（动物营养与饲料科学专业论文）核苷酸抗氧化作用及其对小鼠相关基因表达的影响.pdf

摘要 摘要 核苷酸通常被认为是一种条件型营养素 在特定的条件下发挥重要作用 本研究旨 在探讨其本身可能存在的清除自由基的能力及其抗氧化特性 进一步揭示核苷酸的作用 机制 扩大核苷酸应用的理论和实践基础 本试验采用化学比色法测定四种核苷酸清除羟自由基 d p p h 自由基和超氧阴离子 自由基的能力 采用流动注射化学发光法建立了评价四种核苷酸 5 a m p 5 c m p 5 g m p 5 u m p 体外抗氧化 清除自由基能力的方法 碱性条件下邻苯三酚产生的 超氧离子自由基能诱导增强鲁米诺化学发光 核苷酸对超氧阴离子自由基可能具有清除 作用 因而 在鲁米诺发光体系中加入核苷酸可能会抑制鲁米诺化学发光 建立h 2 0 2 氧化损伤体外培养脾细胞和肝细胞的模型 用m t t 法检测核苷酸的修复作用 并分析了 其对细胞抗氧化体系及抗氧化能力的影响 同时采用断奶后的雄性小鼠 分别饲喂添加 0 0 2 5 核苷酸水平的基础同粮1 5 天 对照组灌胃生理盐水 实验组灌胃c p gd n a 4 h 后比较基因表达的差异 借用基因芯片技术 对核苷酸抗氧化作用的相关基因进行了 研究 试验结果表明 核苷酸具有剂量依赖性的体外抗氧化和清除活性氧能力 核苷酸的 羟自由基清除能力很高 尤其是5 磷酸腺苷 5 a m p 和5 磷酸胞苷 5 c m p 清除 羟自由基的能力分别相当于维生素c v c 的0 7 5 倍 相对的 核苷酸的d p p h 自由基的 清除能力比较弱 四种核苷酸均能有效的抑制化学发光反应 并且随着核苷酸浓度的升 高 抑制率增强 细胞体外培养试验结果表明 添加核苷酸均能修复h 2 0 2 诱导的脾细胞 氧化损伤 修复作用与浓度呈正比 浓度达到一定高度时修复均显著 氏o 0 1 能显著 提高总抗氧化能力和抗氧化酶类活力 尸 0 0 1 显著降低m d a 含量 尸 0 0 1 受 损细胞的培养液中添加核苷酸能使其细胞培养液的氧自由基 r o s 水平逐渐降低 核 苷酸添加量为1 0 m m o l l 时 r o s 水平接近对照组水平 说明其具有显著的抗氧化作用 a f f y m e t r i x 芯片显示c p gd n a 束i 激导致小鼠的物质能量代谢 抗氧化酶类等基因表达上 调 而日粮中添加核苷酸可以相对下调抗氧化酶类基因的表达 却相对上调了d n a 损伤 修复等基因的表达 从以上试验结果可以看出 核苷酸具有较强的清除自由基的抗氧化能力 其可能通 过清除小鼠的氧化损伤产生的自由基 从而改变体内自由基的含量 保护机体免受氧化 损伤 关键词 核苷酸 抗氧化剂 自由基 细胞培养 基因芯片 小鼠 a b s t r a c t a b s t r a c t n u c l e o t i d ew a sa l w a y sc o n s i d e r e da sak i n do fc o n d i t i o n a lb a s i cn u t r i e n t s i tp r o d u c e d i m p o r t a n tb e n e f i c i a le f f e c t sd u r i n gs e v e r a ls p e c i a lt i m e s h o w e v e r i tm a yb en o to n l ya c o n d i t i o n a ln u t r i e n t b u ta l s oan a t u r a la n t i o x i d a n t i nt h i ss t u d y s e v e r a la d v a n c e dm e t h o d s w e r eu s e dt os t u d ya n t i o x i d a n te f f e c t so fn u c l e o f i d e t or e v e a li t sp o s s i b l em e c h a n i s mo f a c t i o n t 1 1 i sw i l lp r o v i d eab a s i sf o rf u r t h e rd e v e l o po f t h eu s eo f n u c l e o t i d ei ns c i e n t i f i c i n t h i sp a p e r s c a v e n g i n go fh y d r o x y lf r e er a d i c a l o h d p p hf r e er a d i c a l d p p h a n d s u p e r o x i d ef r e er a d i c a l o 厶 b yn u c l e o t i d e s 5 a m p 5 c m p 5 g m p 5 u m p w a ss t u d i e d b yc h e m i c a lc o l o r i m e t r y f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o da l s ow a su s e dt oe v a l u a t e t h