（制糖工程专业论文）环糊精测定方法及其制备工艺对产物组成影响的研究.pdf

摘要 摘要 环糊精( 简称c d ) 是一类极其重要的化合物，在工业上有广泛的应用，在科学上 有极为重要的研究价值。本论文就c d 的定量测定方法，制备工艺条件及淀粉预处理方 式对其生产制备的影响等方面进行了系统的研究，采用无溶剂法制备c d ，试图通过改 变制备条件，得出影响产物组成的规律。 论文首先采用分光光度法进一步完善了伐、 t - c d 的测定方法，得到了两种c d 在 浓度为0 - - - 0 3g l 范围内准确高效的测定条件。a c d 的测定条件为：九为5 0 7n m ，p h 为1 6 ，温度为1 6 ，甲基橙浓度为0 1m m o l l 。丫- c d 的测定条件为：九为6 4 0n m ， p h 为4 1 ，温度为室温，溴甲酚绿浓度为5m m o l l 。在这两种条件下分别测定位- 、丫一c d ， 准确度高，重复性好。通过等摩尔连续变化法、热力学法、核磁共振技术、分子模拟手 段和红外光谱法等各种方法对7 c d 与溴甲酚绿( 简称b c g ) 的相互作用进行研究，明 确了分光光度法测定丫c d 的原理：指示剂b c g 的发色抑制基团被p c d 包合使得b c g 吸收峰增强，从而出现增色效应。这为一t - c d 的测定方法提供了理论基础。 以葡萄糖值( 简称d e 值) 为5 的玉米麦芽糊精为底物，通过单因素实验，得出了 p h 、温度、底物浓度、反应时间、加酶量等反应条件对c d 制备的影响规律，发现当底 物浓度为2 5 0g l 、加酶量为4u g 、c a c l 2 的浓度为4 0m m o l l 时三种c d 的产率均较 高，产物组成比例变化不大，而p h 、反应时间对c d 制备的影响效果规律不一。通过 响应面实验对p h 、温度、反应时间三个因素作进一步分析，得出了各c d 制备的最佳 工艺条件，分别为：a c d ：p h 为7 5 ，温度为6 5 ，反应时间为3h ；p - c d ：p h 为8 5 ， 温度为6 5 ，反应时间为1 2h ；y c d ：p h 为7 0 ，温度为6 5 ，反应时间为2 4 h 。 采用不同种类的淀粉用于c d 制备的研究发现：在玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀 粉和蜡质玉米淀粉这四种淀粉中，以木薯淀粉为原料制备c d 时总产率最高，且以不同 的淀粉为原料得到的产物组成不同。采用酶解、酸解、氧化三种不同的方式对木薯淀粉 进行预处理，然后再用于c d 的制备，比较了不同的预处理方式对c d 制备的影响，得 出：在这三种预处理方式中，淀粉酶解后再用于制备其c d 总产率最高。 对采用有机溶剂法( 环己烷) 制备分离p c d 后得到的母液组成成分进行了分析， 确定其中总糖含量达到8 4 ，洳、9 、 r c d 的含量分别为：1 3 6 、2 4 7 2 、0 2 5 ， 比例为5 ：9 4 ：1 ，即b c d 仍占绝对主导。而非有机溶剂法生产得到的c d ，0 【- 、p 一、丫c d 的比例为1 6 ：7 4 ：1 0 。这表明有机溶剂对c d 组成的影响十分明显，环己烷在提高p c d 产率的同时，也抑制了q 、丫一c d 的生成。 关键词：淀粉，环糊精，测定方法，产物组成 a b s t r a c t c y c l o d e x t r i n sa r ei m p o r t a n tc o m p o u n d sw h i c hh a v ew i d e s p r e a da p p l i c a t i o ni ni n d u s t r y a n dg r e a ts i g n i f i c a n c ei ns c i e n t i f i cr e s e a r c h d e t e r m i n a t i o nm e t h o do f c y c l o d e x t r i n s ，e f f e c t so f r e a c t i o nc o n d i t i o na n dp r e t r e a t m e n to fs u b s t r a t eo nt h ep r o d u c t i o no f c y c l o d e x t r i n sh a v eb e e n i n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r an o n s o l v e n tm e t h o dw a sa d o p t e dt op r o d u c ec y c l o d e x t r i n s ，t r y i n g t og e tt h ei n f l u e n c el a w o f p r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo nt h ec o m p o s i t i o no f t h ep r o d u c t s f i r s to fa l l ，f u r t h e ri m p r o v e m e n to ft h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d so f a ，y c y c l o d e x t r i nw e r e i n v e s t i g a t e dr e p e c t i v e l y ，a n dt 1 1 em e t h o d sc o u l eb eu s e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fc c 。 ? - c y c l o d e x t r i nw e r eb e t w e e n0e g la n d0 3e g l t h eo p t i m a ld e t e r m i n i n gc o n d i t i o no f a 。c y c l o d e x t r i nw a sa sf o l l o w ：w a v e l e n g t hw a s5 0 7n m ，p hw a s1 6 ，t e m p e r a t u r ew a s16 ， c o n c e n t r a t i o no fm e t h y lo r a n g ew a so 1m m o l l t h eo p t i m a ld e t e r m i n i n gc o n d i t i o no f ? - c y c l o d e x t r i nw a sa sf o l l o w ：w a v e l e n g t hw a s6 4 0n l n ，p hw a s4 1 ，a tr o o mt e m p e r a t u r e ， c o n c e n t r a t i o no fb r o m o c r e s 0 1g r e e nw a s5m m o l l t h ei n c l u s i o nc o m p l e xf o r m a t i o no f b r o m o c r e s o lg r e e n 淅t l l7 - c y c l o d e x t r i nw a ss t u d i e db yu s i n gu v - v i s ，c o n t i n u o u sv a r i a t i o n p l o t ，t h e r m o d y n a m i c s ，m o l e c u l a rm o d e l i n g ，n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c ea n di n f r a r e d s p e c t r u mm e t h o d s t h ed e t e r m i n i n gp r i n c i p l eo f7 - c y c l o d e x t r i nw a sa sf o l l o w ：t h ei n h i b i t i n g c o l o r i n gg r o u po fb r o m o c r e s o lg r e e nw a si n c l u d e di nt - c y c l o d e x t r i n , t h u st h ea b s o r b i n g s p e c t r ab e c a m es t r o n g t h ee f f e c t so fp h ，t e m p e r a t u r e ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ，r e a c t i o nt i m e ，r e a c t i o n m e d i u ma n da m o u n to fe n z y m eo nt h ep r o d u c t i o no fc y c l o d e x t r i n sw e r ed e t e r m i n e db ys i n g l e f a c t o re x p e r i m e n tu s i n gc o r nd e x t r i n ( d e = 5 ) a st h es u b s t r a t e t h ey i e l do fc y c l o d e x t r i n r e a c h e dh i g h e s tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft h es u b s t r a t ew a s2 5 0e g l ，t h ea m o u n to f e n z y m e w a s4u ga n dt h ec o n c e n t r a t i o no fc a c l 2w a s4 0m m