c y t o p l a s m i cs p e r mi n j e c t i o n i c s i 时 常将第一极体处于1 2 点或6 点 的位置 然后从3 点的位置注入精子 从而避免损伤m i i 纺锤体f p a l e r m o e ta 1 1 9 9 3 盲吸法及i c s i 时从3 点位置注入精子都是以假设m i i 纺锤 体与第一极体位置邻近为前提的 但是随着卵母细胞的老化 第一极体逐 渐偏离m i i 纺锤体 从而引起去核率降低 导致非整倍体的发生和受体胞 质的遗传污染 并使i c s i 时卵母细胞常因减数分裂器受到损伤而导致形 成的受精卵不能卵裂或卵裂不 f 常 t a r l a t z i sa n db i l i 1 9 9 8 而且纺锤体与 第一极体问的角度越大异常受精率也越高 r i e n z ie ta 1 2 0 0 3 1 2 卵母细胞老化过程中超微结构的变化 早期对卵母细胞老化的研究主要通过超微结构的观察 对实验动物和 猪卵母细胞老化后结构和超微结构的研究表明 老化的卵母细胞往往出 现 1 因纺锤体旋转和内移而造成的第二极体滞留 形成两个雌核 d i g y n y 2 因纺锤体崩解而造成细胞质碎裂 3 细胞器发生退化 特别 是与透明带反应和卵黄反应有关的皮质颗粒的内移和碎裂 s z o l l o s id 1 9 7 1 l o n g o1 9 7 4 于是 导致多精受精 1 3 卵母细胞老化过程中孤雌激活率的变化 卵母细胞的人工激活方法可分为物理性刺激和化学性刺激两类 前者 包括机械刺激 温度刺激以及电刺激等 后者包括酶刺激 渗透压刺激 离子刺激 麻醉剂处理 放线菌酮处理和蛋白激酶抑制剂处理等 目前主 要用化学物质来激活卵母细胞 所用的化学试剂主要有乙醇 氯化锶 钙 离子载体a 2 3 1 8 7 钙霉素 i o n o m y c i n 佛波脂 p m a 蛋白合成抑制 剂 亚胺环己酮 c h x 嘌呤霉素 p r o m y c i n 以及蛋白磷酸化抑制剂 6 二甲氨基嘌呤 6 一d m a p 等 在小鼠 新排卵母细胞对乙醇激活处理不敏感 其激活能力随卵龄增 加而提高 谭景和等 1 9 8 8 x ue ta 1 1 9 9 7 刘红林等 1 9 9 8 兰国成等 2 0 0 2 猪体外成熟卵母细胞的激活率会随卵母细胞体外培养时间的延长 而逐渐升高 刚培养成熟的卵母细胞的激活率很低 无论在弱刺激条件下 还是在强刺激条件下 体外培养3 6 h 猪卵母细胞的激活率都不超过1 0 而体外培养时间超过7 2 小时的猪卵母细胞在在强刺激条件下达到5 0 以 山东农业人学顺l 研究生论文 2 0 0 4 上 k i k u c h ie ta 1 2 0 0 0 这些结果表明卵母细胞在老化过程中 激活率 会随着老化时间的延长而逐渐升高 高激活率可作为卵母细胞老化的 个 衡量标准 1 4 卵母细胞老化过程中m p f 活性的变化 m a s u i 和m a r k e g 1 9 7 1 将成熟蛙卵母细胞中能促使卵母细胞成熟的 成分称为成熟促进因子 m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r m p f 后来研究发现 m p f 几乎存在于从酵母到人体细胞所有有核细胞的分裂期细胞中 m p f 是由p 3 4 e 岫和c y c l i n b 构成的 其活性是由一系列复杂的蛋白质磷酸化和 去磷酸化束调节的 p 3 4 越本身具有h 1 组蛋白激酶的作用 m p f 没有活 性时 其t y r 一1 5 和t h r 1 4 两个位点的氨基酸高度磷酸化 m p f 的活性受 w e e l 和m i k l 基因产物的调节 l u n g r e n e ta 1 1 9 9 0 s o l o m a n 1 9 9 0 这 两个基因的产物均是蛋白磷酸激酶 能特异地使p 3 4 d e 2 的t y r 1 5 和t h r 1 4 位点磷酸化 当m p f 活化时 c y c l i n b 与p 3 4 2 结合 p 3 4 c d c 2 的t y r 1 5 和t h r 一1 4 两个位点已经磷酸化的氨基酸残基去磷酸化 p 3 4 的s e r 1 6 1 位点的丝氨酸残基保持磷酸化状念 目前已知 c d c 2 5 的基因产物可使 p 3 4 础2 的酪氨酸与苏氨酸两个残基同时去掉磷酸 从而最大限度地激活 m p f 的活性 在整个细胞周期中 p 3 4 d 2 没有量的变化 只有活性的变 化 从g 2 期进入m 期时 p 3 4 删通过去磷酸化而显示出激酶活性 而在 