ea n t i o x i d a n tc a p a c i t yo ft h en u c l e o f i d e si nv i t r o u n d e ra l k a l e s c e n c ec o n d i t i o n s u p e r o x i d e f r e er a d i c a li n d u c e da n de n h a n c e dl u m i n o lc h e m i l u m i n e s c e n c e m n m e t h o dw a su s e dt o s t u d yr e p a i r i n go fh 2 0 2i n d u c e ds p l e n i ca n dl i v e rc e l l so x i d a t i v ed a m a g e i na d d i t i o n m i c e m a l e 1 1 1 3 曲w e r ef e d0o r0 2 5 n u c l e o t i d e s s u p p l e m e n t e dd i e tr e s p e c t i v e l yf o r1 5d a y m i c ew e r el a v a g e dw i t hp h y s i o l o g i c a ls a l i n e c o n t r 0 1 o rc p gd n a e x p e r i m e n t a lg r o u p s a n dw e r ek i l l e d4 hl a t e r n l ep o s s i b l em e c h a n i s mw a s a n a l y z e db yu s i n gg e n e c h i p i tw a si n d i c a t e dt h a tn u c l e o t i d e sc o u l ds c a v e n g eh y d r o x y lr a d i c a la n dd p p hr a d i c a li n c o n c e n t r a t i o nd e p e n d e n tw a yi nv i t r oa n ds i g n i f i c a n t l yr e p a i rt h ei n j u 了o fs p l e n i ca n dl i v e r c e l l si n d u c e db yh 2 0 2 t h eh y d r o x y ls c a v e n g i n gc a p a c i t i e so f5 a m pa n d5 c m pw e r ea s l l i g ha s0 7 5t i m e so fv c h o w e v e r s c a v e n g i n gc a p a c i t i e so fd p p hf r e er a d i c a lw e r em u c h w e a k e r i tw a ss h o w e dt h a tt h ef o u rn u c l e o t i d e sc a ne f f e c t i v e l yi n h i b i tt h er e a c t i o no fl u m i n o l c h e m i l u m i n e s c e n c e f u r t h e rm o r e a st h en u c l e o t i d ec o n c e n t r a t i o ni nt h es y s t e mi n c r e a s e d t h el u m i n e s c e n c ei n t e n s i t yd e c r e a s e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tn u c l e o t i d e sh a v e s 仃o n ga n t i o x i d a n tp r o p e r t i e s 砀en u m b e ro fl i v ec e l l si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yi nh 2 0 2i n j u r i e ds p l e n i ca n dl i v e rc e l l s c u l t u r e di nv i t r o w i t ht h es u p p l e m e n t a t i o no f0 5m m o l l 1m m o l l 1 5m m o l l 1a n d1 0 m m o l l 1n u c l e o t i d e s p 0 01 c a ta c t i v i t i e s g s h p xa c t i v i t i e sa n dt a o ci ni n c u b a t i o n m e d i u mw e r ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t