（农药学专业论文）10％顶孢霉acremonium+hansfordii可湿性粉剂加工工艺及药效评价.pdf

i r f 坐鲨些一蚴f 煳煳 量曼量舅舅皇鼍皇曼皇篁蔓曼曼皇曼墨舅置甍曼邕皇皇曼曼篁罾皇鼍量鼍置 v 了 4 通过对1 0 顶孢霉可湿性粉剂中试产品的质量检测及贮存稳定性进行检 测 可得1 0 顶孢霉可湿性粉剂的含孢量为5 1 1 1 0 8 个儋 含水量1 8 7 孢子 萌发率为9 1 6 7 悬浮率7 8 5 2 润湿时间为1 3 5 1 2 s 1 0 顶孢霉可湿性粉剂 在4 c 1 5 c 2 5 2 及3 5 c t 贮存9 0 天后其孢子萌发率分别为7 1 9 1 6 2 8 8 6 3 4 3 和2 4 5 3 关键词 顶孢霉可湿性粉剂田间药效试验液相发酵固相发酵中试产品 l l 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 s u m m a r y a h y l 似c r e m o n i u mh a n s f o r d i i w a si s o l a t e df r o mm y z u sp e r s i c a es u l z e rw h i c h n a t u r a l l yi n f e c t e di ny u z h o n gc o u n t yo fh u a n g j i av i l l a g ei ng a n s up r o v i n c eb yg a n s u a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y i t i s d e u t e r o m y c o t i n a h y p h o m y c e t e s m o n i l i a l e sa n d m o l i l i a c e a e a n di th a sh i g hi n f e c t i v i t yt oa p h i d s f o rr e s e a r c h i n ga n dd e v e l o p i n g e n t o m o g e n o u sf u n g im i c r o b i a lp e s t i c i d e sw h i c hm e e tt h ec l i m a t ec o n d i t i o no fg a n s u t h i sp a p e rw a ss t u d i e do nt h eo p t i m i z a t i o no f10 a h y lw pf o r m u l aa n dm i d d l ep i l o t p r o d u c t i o np r o c e s s t h es t u d yo nt h ee f f i c a c yo ft h em i d d l ep i l o tp r o d u c ti n d o o ra n d i nt h ef l i e dw a st h eb a s i st h e o r yf o ru s et h ea h y l t h er e s u l t sw e r e 鹊f o l l o w s 1 s t u d yo nt o x i c i t yt e s ti n d o o ra n df i e l dt r i a l st oa p h i d s w h i c hw e r ee f f e c t e db y a h y lw p t h er e s u l t ss h o w e dw h e nt h ed i l u t i o nm u l t i p l eo ft h ea h y lw pw e r e1 0 0 t i m e sa n d3 0 0t i m e s t h em o r t a l i t yr a t e sw e r e6 8 2 6 a n d5 8 9 3 t o a p h i d s r e s p e c t i v e l ya f t e r9 6 ha tt o x i c i t yt e s ti n d o o r t h em o r t a l i t yr a t e so fa p h i d sw e r e 4 6 3 4 a n d4 1 3 5 r e s p e c t i v e l ya f t e r5 d a n dt h em o r t a l i t yr a t e sw e r e7 2 1 4 a n d 6 6 4 1 r e s p e c t i v e l ya f t e r10 da tf i e l dt r i a l 2 t h r o u g h t h e o p t i m i z a t i o ns t u d y o nt h e a h y lf u n g u sl i q u i d c u l t u r e t e c h n o l o g yi nf e r m e n t o rt h ei n d e xa n dt h ev a r i a t i o nt e n d e n c yo ft h em y c e l i u mc o n t e