离开m 期时 又通过磷酸化而失活 卵母细胞老化过程中m p f 活性逐渐降低 x u 等 1 9 9 7 发现体内成 熟的小鼠卵母细胞内m p f 活性会随着卵母细胞卵龄的增加而降低 若以 体外培养4 8h 的猪卵母细胞内m p f 活性作为1 0 时 到培养7 2 h 时m p f 的活性就会降低到0 3 以下 k i k u c h ie ta 1 2 0 0 0 1 5 卵母细胞老化与细胞凋亡 g o r d o 等 2 0 0 2 将小鼠卵母细胞在体外老化到h c g 后2 4 3 2 和4 0 h 后 注入精子胞质因子 s p c l m c y t o s o l i c f a c t o r s f a d e n o p h o s t i n a 或精 子 结果发现 在 h c g 后3 2 h 时以后 卵激活引起的钙离子波动不是启 动胚胎发育 而是引起卵母细胞的凋亡 碎裂等 老化卵母细胞的胞质 变化可能与其对凋亡的敏感性有关 当将刚排出的卵母细胞与老化并注射 山东农业人学颂i 1 0 f 究生论义 2 0 0 4 s f 的卵母细胞相融合时 可抑制老化卵的碎裂 在测定凋亡调节蛋白b c l 一2 和b a x m r n a 和蛋白水平时发现 老化卵母细胞的b d 2m r n a 和蛋白水 平明显下降 而b a xm r n a 和蛋白水平没有明显变化 这些结果表明 调节钙离子与抗或促凋亡蛋白平衡的一种或几种重要的胞质分子 在卵母 细胞老化过程中会发生丢失或失活 从而将受精钙离子信号转化成凋亡诱 导信号 目前 体外成熟卵母细胞已在动物繁殖技术如体外受精 精子注射和 核移植上有着广泛的应用 控制卵母细胞老化将给这些技术到来很多好 处 如可取消对操作时间的限制 而且卵母细胞的质量也能得到保证 因 此 找到控制卵母细胞老化的方法对这些技术会大有益处 1 6 论文主要研究内容 体内外成熟卵母细胞在体内外老化过程中 1 第一极体出现与退化 的时间规律 2 第一极体与卵母细胞m i i 纺锤体的相对位置的变化及影 响因素 3 孤雌激活能力的变化 4 m p f 活性变化 2 材料与方法 2 1 实验动物及超排处理 购自山东省泰安市生物制品研究所实验动物中心 合格证号 鲁动环 字2 0 0 0 0 1 0 0 8 号 的昆明系母鼠 控光 黑暗2 0 0 0 6 o o 光照6 0 0 2 0 0 0 一周后进行超排处理 超排处理方法是腹腔注射p m s g l 0i u 只小鼠 4 8 小时后腹腔注射h c g l 0i u 只 2 2 主要试剂及配制 本实验所用试剂除特殊说明外均为s i g m a 产品 卵母细胞成熟培养液 t c m l 9 9 g i b c o 加1 0 胎牛血清 f c s g i b c o 1 0 i u m l 孕马血清促性腺激素 p m s g 天津实验动物中心产品 1 0 0 i u m l 青霉素 鲁抗药液 和1 0 0 i u m l 硫酸链霉素 鲁抗药液 体细胞培养液 d m e m 液加1 0 新生牛血清州c s g i b e o 1 0 0 i u m l 青霉素 鲁抗药液 和1 0 0 1 u m l 硫酸链霉素 鲁抗药液 山东农业大学硕l 研究生论文 2 0 0 4 操作液体 m 2 液 每l o o m l 七蒸水中加入n a c l 0 5 5 3 1 9g k c l 0 0 3 5 6 3 9 c a c l 2 2 h 2 0 o 0 2 5 1 4 9 k h 2 p 0 4 0 0 1 6 1 9 5 9 m g s 0 4 0 0 1 4 3 2 7 6 9 n a h c 0 3 o 0 3 5 9 h e p e s 0 4 9 6 8 5 5 9 乳酸钠 o 4 3 4 9 9 丙酮酸钠 o 0 0 3 6 3 9 葡萄糖 o 1 0 0 1 9 1 2 9 b s a 0 4 9 青霉素 o 0 0 6 g 链霉素 0 0 0 5 9 酚红钠 o 0 0 1 0 6 9 和简易p b s 液 每l o o m l 七蒸 水中加入n a c l o 8g k c l o 0 2 9 k h 2 p 0 4 o 0 2 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 o 1 5 3 6 9 老化液体 c z b 液 n a c l o 4 7 6 9 8 7 9 k c l o 0 3 6 0 0 8 9 k h 2 p 0 4 o 0 1 6 0 6 0 9 m g s 0 4 n 0 1 4 4 2 0 7 9 n a h c 0 3 0 0 1 4 2 0 7 9 