hn u c l e o t i d e sc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d 尸 o 01 w h i l em d ac o n t e n td e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y p o 一 o o o吾苗 磊qijic璺们 一ooc2盘 勺c四qe d吾 暑 c嚣e 玉1 0 z a s 州h j x c c 誉 ov d 齐醋昧鞭憔群 燃 o 8 寸n n n n寸n n n n 6寸n 寸 n n o 卜卜o 寸c 一 a 乜i o n i o 寸 0 n 寸 0 o n昏 寸刊60 nn nn on书nn hn寸寸 卜 n小斟卜o 卜口nn o寸 n心书卜崎 口们n峪 吨n西 60 n一心啦 卜 一千00 o一西d18一n瑚oo 崎寸西 卜寸州nn 卜a口口 一 卜n制卜 寸一 卜 寸n 卜价书卜d oo卜n口 0寸圳一 9口 岭n昏 昏圳60 8n吼口nn n f00 寸 口 0 卅oo o小 崎寸 8 西寸 9 西卜o 寸小 一 0 寸冀o 卜o o 寸 一 一 寸s 卜 n k 小谚 0 寸 o 寸乜o 叭寸 0 o t一州nn i 量nn n一刊卜峥 8n一 卜o 卜一讲nn 爪n寸 nn on书卜啦 寸n寸 n 寸n卅卜口 寸心 n 口价 n卅卜口 西nn寸 心 nn 00 卜n寸d 婚 卜 州卜岭 寸西寸寸 卜口 nn州卜o 口 卜寸 一夺 n书nn o吼n卜寸趴 寸书nn 一on卜寸n 卜nm 00 o n卜nn 8n书oo 9卜n卜寸一 卜寸书卜 o寸n卜 卜小 0 价 n 卜 旧n 哆o 寸卜寸唧均寸n n i 寸卜西 6 n吼a 0 n n 乜 o 一 崎n 8卜小 寸卜 zo 寸 o o n 0n州nn式onn 小心 8mnn 16一 n nn州nn 卜寸卜一 nn o心州卜 on口n n卜 nn州nn n寸 寸f寸一 西n斟nn 一 口n 一n 寸n州卜 寸叼寸量寸一 6一千00 9 价n n小 in州卜岭 i 寸n n寸州卜 n卜一 瞢n 寸n州nn 一 寸q on f00 n寸n峪 o c 一心卅oo 口 卜峪 on n书oo 9n卜田 n o n n 寸寸口 0 n寸心 o 寸竺 6 n o 8 nn n n 婚n 西一1 1 7 8 一卜卜 一 价ko n 口寸夸 寸 o 口一 刊oo on价鼍 心 n寸州卜 卜西 寸三n 价喇oo 价 o n 州n c i c o 鲁on n书oo 9n n n寸 口n卅卜口 nnnn n n价喇oo n n心 tn口 刊oo c寸 鲁昏岭 90刊n c n 1 6 0 o心寸n州nn con卜 量价n n州nn nn 卜 卜卜 一寸州oo o 口卜 量寸 寸州oo 卜价o 口寸 一n叫卜 卜寸 毛一x 乙 o i 一 0 i x n o l 一 o i x 价 o i n l 一 o 一 o o n 乞一x 0 i x 仉 o x n o i x o 褂器嚣 毯袋装熟莨罂 摹 瓣器嚣 毯惑果然靛罂 鋈瓣磊最 毯囊栗熟霞罂 基 褂毒暴 刨疆呆接莨罂 山乏3 山苫o 价 山芝u n 1 芝 i 1 一o ui 塾避 一曩u一它嚣 qojj o口一xo l 盘暑 口工 二o 口 oo u昌二研暑o o眦omo o u 薯q o 一口一ti 一oii卜t 一 口 釜 匠警零毒譬硝口c 巾位区 裂食搿脊篓叮一 氓奄譬暖世埔毋皿篮蜒去堆甾杠辎料 括 江南大学硕士学位论文 氧阴离子自由基 具有抗氧化能力 本研究通过核苷酸对羟基自由基 d p p h 自由基和 超氧阴离子自由基的清除性能研究 证实核苷酸具有抗活性氧自由基的功能 因此核苷 酸是一种天然抗氧化剂和活性氧清除剂 具有v c 样作用 能使机体维持一个良好状态 3 6 本章小结 本章围绕核苷酸体外抗氧化能力的评价 进行了一系列实验 通过对实验结果分析 得出以下主要结论 1 研究了核苷酸体外清除羟自由基的作用 结果表明核苷酸具有显著的清除羟自 由基的能力 5 a m p 和5 c m p 的清除作用接近v e 2 探讨了核苷酸体外清除d p p h 自由基的作用 实验结果表明核苷酸具有显著的 清除d p p h 自由基的能力 但其清除作用与清除羟自由基的能力相比较弱 3 化学发光体系的实验结果表明核苷酸在体外能够有效清除超氧阴离子自由基 导致所建立的化学发光体系发光强度的抑制 具有抗氧化性 本实验首次对核苷酸体外抗氧化能力做了探讨 并将流动注射化学发光方法应用到 核苷酸体外抗氧化能力评价工作中 建立了一个比传统方法更灵敏更方便的评核苷酸抗 氧化能力的方法 不仅为评价核苷酸体外抗氧化能力提供了更高效的技术手段 也为其 它物质抗氧化性能评价建立了共性分析技术 为抗氧化功能食品研发提供了一定的技术 支持 2 0 第四章核苷酸对h 2 0 2 所致氧化损伤小鼠脾细胞和肝细胞的保护作用 第四章核苷酸对h 2 0 2 所致氧化损伤小鼠脾细胞和肝细胞的保护 作用 4 1 引言 机体氧化损伤时会导致自由基代谢失衡 导致自由基增多 导致脂质过氧化作用增 强 引起不同程度的细胞毒性 并导致瞬时或不可逆的损伤 5 9 活性氧不但可以攻击细 胞膜和细胞器 还可以破坏蛋白质 膜磷脂 核酸等 