n t a n ds p o r u l a t i o nq u a n t i t yw a sg o t i nt h ef e r m e n t o rt h ea h y lm y c e l i u mc o n t e n tw a s c o n t i n u o u s l yi n c r e a s e da st h ec u l t u r et i m ep a s s i n gb y t h em y c e l i u mc o n t e n tg o tt h e h i g l l 髓t a t2 4 h 0 4 5 7 0 9 m l a n d4 4 h o 5 2 8 3 9 m l s p o r u l a t i o nq u a n t i t yi st h e h i g h e s t 1 2 0 x 10 6 u n i v m l a t3 2 h t h ep hv o l u ew a st h eh i g h e s t 6 18 a t4 ha n dt h e l o w e s t 4 8 0 a t3 2 h t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s tt i m eo fa h y ll i q u i dm e d i u m b e i n gk e p ti nf e m e n t o rw a sf r o m2 8 ht o3 6 h 3 b yu s i n gf r e s h b o x s t e r i l i z ew h i t ec l o t ha n dc l i n gf i l m 勰t h r e ek i n d so fs o l i d f e r m e n tc o n d i t i o n st h ec o n i d i aw e r eg o t t h eq u a l i t yi n s p e c t i o nr e s u l t ss h o w s t h e l a r g e s tv o l u m eo fc o n i d i aw a sg o tb yu s i n gf r e s h b o xt h a tw a s8 4 2 8 4 m g ga n dt h e g e r m i n a t i o nr a t ew a s9 1 5 2 b u tt h es p o r ec o n t e n tw h i c hw a s5 2 5 1 0 8u n i t ga n d t h eg e r m i n a t i o nr a t ew h i c hw a s9 1 5 2 i ns t e r i l i z ew h i t ec l o t hf e r m e n tw e r eb e t t e r i i i i v 甘肃农业大学2 0 l0 届硕士学位论丈 目录 摘要 i s u m m a r y i l l 目录 v 第一章文献综述 1 1 1 顶孢霉属研究概况 1 1 1 1 顶孢霉属研究现状 1 1 1 1 1 分布与寄主 1 1 1 1 2 顶孢霉菌的应用 1 1 1 2 顶孢霉a h y l 菌株研究进展 2 1 1 2 1 菌株形态特征 2 1 1 2 2 温湿度对菌株生长和产孢的影响 2 1 1 2 3 营养对菌株生长和产孢的影响 2 1 1 2 4 抗逆性 3 1 1 2 5 不同寄主及使用剂量对顶孢霉致病力的影响 3 1 1 2 6 项孢霉对寄主的侵染途径的研究 4 1 1 3 项孢霉菌株加工工艺研究及剂型加工 5 1 2 真菌分生孢子制剂研究进展 5 1 2 1 真菌分生孢子制剂类型 5 1 2 2 真菌发酵生产及孢子粉收获研究 7 1 2 2 1 真菌发酵生产研究 一7 1 2 2 2 两相发酵工艺中的液体发酵条件 8 1 2 2 3 两相发酵工艺中的固态发酵技术 1 0 1 2 3 虫生真菌孢子粉收获及其制剂贮存 1 2 1 2 3 1 虫生真菌孢子粉的收获 1 2 1 2 3 2 孢子粉制剂贮存 1 4 1 3 本试验的目的与意义 16 第二章1 0 项孢霉可湿性粉剂药效评价 1 8 2 1 材料与方法 18 2 1 1 供试材料 18 2 1 1 1 供试昆虫 1 8 2 1 1 2 供试药剂 18 2 1 2 室内毒力测定方法 1 8 2 1 3 田间药效试验方法 1 9 2 1 3 1 试验方法 19 2 1 3 2 调查方法 19 v 甘肃农业大学2 0 10 届 石页士学住论丈 置 鼍量皇甚 i i ii ii 鼍 2 1 4 数据统计分析 2 0 2 2 结果与分析 2 0 2 2 11 0 顶孢霉可湿性粉剂对菜蚜的室内生测结果 2 0 2 2 21 0 顶孢霉可湿性粉剂对甘蓝蚜的田间试验结果 2 2 2 3 结论与讨论 2 3 第三章顶孢霉菌株液体发酵工艺优化 2 5 3 1 材料和方法 2 5 3 1 1 供试材料 2 5 3 1 1 1 供试菌株 2 5 3 1 1 2 培养基 2 5 3 1 2 试验方法 2 6 3 1 2 1 菌种活化 2 6 3 1 2 2 一级种子液 2 6 3 1 2 3 二级种子液 2 6 3 1 2 4 三级放大发酵 2 6 3 1 2 5 发酵罐培养过程 2 6 3 2 液体发酵指标测定 