c a c l 2 2 h 2 0 0 0 2 5 0 9 乳酸钠 o 3 5 0 7 4 8 9 丙酮酸钠 0 0 0 2 9 7 9 e d t a 0 0 0 4 0 9 4 9 谷氨酰胺 o 0 1 4 6 1 9 b s a 0 5 9 青霉素 0 0 0 6 9 链霉素 o 0 0 5 9 激活液 5 乙醇 济南试剂总厂 溶液 于临用前向m 2 液内添加5 的乙醇配制而成 6 一二甲氨基嘌呤 6 d i m e t h y l a m i n o p u r i n e 6 d m a p 先用d m s o 配成浓贮液 分装并在一2 0 c 贮存 用前以c z b 稀释到2 m m 超排激素 p m s g 人绒毛膜促性腺素 h c g 天津实验动物中心产品 测定m p f 收集液 8 0 r a m1 3 甘油磷酸盐 b g l y c e r o p h o s p h a t e 2 0 m m 乙二醇双乙胺醚一n n 四乙酸 e g t a p h 7 3 1 5 m mm g c l 2 l m md l 一二硫苏糖醇 d t t l m m 苯甲基磺酰氟 p m s f 1 0 i t g m l 亮抑酶肽 1 e u p e p t i n 1 0 扯g m l 胃蛋白酶 p e p s t a t i n 1 0 i t g m l 抑酶肽 a p r o t i n i n a n d5 0n mo fc a m p 依赖的蛋白激酶抑制剂 c y c l i ca d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e c a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ei n h i b i t o r 测定m p f 反应液 l o m mt r i s h c ip h 7 5 3 0um 巯基乙醇 l m g m l 组蛋白h 1 0 7 r a ma t p a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h a n d2 0 扯c v m ly 3 2 p a t p a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 2 3 卵母细胞的获取 2 3 1 排卵卵母细胞 经超排的母鼠在注射h c g 后不同时间点脱颈椎法杀鼠后摘取小鼠输 卵管 于体视显微镜下挑破输卵管膨大部 收集卵丘细胞完整的卵母细胞 c u r n u l u s o o c y t e sc o m p l e x i o n c o c 2 3 2 排卵前卵泡内的卵母细胞 q 山东农业大学坝i t o f 究生论义 2 0 0 4 经超排的母鼠在注射h c g 后不同时间点脱颈椎法杀鼠后摘取小鼠卵 巢 将卵巢上的成熟卵泡刺破 收集c o c 2 3 3 体外成熟卵母细胞 2 3 周龄母鼠腹腔注射1 0 i u 只p m s g 4 6 h 后脱颈椎法杀鼠后摘取小 鼠卵巢 然后用刺卵针刺破卵泡 收集c o c 放到成熟培养液中培养 拣出有第一极体的成熟卵母细胞 2 3 4 裸卵的制备 将收集的c o c 用m 2 洗3 遍后放入含有o 1 透明质酸酶的m 2 液处理 3 分钟后 用与卵母细胞直径接近的细玻璃管反复吹打去掉卵丘细胞 获 得裸卵 d e n u d e do o c y t e d o 将d o 洗净后备用 2 4 卵母细胞体外老化处理 将获得的c o c 或d o 放入c z b 培养液 c h a t o t e ta 1 1 9 8 9 中 在3 7 5 5 c 0 2 及饱和湿度中的培养箱中培养 2 5 第一极体命运研究 2 5 1 第一极体形态观察 完整的第一极体质膜光滑且胞质均匀 而退化的第一极体多数质膜变 得粗糙 有的甚至消失 胞质呈颗粒状 为验证肉眼观察的可靠性 本实 验特采用p i 染色法 c o s s a r i z z ae ta 1 1 9 9 4 进行对照 即将卵母细胞放入含 有1 0 9 9 m lp i 的m 2 中1 0 m i n 然后在倒置表面落射荧光显微镜下观察 只有那些形态完整不被p i 染色的极体被认为是完整的极体 图1 a b 2 5 2 卵母细胞m 纺锤体与第一极体相对位置的观察 将收集的小鼠c o c 脱去卵丘细胞后 用含有1 0 p g m lh o e c h s t3 3 3 4 2 的m 2 液中处理5 分钟 然后在显微操作系统的倒置表面落射荧光显微镜 下观察卵母细胞m i i 纺锤体与第一极体的相对位置 