（食品科学专业论文）猪血铜锌超氧化物歧化酶的分离纯化方法的研究.pdf

猪血铜锌超氧化物歧化酶的分离纯化方法的研究食品科学专业研究生李豪指导老师车振明摘要超氧化物歧化酶是一种金属酶，它能够使超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而消除超氧阴离子自由基对机体的危害，广泛存在于各种生物体内。目前已从细菌、藻类、霉菌、高等植物、昆虫、鱼类、鸟类和哺乳动物等各种生物体内分离得到，并通过多种方法应用到实际中，女“化妆品、医药、食品、人及动植物许多疾病的检测与治疗方面。但是大多是从动物体内提取，因动物体内s o d 含量多，活性高，相对来说免疫原性较小；而植物体内相对含量少，活性低。我国养殖业发展迅速，猪血资源丰富，但利用率不高，附加值很低，绝大部分直接排放到环境中，既造成资源的浪费，又污染了环境。猪血超氧化物歧化酶具有非常的活性，性能比较稳定，从猪血中分离纯化超氧化物歧化酶，可以物尽其用，变费为宝，有很高的社会经济效益。基于以上几方面的原因，本文探讨了从猪血中分离纯化s o d 的方法并对其稳定性进行了研究。现将研究结果报告如下：1 分离纯化研究以新鲜猪血为材料，在低温条件下，高速离心除去血浆后，用0 9 的n a c i溶液洗涤红血球。将干净的红血球中加入0 6 的t r i t o nx 1 0 0 低温下冻融处理2 小时，得到溶血液；用有机溶剂( 乙醇氯仿) 处理溶血液，低温下离心除去血红蛋白，收集上清液，得到粗酶液：将粗酶液依次进行磷酸能萃取、丙酮沉淀和适当的热处理，得到比活力比较高的酶液；再经过d e a es e p h a d e xa 5 0柱层析，得到纯化s o d 。本课题对热变性法和丙酮沉淀法的最佳工艺参数进行猪血铜锌超氧化物歧化酶的分离纯化方法的研究食品科学专业研究生李豪指导老师车振明捅要超氧化物歧化酶是一种金属酶，它能够使超氧阴离子自由基发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而消除超氧阴离子自由基对机体的危害，广泛存在于各种生物体内。目前已从细菌、藻类、霉菌、高等植物、昆虫、鱼类、鸟类和哺乳动物等各种生物体内分离得到，并通过多种方法应用到实际中，如化妆品、医药、食品、人及动植物许多疾病的检测与治疗方面。但是大多是从动物体内提取，因动物体内s o d 含量多，活性高，相对来说免疫原性较小：而植物体内相对含量少，活性低。我国养殖业发展迅速，猪血资源丰富，但利用率不高，附加值很低，绝大部分直接排放到环境中，既造成资源的浪费，又污染了环境。猪血超氧化物歧化酶具有非常的活性，性能比较稳定，从猪血中分离纯化超氧化物歧化酶，可以物尽其用，变费为宝，有很高的社会经济效益。基于以上几方面的原因，本文探讨了从猪血中分离纯化s o d 的方法并对其稳定性进行了研究。现将研究结果报告如下：1 分离纯化研究以新鲜猪血为材料，在低温条件下，高速离心除去血浆后，用0 9 的n a c i溶液洗涤红血球。将干净的红血球中加入0 6 的t r i t o nx 一1 0 0 低温下冻融处理2 小时，得到溶血液；用有机溶剂( 乙醇一氯仿) 处理溶血液，低温下离心除去血红蛋白，收集上清液，得到粗酶液；将粗酶液依次进行磷酸盐萃取、丙酮沉淀和适当的热处理，得到比活力比较高的酶液：再经过d e a es e p h a d e xa - 5 0柱层析，得到纯化s o d 。本课题对热变性法和丙酮沉淀法的最佳工艺参数进行了确定，并对工艺流程进行了优化。最终得到的s o d 产率5 7 ，比活力5 8 6 3 u m g ，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质染色和s o d 活力染色脱色后，出现了相同的条带，证明s o d 得到了纯化。2 稳定性研究温度和p h 值是影响酶活性的重要因素。实验发现，猪血超氧化物歧化酶是一种对热和酸碱度稳定性比较好的酶。温度低于6 0 时，猪血超氧化物歧化酶活力相对稳定，5 0 时，加热3 0 分钟，酶活力损失1 8 ，加热6 0 m i n ，酶活力损失3 8 ；6 0 时加热3 0 m i n ，酶活力损失2 4 ；7 0 m i n 时加热3 0 m i n ，酶活力损失5 9 ：8 0 时加热3 0 m i n ，酶活力损失7 4 ；在p h 7 o 8 0 时酶活力为最高，在p h 5 0 9 0 条件下，酶的活力相对稳定，变化幅度不是很大，酶活力损失率小于2 0 。在p h 4 0 时酶活力损失比较多，损失率接近4 0 ，p h 大小9 0 时，酶活力急剧下降，如p h = 1 0 0 时，酶活力剩余率为5 8 ，到p h = 1 2 0时酶失去活性。关键词：超氧化物歧化酶分离纯化稳定性猪红细胞a b s t r a c tr e s e a r c ho np u r i f i c a t i o no fc o p p e r z i n cs u p e r o x i d ed i s m u t a s ef r o mp o r c i n eb l o o dm a j o r ：f o o ds c i e n c ec a n d i d a t e ：l ih a oa d v i s o r ：c h ez h e n - m i n gs u p e r o x i d ed i s m u t a s ei sak i n do fm e t a le n z y m et h a tc o u l dc a t a l y z et h er e a c t i o no fs u p e r o x i d ea n i o nf r e er a d i c a l ，a n dc r e a t eo x y g e na n dc a t a l y s e s e v e r yk i n do fl i v i n gc r e a t u r eh a ss u p e r o x i d ed i s m u t a s e a tp r e s e n t ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s eh a sb e e na c q u i r e df r o mg e r m s ，a l g a e ，f u