2 7 3 2 1 菌丝含量测定 2 7 3 2 2 含孢量测定 2 7 3 2 3p h 值测定 2 7 3 3 数据处理 2 8 3 4 结果与分析 2 8 3 4 1 发酵罐中项孢霉培养液的产孢量 菌丝含量及p h 值变化特征 2 8 3 4 2 发酵罐中顶孢霉培养液的产孢量与培养时间关系 2 9 3 4 3 发酵罐中顶孢霉培养液的菌丝含量与培养时间关系 3 0 3 4 4 发酵罐中顶孢霉培养液的r h 值与培养时间关系 3 l 3 4 4 不同因素对产孢量影响的极差分析结果 3 1 3 5 结论与讨论 3 2 第四章项孢霉可湿性粉剂的固相发酵条件优化 3 3 4 1 材料与方法 一3 3 4 1 1 供试材料 3 3 4 1 2 试验方法 3 3 4 1 2 1 顶孢霉孢子粉的固相发酵条件优化 3 3 4 1 2 2 数据处理 3 5 4 2 结果与分析 3 5 4 2 1 不同固相发酵条件下项孢霉分生孢子的指标检测 3 5 4 2 1 1 顶孢霉菌株的生长情况 3 5 4 2 2 2 项孢霉分生孢子的质量检测 3 5 v i 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论丈 4 3 结论与讨论 3 7 第五章1 0 项孢霉可湿性粉剂中试工艺及产品质量检测 3 9 5 1 材料与方法 3 9 5 1 1 试验材料 3 9 5 1 1 11 0 项孢霉菌株分生孢子粉的制备 3 9 5 1 1 2 供试试剂 3 9 5 1 2 试验方法 4 0 5 1 2 11 0 项孢霉可湿性粉剂质量检测方法 4 0 5 1 2 3 数据处理 4 0 5 1 2 41 0 顶孢霉可湿性粉剂的中试产品加工工艺流程 4 1 5 2 结果与分析 4 2 5 2 1 顶孢霉可湿性粉剂中试产品的加工工艺 4 2 5 2 1 1 菌种活化 4 2 5 2 1 2 一级种子液 4 2 5 2 1 3 二级种子液 4 2 5 2 1 4 三级放大发酵 4 2 5 2 1 5 固相发酵产孢 4 2 5 2 1 6 孢子粉收获 4 3 5 2 1 71 0 顶孢霉可湿性粉剂的制备 4 3 5 2 21o 顶孢霉可湿性粉剂质量检测 一4 3 5 2 31 0 顶孢霉可湿性粉剂不同温度下贮存稳定性检验 4 4 5 3 结论与讨论 4 5 第六章结论与讨论 4 6 6 1 主要结论 4 6 6 2 问题及讨论 4 7 6 3 创新点 4 8 参考文献 4 9 致谢 5 6 附录 5 7 作者简介 5 8 导师简介 5 9 独创性声明 6 0 v i i 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论丈 第一章文献综述 i i 顶孢霉属研究概况 i i i 顶孢霉属研究现状 i i i 1 分布与寄主 顶孢霉属 a c r e m o n i u ml i n ke xf r i e s 属半知菌亚门 d e u t e r o m y c o t i n a 丝孢 纲 h y p h o m y c e t e s 丛梗孢目 m o n i l i a l e s 淡色菌科 m o l i l i a c e a e 全世界共1 0 5 种 分布广泛 仅极少数为虫生菌 其中幼虫顶孢霉似c h l a r v a r u m 寄生于小蛾类 幼虫 仅见于斯里兰卡 樊美珍等曾从陕西青杨天牛中分离出枝顶孢霉 a c h c h y s o g e n u m 还有从介壳虫上发现锡兰顶孢霉 a c h z e y l a n i c u m 有人在巴西 的一种蝉上也分离 w a c h r u t i l u m u 捌 1 1 1 2 顶孢霉菌的应用 1 1 121 医药应用研究 樊美珍 3 等又从古尼虫草小孢变种c o r d y c e p s g u n n i iv a r m i n o r 中分离到交 织顶孢霉a c r e m o n i u m i mp l i c a t u m m i l l e r e t a l g a m s 彭凡等 4 进行药理筛选时发现 其发酵菌丝体水提物经硅胶柱色谱分离部分具有保肝活性 在医疗和保健方面具 有较强活性 现已被开发成一种保健食品 卫食健字2 0 0 0 第0 2 1 5 号 1 9 9 7 年以 来 龙雁华 5 从实际服用人群的反馈信息表明交织顶孢霉对乙型肝炎 丙型肝炎 肾炎及肿瘤患者的辅助治疗等方面有一定作用 1 i 1 2 2 农药应用研究 樊美珍自林间的青杨天牛越冬幼虫虫尸上分离出枝顶孢霉 对该菌的形态 生物学特性和对青杨天牛毒力进行生物测定和田间防治试验 引起死亡率为 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 舞i i 墨 i 罩置 i i i ii i i 鼍曼舅舅曼曼皂曼曼曼曼罾皇皇曼皇孽 4 8 7 2 6 另据马桂珍 7 1 和章靖 8 1 报道的顶孢霉属中有几个种能捕食根结线虫 宋丽雯 9 研究证明顶孢霉菌株对菜青虫 桃蚜 苜蓿斑蚜 豆无网长管蚜和粘虫 5 种试虫接种而进行了生物测定 结果表明项孢霉对以上5 种昆虫都具有一定的 杀虫活性 且累计死亡率分别都超过7 0 1 1 2 顶孢霉a h y l 菌株研究进展 1 1 2 1 菌株形态特征 本文研究所用菌株是从甘肃省榆中县黄家庄自然感病的桃蚜幼虫分离获得 的 经鉴定为顶孢霉菌 