为便于确定它们之间 的相对位置 用显微操作仪的固定吸管调整卵母细胞位置 让第一极体处 于时钟1 2 点的位置 细胞核与第一极体处于同一平面 以第一极体与卵 母细胞中心的连线和卵母细胞mi i 纺锤体与卵母细胞中心的连线二者形 成的夹角来记录核与第一极体的相对位置 图1 c d e f g h 1 0 山东农业人学坝 研究生论文 2 0 0 4 1 c y t o p l a s m 图1 第一极体的形态j 5 乏其 与卵母细胞纺锤体的相对 位置 a 和b 分别示完整 与退化的第一极体 箭 头 c 和d e 和f g 和h i 和j 为光镜和荧 光镜的照片 c 和i v e 和f g 和h 分别为第一 极体与卵母细胞m i i 纺锤 体间呈0 3 以3 0 9 0 和 9 0 1 8 0 i 和j 为秋水们 素单独处理后分散的染色 体 f i g u r e1p h o i o g r a p h so f m o u s eo o c y t e ss h o w i n g f p bc h a n g e si a m o r p h o l o g ya n dp o s i t i o n s r e l m i v et ot h em i is p i n d l e aa n dbs h o w i n gi n t a c ta n d d e g a n e r a t e df i r s tp o l a r b e d i e s a r r o w s r e s p e c t i v e l y s e e nw i t h i n t e r f e r e n c e c o n t r a s to p t i c s ca n d d e a n d f ga n d h a n d i a n dj a r e t h es a i n e o o c y t e so b s e r v e dw i t h p h a s ec o n t r a s ta n d f i t l o r e s e e n c e r e s p e c t i v e l y c a n d d ea n df a n d g a n dhs h o w i n gf p bi nt h e 0 3 0 0 3 0 9 0 0a n d9 0 1 8 0 0 z o n e r e s p e c t i v e l y a n d1 a n djs h o w i n ga l lo o c y t e 也a th a v eb e e nt r e a t e dw i t h c o c h i c l o ea l o n e w i t h c h r o m o s o m e sd i s p e r s e di n s e v e r a ll o c io v e rt h e 山东农业人学预l 研究生论文 2 0 0 4 2 5 3 卵周围间隙 p v s 的测量 卵母细胞的中心与第一极体的中心的连线记为a b 与e f 与其垂直 的线记为c d 与g h 分别记为卵母细胞的外径和透明带的内径 然后套 用公式p v s a b c d 2 一 e f g h 2 求得卵母细胞与透明带间的间隙 图2 a 仔 萄 乜乡 b 图2 卵周隙的测量 p v s a b c d 2 一 e f g h 2 f i g u r e2t h ee s t i m a t i o no ft h ep v si nr a o u s eo o e y t e s t w ol i n e s a ba n dc d w c r ed r a w n 砒r i g h t a n g l e sa n dt h r o u g ht h ei m a g i n a r ye e t l t e ro ft h eo o c y t e w i t ha bg o i n gt h r o u g ht h ec e n t e ro ff p b t h e p v sw a st h e nc a l c u l a t e db yt h i se q u a t i o n p v s2 a b c d 2 一 e f g h 啦 2 6 卵母细胞的乙醇激活处理与评定 将待处理的小鼠卵母细胞置于5 乙醇的m 2 液中处理5 分钟后 用 m 2 液洗净 再用含有2 m m6 d m a p 的c z b 液洗三次后放入含有5g g m l 6 d m a p 的c z b 液中处理6 小时 6 小时后 在倒置显微镜下观察激活 效果 以卵内出现原核或卵母细胞卵裂作为判别激活的标准 