最终导致细胞坏死或凋亡 h 2 0 2 是一种良好的诱导氧化损伤的化学剂 它诱导细胞损伤是由于活性氧 r o s 增 高 与细胞膜的类脂质结合形成氧化脂质 导致细胞膜功能障碍 细胞内游离钙增加 同时细胞内外的一些活性氧与细胞内大分子如核酸 蛋白质 脂肪等共价结合 破坏细 胞内成分 通过凋亡程序导致细胞死亡 6 0 6 h 坏死或d n a 损伤 低浓度引起凋亡 高浓 度引起细胞坏死 细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术 它为细胞学 遗传学 病毒学 免疫学的研究和应用做出了重要贡献 近年来 动物细胞培养技术已从单纯的 实验操作扩展到生物学研究和商业利用的许多方面 成为广泛采用的技术手段 许多生 物技术科学研究和产品的生产都离不开细胞培养 本章选用h 2 0 2 诱导小鼠脾细胞和肝细胞氧化损伤 研究核苷酸对h 2 0 2 导致的小鼠脾 细胞和肝细胞氧化损伤的修复作用 在细胞水平评价核苷酸的抗氧化能力 4 2 材料与仪器 4 2 1 实验材料 r p m l l6 4 0 培养基 胎牛血清 谷氨酰胺 噻唑蓝 m t t h e p e s 辣根过氧化物酶 鲁米诺 核苷酸均购自山东淄博双凤集团 其他试剂均为国产分析纯 4 2 2 实验仪器 台式离心机 低温高速离心机 生物显微镜 c 0 2 培养箱 g i b c 0 公司 中国科学院上海生化所 华美生物工程公司 s i g m a 公司 华美生物工程公司 华美生物工程公司 m e r c k 公司产品 德国 经高压液相检测纯度 9 8 2 1 上海精密科学仪器有限公司 上海安亭科学仪器厂 r 本o l y m p u s 美国t h e r m o 公司 江南大学硕士学位论文 7 2 1 分光光度计 超级恒温水浴锅 m u l t i s k a nm l 3 酶标仪 q l 9 0 1 旋涡混合器 超净工作台 m p i b 型多参数化学发光分析系统 4 3 实验方法 北京瑞利科学仪器有限公司 上海市化学仪器总厂 美国t h e r m o 公司 江苏海门其林医用仪器厂 苏净集团安泰公司 西安瑞迈分析仪器有限公司 4 3 1 小鼠脾细胞h 2 0 2 氧化损伤模型的建立 在超净工作台上无菌分离四周龄昆明小鼠脾脏 去除脂肪 用无菌p b s 液冲洗 用 2 0 0 目铁筛网制成细胞滤过液 用无菌p b s 溶液反复冲洗 吹打 使细胞散开 用吸管 将滤过液移入离心管中 在低速大容量离心机上以1 5 0 0 r p m 离心1 0 m i n 弃去上清液 加红细胞裂解液 静置裂解红细胞1 0 m i n 1 5 0 0 r p m 离心1 0 m i n 用完全培养基r p m i1 6 4 0 液 基础r p m i1 6 4 0 培养基 1 谷氨酰胺 1 0 小牛血清 制成细胞悬液 调至2 x 1 0 6 个 m l 后 分成两份 一份加入终浓度为4 0 0 9 m o l l 的h 2 0 2 溶液 用p b s 新鲜配制 诱导细胞氧化损伤 另一份加入相同体积的无菌p b s 溶液 即为空白组 于3 7 5 c 0 2 培养箱内培养3 0 m i n 离心弃上清 用无菌p b s 洗涤两次 用完全培养基r p m i1 6 4 0 液重悬至加过氧化氢前的体积 6 2 1 4 3 2m t t 法检测核苷酸对h 2 0 2 致损伤脾细胞的细胞活力的影响 将4 3 1 所得细胞悬液加入9 6 孔板 每孔1 0 0 p 氧化损伤组再分成几个组 每组分 另j j j n 入终浓度为0m m o l l 0 1 m m o l l 0 5m m o l l 1m m o l l 5m m o l l 1 0m m o l l 的核苷酸溶液或其混合溶液 n t 5 a m p 5 c m p 5 g m p 5 u m p l 1 1 1 于3 7 5 c 0 2 培养箱内培养 每个样品做6 个重复 在培养的9 0 m i n 取出 每孔加 5 m g m l 的m t t 溶液2 0 p t l 3 7 c 继续孵育4 h 1 0 0 0 r p m 离心5 m i n 弃去孔内培养液 每孔加入1 0 0 t l 二甲亚砜 振荡1 0 m i n 在酶联免疫检测仪上测定每孔吸光值 检测波 长为4 9 2 n m 1 6 2 1 4 3 3 小鼠脾细胞培养液的抗氧化指标测定 将4 3 1 所得细胞悬液加入2 4 孔板 每孔8 0 0 9 l 氧化损伤组再分成几个组 每组 分别加入终浓度为0m m o l l 0 1 m m o l l 1m m o l l 1 0m m o l l 的核苷酸溶液 于3 7 5 c 0 2 培养箱内培养 每个样品做4 个重复 在培养的9 0 m i n 取出 1 0 0 0 r p m 离心5 m i n 取上清培养液 2 0 保存 各指标的检测中总抗氧化能力 t a o c 用菲啉类络合法测 定 过氧化氢酶 c a t 用可见光法测定 丙二醛 m d a 的测定采用硫代巴比妥酸法 谷胱甘肽过氧化物酶 g s h p x 用二硫代二硝基苯甲酸 d t n b 法测定 具体用南京建 成生物工程研究所试剂盒 2 2 第四章核苷酸对h 2 0 2 所致氧化损伤小鼠脾细胞和肝细胞的保护作用 4 3 4 小鼠脾细胞培养液中r o s 水平的测定 