n g i ，p l a n t ，i n s e c t ，f i s h ，b i r d sa n da n i m a l ，a n di th a sb e e ne x t e n s i v e l ya p p l i e dt ot h ed a i l yl i f e ，s u c ha st h ec o s m e t i c s ，m e d i c i n e ，f o o da n dt h ee x a m i n a t i o no fs o m ed i s e a s e s b e c a u s eo ft h el o wi m m u n o g e n i c ，h i g hc o n t e n ta n da c t i v i t yo fs o di na n i m a l ，i ti si s o l a t e da n dp u r i f i e df r o ma n i m a l sb l o o d w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h el i v e s t o c kb r e e d i n g t h er e s o u r c eo fp r o c i n eb l o o di sb e c o m i n gm o r ea n dm o r e h o w e v e r , m o s to ft h ep r o c i n eb l o o dc a n tb eu s e d ，w h i c hw a s t et h er e s o u r c ea n dp o l l u t et h es u r r o u n d i n g s o di sp r o d u c e df r o ms w i n eb l o o d ，w h i c hi sag o o dt h i n gt h a tc a nm a k eg o o dp r o f i t s a c c o r d i n gt ot h e s er e a s o n s ，s u p e r o x i d ed i s m n t a s e ( s o d ) ，w h i c hp l a y sav e r yi n p o r t a n tr o l ei np r o t e c t i n go r g a n i s m sf r o mo x y g e nt o x i c i t y , w a sp u r i f i e df r o mp o r c i n ee r y t h r o c y t ei nt h i sp a p e r t h es t a b i l i t yo fs o dw a sa l s os t u d i e di nt h i sp a p e r 1 、s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nf i r s t ，e r y t h r o c y t em e m b r a n c e sw e r ed i s i n t e g r a t e dv i af r e e z e - t h r a wm e t h o d si nt h ep r e s e n c eo ft r i t o nx 一1 0 0 s e c o n d ，p o r c i n ee y t h r o c y t ec o a r s ec u z n - s o dw a so b t a i n e db ys e v e r a ls t e p s ，w h i c hw e r ea b o u tr e m o v i n gh e m o g l o b i nb ye t h a n o la n dc h l o r o f o r mf i r s t l y , e x t r a c t i o nb yd i p o t a s s i u mh n r o g e np h o s p h a t es e c o n d l y ，p r e c i p i t a t i o nb ya c e t o n et h i r d l y , h e a td e n a t u r a t i o nf o u r t h l y , e t c i nt h ee n d ，t h r o u 【g hd e a es e p h a d e xa - 5 0 , i tw a sc o m p l e t e l yp u r i f i e d t h ey i e l da n dt h es p e c i f i ca c t i v i t yo fs o da f t e rt h i sp r o c e s sw e r e5 7 a n d5 8 6 3 u m g , r e s p e c t i v e l y p u r i f i e ds o dw a st e s t i f i e db yp a g ee l e c t r o p h o r e s i s 2 、s t a b i l i t ys t u d yt e m p e r a t u r ea n dp hv a l u ea r et w oi m p o r t a n tf a c t o r st h a ta f f e c tt h ea c t i v i t yo fs o da n ds o dh a sag o o ds t a b i l i t yo nt h ec o n d i t i o no ft h e m t h ee n z y m a t i ca c t i v i t yi sc o m p a r a t i v e l ys t a b l eb e l o w6 0 ，f o re x a m p l e ，t h ec r u d es o ds o l u t i o nb e i n gk e p ti n6 0 cf o r3 0m i n u t e ，t h ee n z y m a t i ca c t i v i t yo n l yr e d u c e s2 4 ；h o w e v e rt h et e m p e r a t u r er a i s e dh i g h e rt h a n7 0 c ，t h ea c t i v i t yr e d u c e so b v i o u s l y ，s u c ha sr e d u c i n g5 9 o nt h ec o n d i t i o no f7 0 cf o r3 0m i n u t ea n d7 4 o nt h ec o n d i t i o no f8 0 。