该菌无昆虫致病记载 顶孢霉菌的主要特征是在p d a 培养基上菌落绒毛状 呈白色后变成桃红色 潮湿 有刺激性气味 菌落生长较 快 在2 5 下 l o d 直径5 5 b e r n 背面黄色 土黄色至棕色 分生孢子梗稀 缺 产孢细胞直立 单生 直接着生于菌丝细胞上 产孢细胞透明 无色 光滑 多数长9 肛3 0 2 炉 基部膨大渐尖呈长瓶形 宽2 1 5 4 1 t m 基部有隔膜 分生 孢子纺锤形 光滑透明 2 o 3 2 x 6 5 9 8 p m l b2 7 4 3 多形成粘孢团 少数 形成干燥的短链 大量孢子聚集产生微弱的红棕色 由安徽农业大学微生物防 治省重点试验室鉴定 1 1 2 2 温湿度对菌株生长和产孢的影响 温度是影响昆虫病原真菌生长和繁殖的重要因子之一 张海英研究证明i l z j 顶孢霉分生孢子萌发的最适温湿度组合为温度2 0 湿度1 0 0 最适生长和产 孢的温度为2 0 在3 0 与3 5 下菌落生长缓慢 并且3 0 产孢量极少 3 5 几乎不产孢 表明项孢霉不适合高温生长 产孢的最高温度要不超过3 0 由 此可知 顶孢霉适宜生长的温度范围是1 5 2 5 高温与低温比较 低温更适 合生长与产孢 与其在春秋季流行的现象相一致 1 1 2 3 营养对菌株生长和产孢的影响 宋丽型9 1 试验证明项孢霉对营养的要求不是很严格 碳源中葡萄糖 果糖 蔗糖 淀粉 甘露醇 肌醇 甘油及麦芽糖均可利用 氮源中蛋白胨 硝酸钠 2 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 硝酸钾 氯化铵 硝酸铵及尿素等均可利用 都有利于菌丝生长和产孢 在5 种培养基中 p d a 淀粉琼脂 查彼氏 s d a y 和s e a 培养基 以葡萄糖4 0 9 l 酵母浸出粉1 0 9 l 蛋白胨1 0 9 l 和琼脂2 0 l 的s d a y 固体培养基 顶孢霉的 生长最好 其次为葡萄糖4 0 9 l 酵母浸出粉1 0 9 l 蛋白胨1 0 9 l 鸡蛋5 个 l 和琼脂2 0 l 的s e a 固体培养基 1 1 2 4 抗逆性 紫外照射对大多数真菌孢子都具有一定的杀伤力 且不同菌种或同一菌种的 不同株之间抗紫外辐射的能力存在一定的差异 张海英 lo 测定了不同紫外线照射 时间处理下顶孢霉分生孢子的萌发抑制率 经测定不同紫外线照射时间处理下顶 孢霉分生孢子的萌发具有显著的差异性 经紫外线照射5 m i n 的分生孢子 萌发 率比对照降低了2 5 2 随着照射时间的不断延长 分生孢子的萌发率也逐渐降 低 照射1 0 m i n 1 5 m i n 后 分生孢子的萌发率分别为5 7 2 3 3 7 2 4 明显低 于对照的9 7 6 6 当照射2 0 m i n 后 4 8 h 的萌发率仅为1 2 2 2 l 周后检查 萌 发率仍未增加 照射2 5 m i n 的 4 8 h 后的萌发率为零 l 周后检查 仍未见有孢 子萌发 说明紫外线对分生孢子具有很强的杀伤作用 目前 紫外照射对真菌孢子的杀伤作用己严重影响到昆虫病原真菌在生产中 的应用 因此 人们试图通过紫外照射来选育抗紫外线强的菌株或筛选适宜的紫 外保护剂 以提高菌株的抗辐射能力 但有关项孢霉在这方面的研究还很少报道 因此需加强对该菌紫外辐射菌株的选育及紫外保护剂筛选的研究 1 1 2 5 不同寄主及使用剂量对项孢霉致病力的影响 致病性是衡量菌株生物防治潜力的重要指标 也是筛选优良菌种的基本依 据 昆虫病原真菌对寄主的致病力受温度 湿度 菌株来源 孢子剂量以及不同 寄主种类等多种因子的影响 其中单独某个因子并不能决定致病力的强弱 尽管昆虫病原真菌的寄主范围广泛 但寄主仍是影响菌株致病力的重要因子 之一 顶孢霉菌同一菌株对不同的寄主或同一寄主的不同虫龄其致病力有很大的 差异 据宋丽雯试验证明 9 采用 孢子浴 法将项孢霉菌株对桃蚜 苜蓿斑蚜 豆无网长管蚜 粘虫和菜青虫5 种试虫接种而进行了生物测定 结果表明 对桃 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论丈 蚜的毒力最强 最终累计死亡率为8 4 0 7 其次是豆无网长管蚜 苜蓿斑蚜和 菜青虫 其最终累计死亡率分别为8 3 5 0 7 8 1 8 和7 3 3 对粘虫的毒力最 差 最终累计死亡率仅为6 3 3 由模型参数值估计出的顶孢霉对5 种试虫的毒 力指标的半致死剂量 l d s o 中桃蚜的l d 5 0 为最小 接种4 5 d 内的l d 5 0 分别为 1 3 1 2 3 4 9 2 3 个孢子 m m 2 而粘虫的l d 5 0 较大 分别为1 1 6 5 3 3 4 9 3 4 9 个孢 子 m m 2 1 1 2 6 顶孢霉对寄主的侵染途径的研究 据据宋丽雯研究证明 9 采用石蜡切片和扫描电镜技术 对项孢霉侵染桃蚜过 程的组织病理学进行了研究 结果显示了顶孢霉分生孢子首先附着于桃蚜体表 在温湿度适宜的条件下 接种2 0 2 4 h 后分生孢子在寄主体表萌发 形成芽管后 侵入体内 大约在3 6 h 内基本完成 在寄主体内菌体以酵母体的形式进行繁殖 形成菌丝段并产生菌丝穿透体壁 再次产生孢子 重新侵染其它寄主昆虫 菜青虫感染顶孢霉后 由于菌丝在昆虫体内的大量繁殖 消耗了菜青虫体内 的部分蛋白质或者破坏了合成蛋白质的组织和器官 因而使感病的3 龄菜青虫体 内蛋白质含量降低 同时 顶孢霉的入侵破坏了菜青虫体内的保护酶系统 