o l l t h ec h a n g ei nc o m p o s i t i o no ft h e p r o d u c t sw a sn o ts i g n i f i c a n t t h ee f f e c t so fp ha n dr e a c t i o nt i m eo nt h ep r o d u c t i o no f c y c l o d e x t r i n sw e r ed i f f e r e n t t h ei n t e r a c t i o n a le f f e c t so f p h ，t e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m eo n t h ep r o d u c t i o no fc y c l o d e x t r i n sw e r ei n v e s t i g a t e db yr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ，a n dt h eb e s t p r o d u c t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w ：a c y c l o d e x t r i n ：p hw a s7 5 ，t e m p e r a t u r ew a s6 5 ， r e a c t i o n a lt i m ew a s3h ；1 3 - c y c l o d e x t r i n ：p hw a s8 5 ，t e m p e r a t u r ew a s6 5 ，r e a c t i o n a lt i m e w a s12h ；7 - c y c l o d e x t r i n ：p hw a s7 0 ，t e m p e r a t u r ew a s6 5 ，r e a c t i o n a lt i m ew a s2 4h t h ee f f e c t so fd i f f e r e n ts u b s t r a t e so nt h ep r o d u c t i o no fc y c l o d e x t r i n sw e r ec o m p a r e db y u s i n gc o r ns t a r c h ，t a p i o c as t a r c h ，p o t a t os t a r c ha n dw a x yc o r ns t a r c h t h eh i g h e s ty i e l do f c y c l o d e x t r i n sw a sg o tb yu s i n gt h et a p i o c as t a r c ha st h es u b s t r a t e b e s i d e s ，t h ec o m p o s i t o no f t h ep r o d u c t sw a sd i f f e r e n tw i t hd i f f e r e n ts u b s t r a c t e s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n t so f s t a r c ho nt h ep r o d u c t i o no fc y c l o d e x t r i n sw e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n gt a p i o c as t a r c ha st h e s u b s t r a t e ，a n dt h eb e s tr e s u l tw a sg o tf r o me n z y m eh y d r o l y s i sa m o n ge n z y m eh y d r o l y s i s ，a c i d i i a b s t r a c t h y d r o l y s i sa n do x i d a t i o n m o t h e rl i q u o rg o tf r o ms o l v e n tm e t h o dw a st h er e a c t i o ns o l u t i o nr e s i d u ef r o mw h i c h i b - c y c l o d e x t r i nw a ss e p a r a t e d t h ec o m p o s i t o no f t h em o t h e rl i q u o rw a sa n a l y z e d t h ec o g e n t o ft o t a ls u g a rw a sf o u n dt ob et h em a i nc o m p o n e n t t h ep e r c e n to fa 一，p - ，y - c y c l o d e x t r i nw a s 1 3 6 ，2 4 7 2 ，0 2 5 ，r e s p e c t i v e l y ，t h ep r o p o r t i o no ft h e mw a s5 ：9 4 ：1 h o w e v e r , t h e p r o p o r t i o no fa - ，p - ，y - c y c l o d e x t r i nw a s16 ：7 4 ：10w h e nu s i n gn o n s o l v e n tm e t h o d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es o l v e n ti m p r o v e dt h ey i e l do fp - c y c l o d e x t r i n ，a n da tt h es a m et i m er e d u c e d t h ey i e l do fa c y c l o d e x t r i na n dy - c y c l o d e x t r i n k e yw o r d s ：s t a r c h ，c y c l o d e x t r i n s ，d e t e r m i n a t i o nm e t h o d ，c o m p o s i t i o no f p r o d u c t s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：剑亟兰 导师签名： 日期： 第一章绪论 1 1 环糊精的简介 第一章绪论 环糊精( c y c l o d e x t r i n ，简称c d ) ，又称为环聚葡萄糖、s c h a r d i n g e r 糊精等，是由环 糊精葡萄糖基转移酶( c y c l o d e x t r i ng l u c o s y l t r a n s f e r a s e ，简称c g t a s e ) 作用于淀粉或相 关物质而成的环状聚合物。c d 在1 8 9 1 年首先由v i l l i e r s 分离出来【l 】，并在1 9 0 4 年由 s h a r d i n g e r 鉴定为环状低聚糖【2 j 。后又确定c d 主要是由a 1 ，4 d 糖苷键连接6 、7 和8 个吡 喃葡萄糖残基构成的环状低聚糖【3 4 j ，根据葡萄糖残基个数它们分别称为a l p h a 、b e t a 和 g a m m a 环糊精( 简称a 、3 - 和1 ，c d ) 。 c d 分子内表面呈疏水性，外表面呈亲水性，这种独特的分子结构可以使它通过范 德华力、疏水作用力以及主客体分子之间的空间匹配效应，与一些电荷、极性、结构、 性质相匹配的客体分子或基团形成超分子包合物，改变这些物质的物理和化学性能，进 而能被大量地应用于医药、食品、日用消费品及化工等领域【5 遗】。 1 1 1 环糊精的结构 c d 是由多个葡萄糖残基环状排列而成的一组低聚糖的总称。常见的c d 主要有仅、b 和丫c d ，其化学结构见图1 1 所示。c d 的c 2 和c 3 上的仲羟基位于锥形圆筒外侧较大的 开口端，c 6 位上的伯羟基位于这锥形筒外侧较小的开口端，因而外侧边缘是亲水的。在 c d 内腔有非极性的c 3 和c 5 上的h 以及通过醚键连接的氧原子，则内腔呈疏水性。c d 的 这种特殊环形立体结构使其具有“外亲水，内疏水 的特殊性质，其立体结构见图1 2 。 圉圈国王 图1 - 2a - ，p ，r c d 的立体结构示意图 f i g 1 - 2s p a t i a ls t r u c t u r eo fa - ，p a n d7 - c d 江南大学硕士学位论文 1 1 2 环糊精的性质 1 1 2 1 物理性质 三种c d 均为白色晶体，其中p c d 的溶解度最低，易于从水溶液中结晶提纯。而洳、 7 - c d k h 于在水中具有较大溶解度，不易得到晶体，且各c d 在水中的溶解度随温度上升 而增高。c d 不溶于一般的有机溶剂，并且其结晶体无一定的熔点，加热到2 0 0 以上开 始分解。不同的c d 其结晶形状和与碘显色各不相同。c d 具有甜味【9 1 ，0 5 9 c d 液的甜 度与同浓度蔗糖相等。i b - c d 呈现甜味的最低浓度为0 0 3 9 ，蔗糖是0 2 7 ，因此在低浓 度时c d l p , 蔗糖更甜。另外，c d 水溶液具有旋光度。重要的物理性质见表1 1 。 表1 - 1 洳，f l - 、丫- c i ) 的物理性质 t a b 1 - 1p h y s i c a lp r o p e r t i e so fa - ，p - ，丫- c d 1 1 2 2 化学性质 c d 因其没有还原性末端基团，不具有还原性，除非c d 水解，否则不涉及还原糖的 反应。c d 在碱甚至是强碱溶液以及弱酸中都是稳定的，但是强酸能水解c d 生成葡萄糖 和一系列麦芽低聚糖，其水解程度取决于酸的浓度和反应温度，水解第一个葡萄糖单位 的糖苷键使环形结构开链的速度比水解开链糊精慢2 - - 一5 倍i l o 】。 