根据4 3 1 所述方法 培养9 0 r a i n 取出细胞培养液 立即用化学发光法测定其r o s 的水平 测定具体方法 在反应池中加入辣根过氧化物酶2 0 皿 c r e p s h e p e s 缓冲溶液 8 5 5 j t l 以及不同的细胞培养液2 5 9 l 混匀后 置于发光仪测定室中 用针管由测定室的 上方向室内注入5m m 0 1 l 的鲁米诺溶液1 0 0 9 l 启动反应 测定6 0 s 内发光强度变化 用o r i g i n 软件作图 求出峰面积 a r e a 4 3 5 小鼠肝细胞h 2 0 2 氧化损伤模型的建立 将新生小鼠拉颈致死 置7 5 酒精浸泡2 3 s 再用碘酒擦拭腹部 将新生小鼠置入 超净台内 解剖取肝脏 置平皿内 用p b s 洗涤三次 并剔除脂肪 结缔组织 血液等 杂物 用手术剪将肝脏剪成1 c m 3 的小块 再用p b s 液洗三次 转移至离心管中 视肝 组织块量加入5 倍的0 2 5 的胰酶 3 7 中消化2 0 4 0 m i n 每隔5 m i n 振荡一次 使 细胞分离 加入3 5 m l 培养液终止胰酶消化作用 静置5 1 0 m i n 使未分散的组织块下 沉 取悬液加入到一离心管中 1 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 弃上清液 加入培养液1 2 m l 计数 调整细胞数到2 x 1 0 6 个 m l 后 分成两份 一份加入终浓度为4 0 0 9 m o l l 的h 2 0 2 溶液 用p b s 新鲜配制 诱导细胞氧化损伤 另一份加入相同体积的无菌p b s 溶液 即为空白组 于3 7 5 c 0 2 培养箱内培养3 0 m i n 离心弃上清 用无菌p b s 洗涤两 次 用完全培养基r p m l l 6 4 0 液重悬至加过氧化氢前的体积 6 2 4 3 6m t t 法检测核苷酸对h 2 0 2 致损伤肝细胞的细胞活力的影响 同4 3 2 4 3 7 小鼠肝细胞培养液的抗氧化指标测定 同4 3 3 4 3 8 数据分析 运用s p s s1 0 0 软件 单凶素方差分析 组间的比较用最小显著差数法 三 4 4 结果 4 4 1 核苷酸对h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞活力的修复作用 h 2 0 2 刺激后 小鼠的脾细胞和肝细胞m t t 法检测的吸光度值都显著降低 p 0 0 1 添加核苷酸 吸光度值明显增大 如表4 1 所示 细胞培养液中添n 0 i m m o l l 核苷酸 与损伤组无显著差异 而核苷酸添加量为1m m o l l 1 0m m o l l 的两组与损伤组均差异 均极显著 p o 0 1 脾细胞m t t 法检测结果显示5 a m p 5 c m p 5 g m p 的1 0 m m o l l 组的吸光度分别为0 2 9 3 0 3 2 4 0 2 8 3 都超过j 下常组的值 0 2 7 4 说明这三种核苷 酸高浓度补给时1 仪能快速修复细胞损伤 还能显著地增强细胞的增殖 5 u m p 和n t 的添加组的细胞活力略低 2 3 江南大学硕士学位论文 表4 1 核苷酸对h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞的细胞活力的修复作用 t a b 4 1e f f e c to fn u c l e o t i d e so nh 2 0 z i n d u c e di n j u r yo fs p l e n i cc e l l sa n dl i v e rc e l l s 注 与对照组比较 表示差异极显著 p o 0 1 与损伤组比较 丰表示差异显著 尸 o 0 5 幸幸表 示差异极显著 尸 o 0 1 n 6 x x s d n o t e c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 1l e v e l c o m p a r e dw i t h i n j u r yg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 5l e v e la n dw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 01 l e v e l 4 4 2 核苷酸对体外培养的h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞的培养液中t a o c 含量的影响 如表4 2 所示 经h 2 0 z 刺激后 小鼠脾细胞和肝细胞的t a o c 含量显著降低 尸 0 0 1 添加了核苷酸后 各组t a o c 含量随着添加剂量的增大而逐渐增大 脾细 胞培养液中添加核苷酸的能极显著提高总抗氧化能力 p 0 0 1 肝细胞培养液中 5 a m p 添加量为0 1 m m o l l 时 t a o c 含量与损伤组相比差异显著 尸 0 0 5 其他核 苷酸及其混合物添加后 则无显著差异 当添加量大于1m m o l l 时 各组培养液中t a o c 含量与损伤组相比差异极显著 尸 0 0 1 说明培养液中添加核苷酸能使总抗氧化能力 