s o d 酶活性表现为低于对照 一直维持在较低水平 p o d 酶活性表现为接种后2 h 高 于对照 随后随时间的推移而升高 最后又有降低的趋势 c a t 活力表现为在 接种项孢霉处理后的第2 h 其体内c a t 活力与对照组的酶活性基本一致 没有 明显差异 但从处理后的第4 h 开始 c a t 活力明显下降 l 项孢霉菌株毒素提取物对甘蓝蚜 菜青虫 小菜蛾和粘虫4 种昆虫的毒杀活 性测定结果表明 不同昆虫 不同溶剂的粗提物活性存在较大差异 其中以石油 醚浸提物的活性最高 对4 种昆虫的死亡率分别为3 6 4 7 3 5 8 4 2 9 8 0 1 1 1 l 通过研究营养条件和培养方式对顶孢霉生长的影响 筛选出了有利于顶孢霉 液体生长的碳 氮源 不同c n 及液体发酵最适终点 项孢霉最佳液体培养基 为 木糖2 0 l 尿素1 7 2 l m g s o 7 h 2 0 0 5g l k c l 0 5g l f e s o 一 7 h 2 0 0 1 g l k h 2 p 0 4 0 6 5g l 在振荡条件下 2 0 c 1 3 0 r m i n 接种后 7 d 顶孢霉 菌的菌丝生长和产孢最有利 4 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 1 1 3 顶孢霉菌株加工工艺研究及剂型加工 据张莉 2 研究证明 顶孢霉菌株以及斜面培养基可采用麦麸培养基 培养六 天后 接种马铃薯 糖液体培养基振荡培养 2 5 士1 1 2 0 r m i n 3 天作为固体发 酵的种子液 种子液接入低值陈米培养介质中 保湿培养8 天后可收集孢子粉 以低值陈米生产孢子粉产孢量大 活孢率高 并且陈米可重复利用 故经济实惠 在剂型加工方面 也研制出了1 0 顶孢霉分生孢子可湿性粉剂 田大伟 1 5 等研究并最终确定了顶孢霉孢子乳悬剂和可湿性粉剂的配方 其 中孢子乳悬剂以姜油为最佳的溶剂油 吐温 8 0 与p o 1 0 的混合剂为最佳的乳化 剂 o 3 润湿剂采用0 1 的十二烷基硫酸钠 稳定剂采用0 3 的羧甲基纤 维素钠 采用0 3 的腐植酸作为紫外保护剂 抗生素选用硫酸链霉素 其适宜 浓度为0 2 5 选用乙二醇作为防冻剂 比例为3 顶孢霉可湿性粉剂的最终 配方为 润湿剂为十二烷基硫酸钠 1 分散剂为木质素磺酸钠 1 5 粘 着剂为黄原胶 o 0 5 孢子萌发促进剂为硫酸锌 o 1 紫外保护剂为腐植酸 0 1 抗生素为硫酸链霉素 0 2 5 稳定剂为羧甲基纤维素钠 0 3 载体为硅藻土 补1 0 0 除此之外 该试验还通过对顶孢霉孢子乳悬剂和可湿 性粉剂的室内生测得到两种药剂对甘蓝蚜致死率明显高于粘虫的 说明项孢霉菌 制剂对半翅目害虫的作用高效 而对鳞翅目害虫效果不佳 并且顶孢霉乳悬剂的 杀蚜效果比可湿性粉剂的效果好 从剂型方面考虑 顶孢霉孢子乳悬剂略好于可 湿性粉剂 1 2 真菌分生孢子制剂研究进展 1 2 1 真菌分生孢子制剂类型 近1 0 多年来 曾先后有过孢子乳悬剂 颗粒剂 可湿性粉剂 油剂 微胶 囊剂等多种剂型的研究陋19 1 但因贮存稳定性问题困扰一直未能正式登记注册 油剂油剂是将分生孢子加入矿物油或植物油中而制成的油悬液 油剂可以 降低孢子萌发和侵染对环境湿度的依赖而提高田间防效 在蝗虫防治中被广泛应 用 我国在白僵菌防治松毛虫的实践中也曾研制和使用过类似的油剂 1 9 2 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 鼍皇舅舅量曼曼曼邑量量舅量置皇量量量量量皇量量量曼曼 一 i i i i 一 一一i i 一 i 量曼量曼 粉剂分生孢子粉剂是直接将孢子粉与粉状载体混合的产品形式 填充料包 括滑石粉 黄土或草炭灰等 用于封垛或田间喷粉 在我国东北地区曾用白僵菌 粉剂防治玉米螟和大豆食心虫 2 2 1 可湿性粉剂白僵菌可湿性孢子粉剂是将分生孢子粉与粉状载体及润湿剂 混合而成的一种剂型 可以直接用水稀释喷雾使用 张爱文等 2 3 1 曾在辽宁进行 白僵菌可湿性粉剂防治的田间试验 效果良好 该剂型和乳悬剂是目前国外已注 册真菌制剂产品的主流形式 颗粒剂颗粒剂是指分生孢子与载体混合搅拌而成的一种颗粒状制剂 将原 菌粉吸入过筛的炉渣或沙子中即可得到简单的颗粒剂 s m i t l l 2 4 在液化的菜籽油 2 5 下固化 中加入昆虫信息素和白僵菌孢子粉 用注射器将混合液注入含 7 0 酒精的容器 5 i o c 中 制成直径为2 5 6 6 r a m 的颗粒剂 用于防治大谷 蠹 效果较好 但所加信息素对孢子萌发有轻微抑制作用 混配剂混配剂是指将分生孢子粉与农药在适宜的载体上按一定的比例混 合而成的制剂 混配剂可以充分发挥白僵菌与其它杀虫成分的协同作用 2 蜘 达 到减少化学杀虫剂的目的 乳悬剂乳悬剂是指将分生孢子悬浮在有矿物油或植物油与乳化剂等助剂 组成的乳油中的制剂形式 用水稀释喷雾 提高孢子附着率 可以以惰性矿物油 作为球孢白僵菌制剂的主载体 辅以生物学相容的乳化剂 防紫外保护剂和悬浮 稳定剂配制成孢子悬浮剂 该制剂在田间试验中表现出良好效果 有效控蚜期达 3 4 周 2 6 翊 在实际运用中 真菌分生孢子制剂大多采用粉剂形式 有效成分含量偏低 体积较大 给运输 贮存及使用带来不便 田间菌粉用量大 附着力差 防治效 果不稳定 2 8 1 因此 针对叶面害虫的菌剂开发应向标准化的高纯度孢子制剂方 向发展 