c d 具有许多的羟基使其具有一定的化学反应活性，可以引入新的官能团形成新的 c d 衍生物，从而改善c d 的某些性质。目前，已有的研究主要是围绕d c d ，通过引入亲 水性基团改善其水溶性，从而扩大其应用范围。 1 1 2 3 生物学性质 c d 由于不具有还原性末端，所以完全不被外切酶如d 淀粉酶和葡萄糖淀粉酶水解。 2 第一章绪论 a 淀粉酶属于内切酶，不需要还原性末端基团，它不仅能水解开链糊精分子内部的糖苷 键，而且能作用于c d 使其发生水解，但水解速度很慢。不同来源的a 淀粉酶对各种c d 的作用能力不同，如真菌淀粉酶一般比细菌淀粉更能水解c d ；唾液淀粉酶能水解丫c d ， 但是不能水解p c d ；t a k a 淀粉酶容易水解p ，丫c d ，但对口c d 作用却很弱等。另外， c d 也不能被酵母和其它微生物发酵。 a 、i b - c d 基本不能被人体消化酶所水解，但在肠道中会被正常寄生的细菌分解成短 链脂肪酸，这些短链脂肪酸在肠道中可抑制有害杂菌的繁殖，并有助于益生菌的生长。 更重要的是，e - c d 能有效抑制餐后血糖的升高，是防止餐后高血糖的一种有效物质， i - c d 虽然能在人体内快速消化，但会产生非常迟缓的血糖浓度响应，因此，) , - c d 不仅 能提供营养，而且能更好地控制餐后的血糖浓度和胰岛素分泌【l l 】。 研究表明，c d 口服后无毒性、安全，已被部分国家食品和医药法规批准使用，并 制定了严格的质量规格【1 2 】。 1 1 3 环糊精的用途 c d 分子独特的结构和性质使其能包合客体分子形成一个微胶囊体系，能改变客体 分子的化学和物理性质，从而提供一些非常有用的功能，广泛的被应用到各个领域。 1 1 3 1 食品工业中的应用 目前，c d 在食品工业中的应用主要有防挥发，防氧化，防光诱导降解，防热诱导 改变，保护色素、防潮解、保湿等功能，同时可保持食品稳定，改良和提高组织结构， 可去除和减轻苦涩味，并保持食品的风味和达到风味最佳化【1 3 1 5 1 。 1 1 3 2 医药工业中的应用 在医药工业中，c d 可以用来提高药物稳定性，防止挥发性成分的挥发；提高药物 的溶解度；降低药物的刺激性、毒性、副作用等，促进药物的吸收，提高其生物利用度； 防止药物与药物，药物与添加剂之间的互相作用【1 6 1 踟。 1 1 3 - 3 化学工业中的应用 化学工业中c d 用于日化工业中可抑制洗衣粉、洗发剂及厨房清洗剂等的香味挥发， 也可减少对皮肤的刺激；加入到化妆品中作为乳化剂、稳定剂，延长其保质期，保持香 味，减轻对皮肤的刺激；用于催化反应中，能增强反应的选择性，从而可以进行分子识 别，模拟生物酶催化反应【1 9 2 4 】。 1 1 3 4 分析化学中的应用 c d 具有协同增敏、对映体拆分、诱导室温磷光法、荧光增强效应、在测量痕量金 属，传感器中有其广泛的应用。另外，c d 具有影响有色分子的吸收光谱，对显色反应 有增敏、增溶和增稳作用，并且利用c d 及其衍生物对手性分子的识别作用，因而近年 来，已逐渐用于各类色谱分析和光谱分析中1 2 5 。3 0 1 。 1 1 3 5 在环保方面的应用 在环境检测方面，利用c d 对客体分子识别作用装配分子传感器，测定四氯乙烯、 三氯乙烯、苯、甲苯等有害气体，有适宜应答。在污染物的分离和消除中，c d 有一定 的亲水性能，可有效地避免有机毒性物质的疏水基团对微生物细胞膜的亲合和破坏。另 江南大学硕士学位论文 外，拥有独特结构的c d 分子在溶液体系中是一种性能良好的人工酶，可作为一些毒性 分子加速水解或分解的催化剂，利用这些功能处理废水中少量有毒物质成为环保中的一 项新技术【3 1 0 4 1 。 1 1 3 6 在农业方面的应用 c d 可作为植物生长调节剂；提高农药的溶解速度、溶解度，浓度增高，生物药效 增高，也可能降低药物用量仍能获得相同效果，同时则可保护环境；提高稳定性，减少 挥发损失；掩盖许多农药具有的不快味道，但不影响药划3 5 】。 1 1 3 7 其它方面 c d 具有生物相容性，对酶和微生物没有毒害。在生物转化和发酵过程中，c d 能包 结有机物从而提高有机物的溶解度；通过与有机底物或产物发生包结，能显著降低产物 和底物质量浓度，减少毒性。另外，c d 在其它很多方面如纺织、色谱、胶粘剂等领域 也具有非常好的应用前景。 1 2 环糊精的制备 1 2 1 国内外制备概况 c d 自从被v i l l i e r s 发现以来，其研究经历了两个重要发展时期：1 9 7 0 年以前，主 要从事结构和化学性质的研究；1 9 7 0 年以后，则进入应用开发阶段。近三十年来，各 种c d 及其衍生物在国外已广泛应用于医药、化工、农业、日用消费品及生物技术等领 域中，而我国制备和使用c d 只有十余年时间，应用程度远不及国外先进国家。 日本在1 9 6 0 年首次进行了c d 的中试制备，1 9 7 6 在世界上率先实现d c d 工业化制备， 美国、匈牙利、德国、法国、俄罗斯紧随其后相继大力开展c d 的制各及应用研究。