并且每次实 验 只有当对照组卵母细胞无一活化时 实验组数据才有效 2 7m p f 活性的检测 将收集的含有1 5 枚小鼠卵母细胞用收集液洗3 次 后放入1 0 1 a l 收集 液中 然后立即放入 7 0 冰箱中速冻保存直至测活前 测活时 取出样 品后 冻融3 次使细胞裂解 加入2 5 9 lm p f 反应液 2 0 c 水浴反应1 5 m i n 取2 5 i t l 点于w h a t m a np 8 1 强阳离子交换滤纸 1 c m 2 c m 上 7 5 m m o l l 磷 山东农业人学顿j 研究生论 2 0 0 4 酸溶液反复洗3 次 每次2 m i n 最后将滤纸置于含1 0 m l 蒸馏水的液闪瓶 内 用b e c k m a n 液闪计数仪测定c p m 值 o a l l i c a n ie ta 1 1 9 9 7 2 8 实验设计 2 8 1 第一极体的形成与退化 分别在注射h c g 后6 8 1 0 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 和3 2 h 从排卵前 卵泡或输卵管采集体内成熟c o c 部分体内成熟的c o c 在注射h c g 后 1 2 h 后采集后体外老化至h c o 后1 6 2 0 2 4 2 8 和3 2 h 而对于体外成 熟的c o c 分别培养至6 8 t 0 1 2 1 4 1 8 2 2 2 6 3 0 和3 4 h 观察第 一极体的形成与退化时间 2 8 2 体内成熟的c o c 体内外老化过程中第一极体的位置变化 体内老化 在注射h c g 后8 9 1 0 1 1 7 5 1 2 1 5 和1 8 h 分别从即 将排卵的卵泡或输卵管中采集c o c 分别观察第一极体的位置 体外老 化 在注射h c g 后1 2 h 从输卵管采集c o c 后放入c z b 中老化至h c g 后 1 5 和1 8 h 分别观察第一极体的位置 为观察卵丘细胞对第一极体移动的 影响 特将注射h c g 后1 2 h 的c o c 脱去卵丘细胞并在体外老化至1 5 h 和 1 8 h 观察第一极体的位置 2 8 3 体外成熟的c o c 体外老化过程中第一极体的位置变化 注射p m s g4 6 h 后收集g v 期c o c 分别培养至8 1 0 1 2 和1 4 h 观察第一极体的位置 对于培养至1 4 h 的c o c 分别分为带卵丘与不带卵 丘两组在c z b 中老化3 h 和6 h 后观察第一极体的位置 同时为验证脱卵 丘过程对第一极体移动的影响 特将一些c o c 先脱去卵丘细胞 p d o 再 进行培养 2 8 4 体内成熟卵母细胞在体内外老化过程中孤雌激活与m p f 活性变化 2 8 4 1 体内老化 在注射h c g 后1 2 1 8 2 4 3 0 和3 6 h 分别从输卵管中 采集卵母细胞 激活后观察激活率并测定m p f 的活性 2 8 4 2 体外老化 在注射h c g 后1 2 h 从输卵管中采集卵母细胞 分别老 化至h c g 后1 8 2 4 3 0 和3 6 h 并在每个老化时刻点进行激活观察激活 率并测定m p f 的活性 j 2 8 5 体外成熟卵母细胞在体内外老化过程中孤雌激活与m p f 活性变化 将获得的g v 期卵母细胞培养1 4 h 后分别老化2 0 2 6 3 2 和3 8 h 山东农业大学硕卜研究生论文 2 0 0 4 并在每个老化时刻点进行激活观察激活率并测定m p f 的活性 2 9 数据处理 利用s p s s 社会科学统计软件 s p s si n c 处理数据 数据先经过 l s d 转变后用a n o v a 模块进行分析 p u0 5 的比例即第一极体处于0 3 0 0 的比例确呈现出一定的规律 以下是根据该 比例得出的结果 3 2 1 排卵前部分卵母细胞的极体已经发生位移 在注射h c g 后8 h 和9 h 所有的第一极体与卵母细胞mi i 纺锤体相 邻近 即处于0 3 0 0 但在排卵前2 h 即h c g 后1 0 h 时 极体与卵母细胞 mi i 纺锤体相邻近的比例将至7 7 其余的极体分别处于3 0 9 0 0 或 9 0 1 8 0 0 到卵母细胞排出时该比例降到5 6 7 3 2 2 体内外老化过程对第一极体移动的影响 排出的卵母细胞在体内和体外老化过程中 第一极体均发生移动 且 差异不显著 在h c g 后1 5 h 和1 8 h 时体内老化的c o c 与体外老化的c o c 中的第一极体处于o 3 0 0 的比例差异不显著 表3 图4 a 这说明输卵 管的蠕动对第一极体的移动未产生影响 