田间应用应向超低容量喷雾的油剂或常规喷雾的乳悬剂方向发展 f 2 9 3 0 0 在白僵菌乳悬剂和油剂等液体制剂的研制中 生物学相容的乳化剂或载体油 的筛选至关重要 汤坚等 3 1 1 试验用适当载体可以明显提高白僵菌贮存的稳定性 m o o r e 等 3 2 研究黄绿绿僵菌分生孢子油剂时 也发现花生油等溶剂油对孢子活性 影响小 李农昌等 3 3 在研制油剂时可以发现不同的溶剂油对白僵菌的储存期有 6 甘肃衣业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 e li i 一 i i h h 毫曼曼皇曼皇璺皇曼曼曼蔓皇曼皇曼量 不同的影响 因此 孢子所在的载体对制剂的研制非常重要 湖北省曾研制出一 种主要是具有乳化性能的中性皂化材料组成的润湿剂 e s 8 7 可用于菌剂的常 量与低容量喷雾 由于这种润湿剂与乳化剂同样有效 且成本低原料广 所以更 便于推广使用 3 4 1 w r a i g h t c h a n d l e r 3 5 开发了以醇烷氧基化合物为乳化剂的 白僵菌孢子乳悬剂 1 2 2 真菌发酵生产及孢子粉收获研究 1 2 2 1 真菌发酵生产研究 在真菌杀虫剂的工艺要素中 侵染体的发酵生产工艺十分关键 如气生分生 孢子粉 孢子粉 是配制孢子油剂 孢子悬乳剂及孢子可湿性粉剂等各类孢子制剂 的有效成分 其纯度和质量直接关系到孢子制剂的质量 货架寿命及田闾应用效 果 迄今为止 虫生真菌的大量生产基本上采用液体发酵 固体发酵和固液两相 发酵三种方式 3 6 如 如何提高真菌类制剂在常温下的储藏期即货架寿命 是目前 限制杀虫真菌制剂产业化的重要因素 3 引 生防真菌最有效的侵染体是虫尸体表 产生的气生分生孢子 只有固体发酵能使菌丝体在其基质表面产生与天然侵染体 相似的气生分生孢子 两相发酵工艺正是基于此而设计 此法最大的优点是能充 分利用液体发酵和固体培养的长处 使真菌最大限度地利用液体发酵快速生产大 量菌丝或芽生孢子 然后再转移到固相基质表面使其产生最接近自然接种体形态 的气生分生孢子 目前 两相发酵法被广泛用于球孢白僵菌高纯度孢子粉的生产 3 9 1 它的最大优点是能充分结合液体培养和固体培养的长处 使真菌通过液相 快速发酵大量菌丝及芽生孢子 然后转移到固体营养或惰性基质上发酵 产生类 似于自然接种体形态的气生分生孢子 4 0 4 1 1 然后经旋风将孢子与固体基质分离收 集纯孢粉 国内外的技术研发现状表明 丝孢类生防真菌孢子粉的两相发酵法生产工艺 在原理上是成熟的 过去的3 0 年里 我国科技工作者成功地改进了传统的双相 发酵技术 并应用于生产球孢白僵菌分生孢子粉来防治林业和农业害虫 其技术 改进内容包括生产过程的机械化和使用来源广 价格低的生长基质的选择 4 2 6 1 改进的双相发酵技术使大量生产优质纯孢粉的技术变得简单易行 成本降低并且 7 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 曼i i ii i i 皇曼曼皇皇曼鼍曼 生产安全 国家 八五 科技攻关期间 对白僵菌生产的固液两相工艺进行了规 范化研究 4 丌 进一步优化了工艺参数和发酵条件 确立了规范化生产工艺流程 和配套机械 同时使生产周期进一步缩短 大大降低了生产成本 但发酵后期仍 存在 半敞开式培养 这一共同弱点 4 引 总之 目前国内外白僵菌工业生产的 发酵工艺主要存在的问题是 1 规模化大量生产与纯培养之间的矛盾 2 固体 培养过程条件控制粗放 且通常为半敞开式培养 使杂菌污染和环境粉尘污染等 问题未能彻底得到解决 作为一种理想的真菌杀虫剂的生产工艺 应具备高效性 配套性 稳定性 可控性 可规模化等特点 而现有的固液两相工艺离此目标仍有很大距离 要实 现上述目标 固相发酵反应器的突破是关键 现有的固相发酵罐或相关设备一般 是为酵母及曲种生产而设计的全封闭金属结构 不透光 不适合用于生产丝孢类 生防真菌的气生孢子粉 因此 缺乏适用的固相发酵产孢技术装备是生防真菌孢 子粉生产效率低 成本高的主要原因 也是制约生防真菌制剂产业化的关键因素 其次 固相基质的选择既关系到生产成本 更关系到孢子粉的质量 我国长 期推荐使用的固相基质是麦鼓与米糠的混合物 虽然原料易得 但很难生产出高 纯度的孢子粉 主要原因在于麦鼓 米糠中含有大量微尘 旋风收孢设备无法将 其排除 所获产物实际上是孢子粉与这些微尘的混合物 这些微尘具天然粘性 超 细淀粉粒 在孢子制剂中易使孢子粘连而不易分散 以致田间施用时堵塞喷头 其它的固相基质 国外甚至有提出利用植物废弃物如树叶等 4 9 a l v e s p e r e i r a 1 5 0 1 曾用稻米作基质在耐高温可灭菌的聚丙烯袋中培养球孢白僵菌 培养物用振 动筛将孢子粉筛出 此方法生产孢子粉的关键是稻米熟化度和含水量的控制 适 宜的熟化度有利于水分分布均匀 除大米之外 大麦也可做为生防真菌孢子粉的 生产基质 5 l 5 3 1 而上述固体基质的接种体既可是菌丝种子液 也可是孢子粉本身 用稻米 大麦等谷物作为固相发酵基质的最大好处是孢子粉易于收获并达到很高 的纯度 因此 目前国外建立的孢子粉生产工艺多是基于此类谷物基质 并专门 开发了与此配套的收孢设备 1 2 2 2 两相发酵工艺中的液体发酵条件 两相发酵的基本原理是利用液体发酵快速生产大量的菌丝体或芽生孢子 再 8 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 