国 际市场上制备和供应c d 的公司主要有美国c o r n 公司、日本食品化工株式会社和盐水港 精糖株式会社、德国w a c k e r 公司、匈牙利化学产品公司及c y c l o l a b 公司。这些公司在c d 的研究制备方面起步早，技术力量雄厚，产品系列化，在世界上有较大的影响。 在我国，谈家桢等于1 9 5 0 年报道了以软化芽孢杆菌作用于淀粉制备c d ，二十世纪 八十年代后期又开展了利用嗜碱芽孢杆菌制备c d 的研究，江苏省食品发酵研究所于 1 9 7 8 年首先开始了c d 的制备研究，并于1 9 8 2 1 9 8 3 年进行了扩大试验，1 9 8 5 年完成了年 产2 0 吨c d 的工业性试验，中科院北京微生物研究所也进行过c d 的中试制备和应用试验。 直至1 1 1 9 9 0 年陕西省微生物研究所谢伯泰研究员开发出p c d 的制备新工艺之后，我国的 c d 产业才开始得到发展。 近年来，国内对c d 的制备开发十分重视，应用研究也不断深入，目前国内c d 制备 厂家主要有广东郁南、陕西佳县、陕西志丹、陕西礼泉、辽宁方镇五家，另外还有苏州 味精厂、山东曲阜天利药用辅料有限公司等。其产品类型主要为b c d 以及少部分晓c d ， 但至今尚未有丫c d 的工业制备。 1 2 2 环糊精含量的测定 完善准确的测定方法是正确评价c d 制备工艺的前提。有关c d 的测定，最早使用 4 第一章绪论 的是碘液与不同的c d 形成不同颜色和不同形状的晶体；随后，大量的测定方法应用于 c d 的测定，其中包括：分光光度法【3 6 】，荧光光谱法1 3 7 1 ，薄层色谱法【3 8 捌，高效液相色 谱法等。分光光度法操作方便、快捷，仅需一台紫外可见分光光度计和显色剂即可 进行q 一、b 一、y c d 的定量分析，因而最被广泛使用。 在三种c d 中，p c d 由于制备工艺简单、成本较低，应用最广泛，有关p c d 测定 的方法也比较完善【4 h 7 】。而a 、) - c d 的工业化制各成本太高，商业化应用一直受到限 制，有关其测定的研究报道也较少。有关a - c d 的测定方法仅l e j e u n e 4 8 j 在19 8 9 年对其 进行过研究，并确立了以甲基橙( m o ) 为指示剂的分光光度法，但其对p h 值、m o 浓度、 干扰因素等可能影响测定结果的因素未作讨论，也未确定a c d 测定的线性范围，影响 了测定结果的可靠性和准确性。同样，有关丫c d 的测定方法仅k a t o 4 9 1 进行过研究，确 立了以溴甲酚绿( b c g ) 为指示剂的分光光度法，其研究了p h 值，显色剂浓度及其他碳 水化合物对y c d 测定的干扰影响，但其对温度、反应时间等可能影响测定的因素以及 测定范围其未作研究，实际测定结果仍不准确。国内有关a 、丫c d 测定方法改进的报 道仍为空白。 另外，分光光度法定量分析c d 的实验原理未见详细的报道。有关测定方面的研究 报告中提及了a 、b c d 的测定原理为：c d 与其显色剂发生包合作用，使溶液中显色 剂浓度下降，表现为吸光值下降，其下降的程度在一定范围内呈线性关系。而对丫c d 的定量测定原理未见报道，并且其与显色剂溴甲酚绿作用出现增色效应的原因也不明 确。因此，用于定量分析c d 的分光光度法还有待进一步的完善。 1 2 3 环糊精的制备工艺 c d 的制备工艺有化学合成法和酶法，由于使用化学合成方法成本太高，因此目前 工业化制备c d 都采用的是酶法。酶法生产c d ，得到的是三种c d 的混合物，其主要 产物与选择的c g t a s e 有关，反应条件、底物、有机溶剂以及后期的分离纯化方法的选 择也都是c d 制备中的关键步骤。其制备工艺按照c g t a s e 淀粉体系有无有机复合剂分 为有机溶剂法与无溶剂法两种。 1 2 3 1 有机溶剂法 传统的c d 制备工艺主要是有机溶剂法，利用c d 与有机溶剂的包合作用促使产物 c d 从反应液中沉淀分离出来。如果在酶转化淀粉的过程中添加有机溶剂，则可发挥多 重作用，反应过程也变为可控制过程。这是由于仅、1 3 、丫c d 内腔孔径不同，可以对 有机溶剂进行选择性包合，不溶包合物的生成改变了反应体系的平衡，会促使更多c d 的转化生成，而且利用包合的选择性也可以使不同的c d 单独沉淀，从而实现对混合产 品的分离纯化。例如，应用甲苯和三氯乙烯可以分离b c d ，应用正癸醇可以实现对q c d 的分离，应用十二元环类化合物适合于y c d 的分离5 0 , 5 1 】。 有机溶剂法【5 2 生产工艺为：淀粉悬浮液一预处理_ 冷却至一定温度，调节p h 鲤丝竺宣型墅屿搅拌反应_ 升温使酶失活- 离心分离- - * c d 与复合剂的包结物一分离 复合物一浓缩_ 结晶_ 过滤干燥一成品。 江南大学硕士学位论文 1 2 3 2 无溶剂法 随着c d 生产技术的发展，无溶剂工艺也得到发展和应用，其主要是根据c d 物理 性质的差异来进行后期分离的，诸如溶解性、分子量大小等。例如，洳、1 3 一、7 - c d 在水 中的溶解度差异很大，只要对转化液进行分段浓缩，就可以使不同的c d 分别以结晶态 沉淀出来。