即便卵母细胞放在体外静止的环 境 第一极体仍然发生移动 山东农业人学坝1 t 0 1 究生论文 2 0 0 4 表2 体外成熟的卵母细胞曲 体内外老化中第一极体的形成 j 退化 t a b l e 2f o r m a t i o na n dd e g e n e r a t i o no f f p b i n t h e i nv i t r o m a t u r e do o e y t e s d u r i n g i nv i t r oa g i n g a b c v a l u e sw i t huc o m m o nl e t t e ri ns u p e r s c r i p t sd i dn o td i f f e rs i g n i f i c a n t l yl p 0 0 5 3 2 3 排卵过程对第一极体移动的影响 从h c g 后11 7 5 h 和1 2 h 取得的c o c 的比较来看 排卵前的卵母细 胞中第一极体处于o 一3 0 0 的比例 6 8 8 要明显高于排卵后的卵母细胞中 第一极体处于0 3 0 的比例 5 6 7 二者差异显著 表3 图4 a 这 说明排卵过程对第一极体的移动产生了明显的影响 3 3 体外成熟卵母细胞体外老化过程中第一极体位置的变化 经体外培养成熟的小鼠c o c 在体外老化过程中 第一极体的位置随 着卵母细胞卵龄的增加也逐渐远离卵母细胞m i i 纺锤体 在培养1 4 h 时有 6 5 3 的第一极体与卵母细胞m i i 纺锤体临近 但随着在体外时间的延长 山东农业人学砌 卅究生论义 2 0 0 4 1 极体开始偏离卵母细胞m i i 纺锤体 到培养时恻为2 0 h 时就只用不到2 0 的第一极体与卵母细胞m i i 纺锤体临近 表4 图4 d 嫠 s 营 暑 醢 詈 g 02468l 口1 21 41 6i 82 03 2 h d 啪口o n m a x 州m m l m r f f i m l i i 目1 1 0 f l 图4 体内外成熟的卵母细胞任体内外老化过程中第一檄体的退化 j 消失情批 v v o v v a 代表体内 成熟卵母细胞柱体内老化 v v o v t a 代表体内成熟卵母细胞钔 体外老化 v t o v t a 代表体外成熟卵 母细胞在体外老化 最大核成熟 为第一极体排出率最高时的时刻 如体内为h c g 后l oh 体外 为培养1 4 h a 图为第一极体形成图 b 图为第一极体退化幽 f i g u r e4d e g e n e r a t i o na n dd i s a p p e a r a n c eo f t h ef p bi nt h ei nv i v oa n di nv i t r om a t u r e do o c 3 一t e sd u r i n g i nv i v oo ri nv i t r oa g i n gv v o v v a i nv i v om a t u r e do o e y t e sd u r i n gi nv i v oa g i n g v v o v t a i nv i v o m a t u r e do o e y t e sd u r i n gi nv i t r oa g i n g v t o v t a i nv i t r om m 删o o c y t e sd u r i n gi nv i t r oa g l n g m a x i m a l n u c l e a rm a t u r a t i o n t h et i m ew h e nt h ep e r c e n t a g e so fo o c y t e sw i t hf p br e a c h e dm a x i m u m e1 0h p o s th c gi nv i v oa n d1 4h c u l t u r ei nv i t r o 3 4 体内外成熟卵母细胞中的第一极体移动的比较 对于体内成熟的卵母细胞 在体内外老化之前 处于3 0 9 0 的比例要 高于处于9 0 1 8 0 0 的比例 即h c g 后1 0 和1 2 h 但老化后 即h c g 后 1 5 和1 8 h 第一极体随机地处于这两个区域 表3 图4 b c 与体内成 熟卵母细胞相比 体外成熟的卵母细胞在老化过程中第一极体处于3 0 9 0 0 与9 0 1 8 0 0 这两个区域的比例较有规律 在每个老化时刻处于3 0 9 0 的比 例要高于处于9 0 1 8 0 的比例 表4 图4 e f 另外 在体外老化过程中 体外成熟的卵母细胞要比体