有不同程度的提高 表4 2 核苷酸对体外培养的h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞的培养r t a o c n m l 的影响 t a b 4 2e f f e c to fn u c l e o t i d e so i lt h et a o c u m l i ni n c u b a t i o nm e d i u mo fi n j u r i e dc e l l s c o n t r o lg r o u p 5 0 2 0 135 0 2 4 0 135 0 2 0 135 0 2 士0 135 0 2 4 0 13 i n j u r y g r o u p 1 2 7 4 0 1 1 1 2 7 4 0 1 l 1 2 7 4 0 1 1 1 2 7 4 0 1 1 2 7 4 0 1 1 肝细胞0 1m m o l l1 3 9 4 0 0 8 1 3 6 4 0 0 31 2 9 士0 0 21 2 9 士0 0 7l 3 3 4 0 0 3 lm m o l l3 5 6 4 0 0 7 率拳3 5 2 4 0 0 7 奉 3 4 6 4 0 0 7 3 15 t 0 1 0 3 4 4 4 0 0 4 幸 1 0m m o l l 4 3 5 4 0 0 3 奉4 4 1 4 0 0 3 4 3 1 4 0 0 1 幸幸4 3 6 士0 0 5 事 4 3 3 0 0 4 毒 i il l l i i l l il l 一 i l 注 与对照组比较 表示著异极显著 p o 0 1 与损伤组比较 表示差异显著 p 0 0 5 枣表 示差异极显蒋 p 0 0 1 n 3 x i 士s d n o t e c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 01i e v e l c o m p a r e dw i t h i n j u r yg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 5l e v e la n dw i t h 料a r es i g n i f i c a n td i f i e r e n ta t0 0 1 2 4 第四章核苷酸对h 2 0 2 所致氧化损伤小鼠脾细胞和肝细胞的保护作用 l e v e l 4 4 3 核苷酸对体外培养的h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞培养液中g s h p x 含量的影响 表4 3 显示小鼠脾细胞和肝细胞经h 2 0 2 刺激后 培养液中g s h p x 含量均显著降低 p 0 0 1 核苷酸的添加可以产生不同程度的修复 实验结果表明 添加量为l m m o l l 时 只有5 a m p 显示与损伤组差异显著 p 0 0 1 添加量大于1 m m o l l 时 各组的 脾 尸 o 0 1 肝 p 0 0 1 g s h p x 活均显著提高 尸 o 0 1 表4 3 核苷酸对体外培养的h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞的培养液中g s h p x u m l 的影响 t a b 4 3e f f e c to fn u c l e o t i d e so nt h eg s h p x u m l c o n t e n ti ni n c u b a t i o nm e d i u mo fi n j u r i e dc e l l s c o n t r o lg r o u p i n j u r yg r o u p 肝细胞 0 1m m o l l lm m o l l 1 0m m o l 2 7 9 4 4 0 0 5 15 2 3 0 0 4 1 5 3 1 4 0 1 0 l9 2 4 4 0 0 5 幸 2 4 1 2 4 0 1 5 宰 2 7 9 4 0 0 5 l5 2 3 4 0 0 4 15 2 0 4 0 0 9 8 6 5 l 0 1 0 2 6 0 1 4 0 1 2 2 7 9 4 4 0 0 5 15 2 3 4 0 0 4 1 5 1 9 4 0 1 0 18 7 3 4 0 0 9 木 2 4 9 6 4 0 21 2 7 9 4 0 0 5 1 5 2 3 4 0 0 4 15 2 2 士0 0 3 1 7 6 4 0 1 1 2 2 4 6 4 0 17 幸宰 2 7 9 4 0 0 5 1 5 2 3 i 0 0 4 1 5 1 2 a 0 1 l 18 4 2 1 0 0 2 2 5 1 1 士o 0 4 幸幸 注 与对照组比较 表示差异极显著 p o 0 1 与损伤组比较 术表示差异显著 p o 0 5 宰木表 示差异极显著 尸 o 01 n 3 x 一 x 士s d n o t e c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 01l e v e l c o m p a r e dw i t h i n j u r yg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 