在a 、p 、丫c d 三种c d 中，1 3 - c d 的水溶解度最小，可以很方便地通过分 步结晶的方法制得，因此目前工业制备中大量制备和广泛应用的是1 3 - c d 。生产过程中 不使用有机溶剂，可以提高c d 产品的安全性并减少其对环境的污染。 无溶剂法制备工艺为：淀粉悬浮液- 预处理_ 冷却到酶反应温度，调节 p h 丝垒搅拌反应- 升温使酶失活一离心分离浓缩一结晶_ 过滤一干燥_ 成品。 1 2 4 影响环糊精制备的因素 1 2 4 1p h 值、温度 c d 的制备一般都是以某种单一的c d 作为目标产物，因此制各条件都是以此种产物 产率最高为目标控制其反应的最适温度和最适p h 值，也就是在c g t a s e 活性最大的范围 进行反应。但是，c g t a s e 催化淀粉制备c d 得到的都是三种c d 的混合物，制备工艺条件 的选择对c d 的产率及组成有很大的影响。 不同的p h 值下c g t a s e 生产不同c d 的活性不同，如：r i mf m a r t i n s 5 3 】发现：碱性菌 株l s 3 c 常i j 备得到的c g t a s e 在p h 值为5 0 的条件下制备c d ，其产物主要以b c d 为主，同 时伴有少量的c t c d 产生。但是当p h 值调至l j l 0 0 时，则a c d 被丫c d 取代。这种在p n 值为 l0 下产物显著变化的原因：氨基酸在离子化状态下包含到底物和酶糖链接点之间的氢键 中从而发生改变，这可能会增加额外的葡萄糖单位，因此得到大环的c d 。又以b a c i l l u s m a t e r sc g t a u s e 作用麦芽糊精( d e = 5 ，d p = 2 2 1 ) 为例【5 4 1 ，低温下( 2 5 ) 有适宜复合剂 存在，比高温( 6 0 ) 无复合剂的情况下反应，明显增加麦芽糊精转化a 、1 3 - c d 的收率， 但对y c d 贝, i j 没有影响。也有研究表明【”】：在6 0 c 下比4 0 更容易形成大环c d 。 1 2 4 2 有机溶剂 加入有机溶剂能大大改变0 【、1 3 、7 - c d 之间的比例【5 “羽，大部分文献报道都是有 机溶剂有利于c d 总体产率的提高，但是也有些来源的c g t a s e 在有机溶剂的存在下会 降低c d 的产率。例如b l a c k w o o d 6 1 】报道：从t h e r m o a n a e r o b a c t e rs p 获得的c g t 嬲e 作 用淀粉，所有有机溶剂都能提高c d 的产率，当乙醇浓度为2 6 时c d 产率达到最大。 从b a c i l l u sc i r c u l a n ss t r a i n2 5 1 获得的c g t a s e 在整体上提高c d 产率相对要小些 ( 5 1 0 ) 。然而加入t 丁醇到b c i r c u l a n s 中催化反应得到最大的1 3 - c d 选择性( 8 2 ) 。 r e n d l e m a n 锚j 报道：来源于b a c i l l u ss p a l6 的7 - c g t a s e ，在水介质中底物质量浓度为 2 5 时p 、7 - c d 收率分别为6 和1 8 ，而在水乙醇介质中p 、t - c d 收率分别为1 0 和3 5 。r i mf m a r t i n s 【5 3 j 报道从碱性菌株l s 3 c 中获得碱性c g t a s e ，乙醇的存在却对 酶活有副作用，从而降低c d 的产率。m o r is 旧】也报道有机溶剂虽能改变产物的特异性， 但是c d 的产率总体稍微下降。 1 2 4 3 底物 6 第一章绪论 制备c d 的底物包括玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉 等原淀粉以及可溶性淀粉、麦芽糊精、酸解淀粉等变性淀粉，底物状态不同，得到的 c d 产率也不同。众所周知，淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，不同类型的淀粉具有不 同的直链与支链淀粉比例，并且在淀粉分子链长、支链淀粉分子结构等方面存在一定的 差异，这些分子结构上的差异可能对c d 的生物合成产生很大的影响。 c g t a s e 主要催化四种类型的反应：一是环化反应，二是耦合反应，三是歧化反应， 四是水解作用。从c g t a s e 催化的四个反应可以看出，当有适宜的单糖、二糖受体作为 共底物在体系中共存时，c g t a s e 将催化分子间转移葡萄糖基反应即歧化反应和偶合反 应，将c d 或线形麦芽低聚糖转移到单糖或二糖。考察在复合剂存在或不存在情况下各 种糖和糖衍生物对平均聚合度为2 2 的麦芽糖转化为c d 的影响1 5 4 1 。结果表明c 2 ，c 3 ， c 4 位含游离羟基的d 吡喃葡萄糖结构对c d 生成有较强抑制作用。同时，淀粉水解物 性质对c d 的生成有很大影响【7 0 j 。 