转到固体营养或惰性基质上使其产生最接近自然接种体形态的气生分生孢子 该 工艺克服了单纯液相发酵生产的芽生孢子稳定性差等缺点 最大限度地利用了固 体表面上产生气生分生孢子的优点 微生物发酵生产的水平除了要具有最基本的 菌种生产性能和适合的培养基以外 还需要最佳的环境条件才能使其生产能力充 分表现出来 1 2 221 温度 微生物的生长实际是生物体的一系列生物化学反应和酶反应的有机组合 而 温度是影响这些反应的主要因素 在用链霉素发酵生产四环素时 会同时产生金 霉素 若培养温度低于3 0 时 金霉素产量增加 随着温度的提高 四环素的 产量增加 当温度到达3 5 c 金霉素的生产几乎停止 仅产生四环烈5 4 1 在整 个培养过程中 各个发酵阶段的最适温度也会不同 如青霉素发酵过程如果最初 5h 维持3 0 6 3 5 h 维持2 5 3 6 8 5 h 维持2 0 最后4 0 h 再升到2 5 采 用这种变温培养后比2 5 恒温培养的青霉素产量提高1 0 7 1 2 222p h 值 微生物的发育增殖以及各种能量代谢的化学活性等 都要受p h 值的影响 特别是在工业发酵过程中 p h 值会直接影响菌体的生长和目的产物的积累 苏 云金芽孢杆菌芽孢萌发率在p h 为7 0 时最高 当p h 值小于6 5 或大于8 0 时 萌发率均在4 0 以下 如果培养基p h 值不合适 还会降低了毒素产量 甚至完 全不产生伴胞晶体毒烈5 5 在发酵过程中 菌体会产生一些酸碱物质导致发酵液的p h 变化 为保持最 适p h 可以采用补料来调节 在四环素 土霉素发酵生产中采用补加氨水的方法 稳定发酵液的p h 值在一定范围 提高发酵单位 除了补料控制p h 外 还可以 在培养基中加入一些生理酸性或生理碱性的物质 如 n h 4 2 s 0 4 或n a n o a 此外 还可以加入一些具有缓冲能力的盐类和c a c 0 3 1 2 223 溶解氧 溶解氧对于好气性微生物发酵来说是限制性的重要因素 特别是对菌体生长 9 甘肃农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 迅速的液体深层发酵来说 对氧的供应要求更高 据报道 当溶氧浓度低于2 5 饱和浓度时候 头孢菌c 的产出将显著下降 其要求较高的氧传递率 以维持 较高的溶解氧 一般要求发酵液搅拌功率在4 k w m 3 5 6 另外对于富含蛋白的培 养基 会产生大量的气泡 降低氧溶解的比例 造成无菌空气的浪费 采用机械 消泡装置和化学消泡剂对泡沫控制 能改善培养基中的氧的溶解度 最近研究表 明能通过网状通气管改进的气升式反应器 极大提高了氧气的传送速率并降低了 剪切力 苏云金素产量有较大提耐5 7 1 s h i b a i 等通过一系列研究提出了通气的重要性 发现枯草杆菌发酵生产肌苷 时 通风不仅起到供氧的作用 还具有降低培养基c 0 2 分压的作用 培养体系 的高c 0 2 分压对肌苷发酵有抑制作用 即使在供氧充分条件下 若通气量小 肌苷的积累同样受到抑制 5 8 1 1 2 224 水 水是培养基的主要组成成分 它既是构成茵体细胞的主要成分 又是一切营 养物质传递的介质 所以说水的质量对微生物的生长繁殖和产物合成有很重要的 作用 生产中使用的水有深井水 自来水 地表水 5 9 1 1 2 225 消泡剂 工业发酵中常用一些消沫剂消除发酵中产生的泡沫 防止逃液和染菌 保证 生产的正常运转 常用的消沫剂有植物油脂 动物油脂和一些化学合成的高分子 化合物 应用何种消沫剂应视生产菌种的生理特性和地域情况确定 有些国家主 要用植物油脂如玉米油 豆油等作为消沫剂 有的国家主要用动物油脂和鲸鱼油 猪油做消沫剂 有的国家采用高分子化合物消沫剂 这些消沫剂中 以高分子消 沫剂效果最好唧j 1 2 2 3 两相发酵工艺中的固态发酵技术 固态发酵的培养基呈固态 没有或几乎没有自由流动水 利用自然底物作为 碳源和能源 或利用惰性底物作为支持物的任何发酵过程 6 1 1 人们利用微生物 生产所需产品的悠久技术之一 1 9 4 5 年青霉素的大规模工业化生产开创了液体 1 0 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 深层发酵技术及现代发酵工业 6 2 但现代发酵工业技术的首要条件是纯种培养 固态发酵作为落后生产的代表 一直未能得到更好地开发和利用 上世纪7 0 年 代以来 随着世界能源危机的出现和环境保护意识的增强 固体发酵技术又重新 受到重视 6 3 固态发酵主要具有以下优点 原料成本低 多为天然基质或工 业生产的副产物 来源广泛 工艺相对简单 基质的含水量低 减小反应器的 体积的同时无废水 废气产生 不至于对环境造成污染 发酵过程中不需要执 行严格的无菌操作 固体颗粒间隙中存在的空气提供微生物生长的氧气 通风量 小 一般不需要无菌空气 固态发酵最明显的特征就是传质和传热过程的不均匀 性 这使得固态发酵的自动化控制和在线检测非常困难 目前尚且没有比较完善 的数学模型来描述固态发酵过程 生产过程中还是以经验指导为主 在固态发酵 中 控制的工艺参数主要有 温度 p h 物料或培养基的含水量 1 2 2 3 1 温度 温度是影响微生物生长的重要因素 直接关系到发酵过程的正常进行和最终 产品的生成 固态发酵中 微生物生长初期要达到一定的温度条件 以保证其正 常生长 在生长过程中 微生物会释放大量的生物热 