5l e v e la n dw i t h 奉 a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 1 l e v e l 4 4 4 核苷酸对体外培养的h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞的培养液中c a t 含量的影响 表4 4 核苷酸对体外培养的h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞的培养液中c 盯 u m l 的影响 t a b 4 4e f f e c to fn u c l e o t i d e so nt h ec a t u m l c o n t e n ti ni n c u b a t i o nm e d i u mo fi n j u r i e dc e l l s c o n t r o lg r o u p1 3 5 6 4 0 1 2 1 3 5 6 4 0 1 21 3 5 6 4 0 1 21 3 5 6 0 1 21 3 5 6 4 0 1 2 i n j u r yg r o u p 4 2 2 4 0 0 3 4 2 2 4 0 0 3 4 2 2 4 0 0 3 4 2 2 4 0 0 3 4 2 2 4 0 0 3 肝细胞0 1m m o l l4 3 8 4 0 1 1 事4 2 9 4 0 0 8 4 2 1 4 0 0 24 2 5 4 0 0 8 4 3 0 4 0 1 0 im m o l l7 7 8 4 0 0 9 6 3 7 4 0 0 0 幸 6 1 0 a o 1 3 卡事5 0 3 4 0 0 3 枣幸6 2 1 4 0 0 6 牛 10m m o l l l1 3 6 4 0 0 5 宰枣11 0 7 0 0 7 奉奎10 0 6 4 0 0 7 宰 8 5 3 4 0 0 4 年幸 10 3 6 4 0 0 7 幸 注 与对照组比较 表示差异极显著 尸 0 0 1 与损伤组比较 丰表示差异显著 尸 0 0 5 车 表 示差异极显著 尸 0 0 1 n 3 x i 4 s d n o t e c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0ll e v e l c o m p a r e dw i t h i n j u r yg r o u p v a l u e sw i t h 丰a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 5l e v e la n dw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 1 l e v e l 江南大学硕士学位论文 由表4 4 可以看出 小鼠脾细胞和肝细胞经h 2 0 2 刺激后 培养液的c a t 含量显著降 低 p 0 0 1 与损伤组相比 加核苷酸的各组c a t 含量逐渐增大 核苷酸添加量为 l m m o l l 和1 0 m m o l l 时 差异极显著 尸 0 0 5 4 4 5 核苷酸对体外培养的h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞的培养液中m d a 含量的影响 用h 2 0 2 刺激后 脾细胞和肝细胞的培养液中m d a 的含量明显升高 尸 0 0 1 而 补充了核苷酸后又有所降低 在肝细胞和添加高浓度核苷酸的脾细胞各组中显示了显著 的差异 p 0 0 1 表4 5 核苷酸对体外培养的h 2 0 2 致损伤脾细胞和肝细胞的培养液中m d a n m o l m l 的影响 t a b 4 5e f f e c to fn u c l e o t i d e so nt h em d a n m o l m l c o n t e n ti ni n c u b a t i o nm e d i u mo fi n j u r i e dc e l l s 注 与对照组比较 表示差异显著 p o 0 5 表示差异极显著 尸 o 0 1 与损伤组比较 木表 示差异显著 尸 0 0 5 宰表示差异极显著 j p 0 0 1 n 3 x i 士s d n o t e c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 5l e v e la n dw i t h a r e s i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 1l e v e l c o m p a r e dw i t hi n j u r yg r o u p v a l u e sw i t h 士a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t o 0 5l e v e la n dw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 1l e v e l 4 4 6 化学发光法测定细胞培养液r o s 水平 1 6 0 0 0 1 4 0 1 