目前，国内外主要侧重于研究淀粉种类对c d 产率的影响，研究发现，以支链淀粉 为底物时可以获得比直链淀粉更高的c d 产率，因此，支链淀粉含量较高的蜡质玉米淀 粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉等被认为是理想的作用底物。研究者对淀粉种类与产物中 c d 组成之间的关系也进行了初步的研究，并研究证实，不同来源的淀粉，在同样反应 条件下c d 的收率不等【7 1 1 。 同一种淀粉，浓度不同，c d 的产率也不一样。从理论上讲，由于c g t a s e 属于葡 萄糖基转移酶，最稀溶液应当具有最高的产率。以b a c i l l u sn o 3 8 2 为例研究马铃薯淀 粉从1 到3 0 ( w v ) 浓度范围内f i - c d 收率的变化趋势，结果表明随淀粉浓度的增加 1 3 - c d 收率将下降。b a c i l l u ss p a l6 产丫c g t a s e ，在水介质中底物质量浓度为2 5 时d 、 7 - c d 收率分别为6 和1 8 ；而当底物质量浓度增加到6 时7 - c d 收率下降到2 1 1 6 引。 由b a c i l l u sm a c e r a n s 产的c g t a s e 制备c d s 时，配制4 ，5 ，6 ，10 淀粉溶液( w w ) ， 经糊化、c g t a s e 酶解，用四氯乙烷、溴苯沉淀，c d 收率分别为5 3 ，5 7 ，4 3 ，1 0 。 但大规模生产c d 时，采用高浓度淀粉具有明显的经济效益，节约设备投资和能源消耗。 而高浓度的淀粉糊化后得到的高黏度使得搅拌困难，生淀粉又不易被酶作用，因此，有 必要选择适宜的淀粉预处理方式，在降低粘度的同时尽量保证c d 产率的最大化。 曹新志【7 2 】研究得到脱支酶( 普鲁兰酶) 作用底物对c d 产率的增加有一定作用，但 作用有限。这说明，c g 协e 对支链淀粉和直链淀粉都能起作用。 1 2 4 4 金属离子 c a 2 + 对c g t a s e 的环化作用已有报道【6 8 , 7 3 - 7 5 】，由于c g t a s e 属于a 一淀粉酶系，故c a 2 + 大多都是对其酶活有稳定作用。而a 矿、c u 2 + 、m 9 2 + 、a 1 ”、c 0 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 对酶活有 明显的抑制作用。 1 3 立题依据和意义 c d 由于特殊的分子结构使其具有许多特殊的理化性质，其环状结构和空腔可以包 合不同的化合物。目前，c d 及其衍生物已经发展成为超分子化学中最重要的主体，并 7 江南大学硕士学位论文 且在食品、医药、化工、环保和分析化学等领域应用广泛。 截止目前，因为d c d 的制备条件相对简单、成本相对较低，所以c d 生产厂家绝大 多数以选择控制( 有机溶剂法) 生产p c d 为主，主要过程为：以木薯淀粉为原料，采用 c g t a s e 同时充当液化酶和环化酶，同时采用环己烷改变反应体系的平衡，选择性控制生 成更多的p c d ，最后通过结晶将p c d 分离出来。 c g t a s e 作用于淀粉得到的产物是仅、p 、1 , - c d - - 者的混合物，极少有产单- - c d 的， 而要使混合物中叶、) , - c d 分离提存需要的生产成本很高，其限制了洳、? - c d 的工业化生 产。但是，仅p c d 不能满足实际生活中的需要： 1 3 - c d 水溶解度小，其应用受到限制。 2 a c d 在生理功能上显示出无可比拟的优势，不仅能抑制肠道有害菌，而且有助于 抑制餐后血糖的升高，可作为高血糖患者与i i 型糖尿病患者防止餐后高血糖的一种有效 的降血糖保健食品原料f 7 6 , 7 刀。 3 丫c d 内腔最大，其较高的水溶性、突出的乳化性和安全性使其在食品、制药和化 妆品等领域具有很大的应用空间。 因此，提高c d 的总产率或者提高a 、) , - c d 的产率显得十分必要，而目前为实现洳、 一- c d 的产率提高，普遍采用的是有机溶剂法，但该法因存在有机溶剂的残余而导致产品 使用时的安全性问题。与此同时，随着c d 生产技术的发展，安全性较高和污染较小的 无有机溶剂工艺也得到发展和应用。 本课题旨在以淀粉为原料，通过探索无溶剂法生产过程中不同的工艺条件和不同的 淀粉预处理方式对c d 产率以及三种c d l t 例的影响，试图寻找出制备不同产物比例组成 的工艺条件规律，通过与有机溶剂法生产得到的c d 组成对比，得出有机溶剂对c d 制备 的影响。 1 4 本课题的研究内容 目前c d 的制备工艺都是针对特定的产物而选择得到的，酶法生产c d 得到的产物组 成主要与c g t a s e 、反应条件、底物、有机溶剂以及后期分离方法的选择有关，本文在研 究c d i 贝i 定方法的基础上，考虑通过研究不同的反应条件和底物对三种c d 组成的影响， 以期得到影响产物组成的规律。 本文主要研究以下几方面的内容： l 胁、丫c d 测定方法的完善 2 y c d 与溴甲酚绿包合作用的研究 3 制备条件对c d 产率和组成的影响 4 不同的淀粉预处理方式对c d 产率和组成的影响 5 有机溶剂法制备d c d 后母液的