尤其是在对数期 产热速 度很快 茵丝体生长旺盛 造成物料大面积板结 加之固态发酵中没有自由流动 相 导热性能差 单位距离上存在很大的温度梯度 有时高达3 c c m 不利于 微生物的生长和产酶 6 4 1 必须通过通风降温 喷淋无菌水 翻曲等手段使热量 及时散失 1 2 2 3 2p l i 目前来看 世界范围内对于这方面的研究很少 但p h 是影响发酵过程的重 要因素是毋庸置疑的 由于固态物料的含水量偏低 液态发酵中的p h 检测手段 难以应用 一般认为 只要调节好初始p h 发酵过程中不必对其进行监测和控 制 但在实际过程中 菌体代谢会导致物料p h 发生较大变化 1 2 2 3 3 水活度 微生物能否正常生长 基质的水活度是重要制约因素 一般而言 细菌正 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 常生长要求在0 9 0 4 9 9 之间 多数酵母要求在0 8 0 4 9 0 真菌及少数酵母菌 要求在0 6 0 4 7 0 水活度与物料的含水量有关 对于丝状真菌而言 过高的含 水量会抑制菌丝的生长 过低的含水量则不能满足菌丝生长的需求 含水量过高 空隙率降低 不利于通风降温的进行 同时高温和高含水量对于细菌的生长极为 有利 对发酵过程造成威胁 而含水量过低时 由于生物热及通风造成的水分损 失 微生物生长受到限制 直接影响终产物的产量 在发酵过程中 由于蒸发及 温度上升 导致水活度下斛 j 应根据实际的物料水分情况 进行补水 以保 证菌体正常生长 此外固态发酵过程的通风速率 通风时间与温度控制 发酵周 期的选择 料层厚度 反应器几何形状设计等都是重要的控制参数 由于缺乏系 统的理论依据指导 对于特定的发酵过程应根据具体情况采取相应的措施 1 2 234 固态发酵设备 总体来说 固态发酵设备的自动化程度偏低 还是以传统设备为主 近年来 对于机械化 自动化设备也进行了很多研究 但放大效果较差 不利于大规模工 业生产应用 固态发酵设备分类标准不一 b l o n s a n e 6 6 曾经归纳出了九种不同 形式的工业规模的固态发酵反应器 转鼓式 木盒式 加盖盘式 垂直培养盒式 倾斜接种盒式 浅盘式 传送带式 圆柱式 混合式等 不同形式的固态发酵反 应器以基质的运动情况则可以分为两类 静态固态发酵反应器 包括浅盘式和 塔柱式反应器 动态固态发酵反应器 包括机械搅拌的简 栓式 转鼓式反应 器等 下面主要介绍四类 即浅盘式 转鼓式 填充床 流化床 1 2 3 虫生真菌孢子粉收获及其制剂贮存 1 2 3 1 虫生真菌孢子粉的收获 我国8 0 年代研制出了旋风分收孢机 主要用于麦麸米糠发酵物的孢子分离 一次分离可获得每克几百亿个孢子的原粉 再次分离可使孢子粉的含孢量达到千 亿级 这种收孢技术虽纳入了白僵菌生产企业标准 5 9 1 之中 但很难真正用于高 纯度孢子粉的批量生产 最近 利用低值陈米生产高纯度孢子粉和采用英国产的 封闭式真菌孢子分离器收获孢子粉的工艺正在逐步建立起来 基本解决了高纯度 1 2 甘肃农业大学2 0 10 届硕士学位论文 孢子粉的生产和收获问题 按此工艺生产球孢白僵菌孢子粉 很容易使孢子粉产 品的含孢量达到1 2 0 0 亿个 克以上 含水量可控制在5 左右 6 7 1 从实用性和商品性考虑 孢子粉如何以适当的液状或粉状形式保存是真菌真 杀虫剂开发中的 个重要现实问题 6 引 随着工艺技术的不断进步 丝孢类杀虫 真菌分生孢子粉的生产相对而言已不是件难事 现有工艺生产的孢子粉含水量往 往偏高 易导致孢子过早萌发或自溶而失活 从而降低孢子粉及其剂型的贮存期 和毒力 6 9 1 而这也是制约我国白僵菌制剂登记注册和商品化的瓶颈 7 0 1 因此 保证孢子粉质量的首要考虑是以适当的方法尽可能降低孢子粉的含水量 但不能 使萌发率受显著影响 这也是选择一种干燥工艺的重要依据 在干燥过程中还必 须注意消除培养基质对孢子的不利影响 7 1 孢子粉对干燥的耐受力与两方面有关 一是孢子粉本身的特性 即孢子类型 及耐干燥能力 二是干燥方法对孢子粉的影响 真菌在生长和产孢过程中的营养 条件对孢子粉特性的影响较大 可以通过人为控制来生产所需要的孢子及其特 性 如已有试验证明通过营养调控无论球孢白僵菌还是玫烟色拟青霉均可有控制 地生产芽生孢子或分生孢子 7 2 4 3 1 它们对加工过程及其环境的耐受力是有区别的 7 4 7 6 1 到目前为止 大多菌剂干燥技术是针对细菌 如硅胶干燥技术 7 刀 喷雾 干燥技术 和狭区控湿干燥技术 7 9 1 只有少部分涉及真菌干燥 如空气干燥 气流干燥或真空干燥 踟 8 1 1 h e d g e c o e ke ta 1 s 2 采用空气干燥方法干燥黄绿绿僵 菌气生分生孢子及c o n n i e ke ta 1 f s 3 j 采用微胶囊法干燥平头刺盘孢的孢子 均可 达到比较好的效果 另有研究表明 当丝孢类真菌孢子在干燥过程中快速失水或孢子含水量过低 时 常伴随孢子失活现象的发生 m o o r ee ta 1 8 4 发现 黄绿绿僵菌低含水量的 孢子在重新复水过程中有大量孢子失活 球孢白僵菌气生分生孢子经快速失水及 吸水后的活孢率也有较大变化 高的可达9 1 低的仅有7 4 e s 5 除了改善培养基成分可以获得耐干燥的分生孢子外 8 6 1 在干燥过程中添加适 当的辅助物也可以增强分生孢子的耐干燥力 添加的支持物料不同 所获得的效 果也不相同 如在喷雾干燥中