2 0 0 0 霸1 0 0 0 0 k 18 0 0 0 娶 陶6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 0 c o n t r o l i n j u r y 5 a m p 0 1 m m a m p i m m s a m p i m m 组别g r o u p 白 添加5 a m p 的脾细胞培养液中r o s 水平图 2 6 第四章核苷酸对h 2 0 2 所致氧化损伤小鼠脾细胞和肝细胞的保护作用 1 6 0 0 0 1 4 0 0 0 1 2 0 0 0 目1 o o 墨8 0 0 0 搂 陶6 0 0 0 4 0 2 0 0 0 o c o n t r o l i n j u r y 5 c m p o 1 r a m 5 c m p l m m 5 c m p i o m m 组别g r o u p 国 添加5 c m p 的脾细胞培养液d e r o s 水平图 1 6 0 0 0 1 4 0 0 0 1 2 0 0 0 i 0 0 0 0 k 罩8 0 0 0 搂 喧6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 o 荔 工 i 一 鬈 7 j i2 c o n t r o l i n j u r y 5 g m p o 1m f g m p im m s g m p im m 组别g r o u p 亿 添加5 g m p 的脾细胞培养液中r o s 水平图 1 4 0 0 0 1 2 0 0 0 1 0 0 0 0 高 8 0 0 0 莲删 4 0 0 0 2 0 0 0 o t t t f 一 j t 夕 j o ij c o n t r o l i n j u r y 5 u m p 0 1 m m i u m p i r a m 5 一u m p l m m 组别g r o u p 似夕添加5 u m p 的脾细胞培养液中r o s 水平图 图4 1 细胞培养液中r o s 水平图 a d 与对照组比较 表示差异极显著 p 0 0 1 与损伤组比 较 表示差异显著 p 0 0 5 表示差异极显著 p 0 0 1 n 3 x ii s d f i g 4 1t h er o sl e v e li ni n c u b a t i o nm e d i u m c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p v a l u e sw i t h a r e s i g n i f i c a n td i f f e r e n ta to 0 1l e v e l c o m p a r e dw i t hi n j u r yg r o u p v a l u e sw i t h a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n t a t0 0 5l e v e la n dw i t h 古a r es i g n i f i c a n td i f f e r e n ta t0 0 1l e v e l 2 7 江南大学硕士学位论文 细胞培养液中r o s 水平的变化见图4 1 与对照组相比 损伤组的r o s 水平明显升高 俨 0 0 1 而添加核苷酸后的各组随着添加浓度的增大 其细胞培养液r o s 的量逐渐减 少 核苷酸添加量为1 0 m m o f l 时 5 a m p 5 c m p 5 g m p 的r o s 水平平均值分别为 6 2 9 8 6 1 0 4 6 1 6 5 均与对照组 均值分别为6 3 3 9 6 3 3 9 6 0 4 1 无显著差异 而5 u m p 均值为7 9 9 4 接近其对照组水平 6 0 41 4 5 讨论 m t t 实验结果表明 核苷酸组的细胞增殖率高于损伤组 脾细胞培养液中添加高浓 度 1 0 m m o l l 5 a m p 5 c m p 5 g m p 培养后 m t t 检测吸光度分别为0 2 9 3 0 3 2 4 0 2 8 3 都超过j 下常组的值 0 2 7 4 说明这三种核苷酸具有很强的修复氧化损伤的作用 同时具有很强的增殖作用 这两种作用同时发挥效应 这与有很多相关的外源核苷酸促 进受损组织的恢复的研究结果相一致 如有报道指出 核苷酸能促进小肠溃疡的愈合1 6 引 肠切除术后组织功能的恢复 1 5 促进肝细胞的生长 删和肝损伤的恢复及肝组织再生 6 5 6 7 o h 2 0 2 是一种较强的氧化剂和化学性d n a 诱裂剂 它能很容易地穿透细胞膜进入细 胞 并不被酶降解而直接到达细胞核 如果在结合于d n a 上的金属离子的催化下 h 2 0 2 可转变成具有高度活性的羟自由基从而引发过氧化反应 卯j 因此h 2 0 2 是良好的诱导氧化 损伤的化学剂 氧化和抗氧化的平衡是决定细胞生存的条件 正常机体内 有一套有效的抗氧化防 御系统 来防止r o s 对机体的损伤 t a o c 代表体内酶性和非酶性抗氧化物的总体水平 t a o c 的强弱与机体的健康程度密切相关 实验表明 核苷酸能显著提高氧化损伤小鼠 脾细胞体外培养液中的t a o c 通过抗氧化作用可对抗h 2 0 2 对细胞抗氧化酶活性的