cf o r3 0m i n u t e s t h ee n z y m a t i ca c t i v i t yi ss t a b l ew i t h i np h5 9 ；o n c ee x c e e d i n gt h i sr a n g e ，i tr e d u c e sd e e p ly f o re x a m p l e ，t h er e s ta c t i v i t yi s6 0 o nt h ec o n d i t i o no fp h4 0a n d5 8 o nt h ec o n d i t i o no fp h1 0 0 t h ea c t i v i t yi sn o t h i n go nt h ec o n d i t i o no fp h1 2 k e yw o r d s ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，s t a b i l i t y ,p o r c i n ee r y t h r o c y t e西华大学硕士学位论文1 引言超氧化物歧化酶( s o de c 1 1 5 1 1 ) 是一类催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的金属酶。超氧阴离子自由基几乎和人类常见的几种主要疾病都有关系，如老年性痴呆症、震颤麻痹症、动脉粥样硬化、血栓形成、心肌缺血再灌流损伤、肝炎、糖尿病、癌症、白内障、视网膜损伤等都与自由基有关【l l o 根据所含金属离子的不同，s o d 可分为c u 办一s o d 、f e s o d 、m n s o d ，最近又发现一种n i s o d e 2 , 3 1 。研究表明，s o d 因为能够消除体内的超氧阴离子而对于超氧阴离子引起的一系列疾病具有防治作用。它可以治疗多种炎症、自身免疫性疾病、防治缺血一再灌流损伤等【“】。它还有抗衰老、防止皮肤色素沉着等作用。s o d 也是药品、饮料、保健品、化妆品等的添加剂。我国养殖业发展迅速，动物血液资源日益丰富，可是对动物血液利用率却很低，一般主要用来制备纯血粉或发酵血粉，其中猪血占了比较大的比例，但都难以产业化、规模化。我国大多数屠宰场中，猪血利用率不高，附加值低，有的直接排放到环境中，造成了环境污染。本课题的意义就是将这部分被废弃的血球利用起来，物尽其用，变废为宝，充分发挥废弃物资源的作用。对于猪血超氧化物歧化酶的分离纯化已有人们做过这方面的研究，但由于许多生产成本过高，工艺条件苛刻，生产比较困难，本实验对猪血超氧化物歧化酶的分离纯化工艺进行了研究，探索出简单易行成本不高的生产工艺，同时对猪血超氧化物歧化酶的稳定性进行了评价。综上所述，无论从科学性、创新性、效益性来将，本课题都具有研究开发价值。第1 页共5 7 页两华大学硕士学位论文2 综述2 1 课题名称猪血铜锌超氧化物歧化酶分离纯化方法的研究2 2 超氧化物歧化酶的研究概况2 2 1 超氧化物歧化酶的发现及其分类超氧化物歧化酶，简称s o d ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) ，是一种广泛存在于动、植物及微生物中的金属酶。早在1 9 3 9 年m a n n 和k e i l i n 就从牛血中分离到这种金属蛋白，并命名为血铜蛋白。直至1 9 6 9 年m c c o r d 和f r i d o v i c h l 7 , 8 1 发现了它的酶活性后，才命名为超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，缩写为s o d ) ，并引起了人们的高度重视。目前人们按金属辅基的不同己发现了四种s o d ，分别是c u z n s o d ，m n s o d ，f e - s o d 和n i - s o d 。在哺乳动物的细胞外液和结缔组织细胞外基质中，还存在一种胞夕b s o d 子( e x t r a c e l l u l a rs o d ，简称e c s o d ) 。e c s o d 是清除细胞5 f 0 2 的主要酶，其活性部位与c u ，z i l - s o d 具有高度的同源性，区别在于所含亚基的不同。e c s o d 是四聚体，由4 个分子量约为3 4 k d 的亚基组成( 大鼠是二聚体) ，其表达具有种属和组织的特异性，在人类成纤维细胞、胶质细胞和平滑肌细胞可以分泌，然而上皮细胞和内皮细胞则不能【9 】。实验表明，种类不同，s o d 含量不同。以红细胞为例，几种动物红细胞中c u z n s o d 活性大小，依次为兔( 3 1 6 u m l ) 牛( 2 8 6 u m l ) 绵羊( 2 8 4 u m l ) 猪( 2 0 0 u m l ) 人( 1 5 5 u m l ) 鸽( 1 0 0 u m l ) 鸡( 7 1 u m l ) 。不同生物s o d含量不同，即使同种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其s o d 的种类数量也不同。以人体为例，肝脏中的c u z 1 1 s o d 含量最高，肥大组织最低：m n s o d 肝脏中含量最高，红细胞中不含m n s o d 1 0 】。2 2 2s o d 不同类型的进化1 1 1 , 1 2 】存漫长的生物进化过程中，生物体内s o d 的种类、性质、数量等有着相第2 页共5 7 页西华大学硕士学位论文应的变化。在地球发展史上，早期地壳外没有氧气，此时地球上的生物为绝对厌氧菌，其体内不含有s o d 。随着地球年龄增长，地壳外有了氧气，虽然开始时氧气量甚少，但势必使多种绝对厌氧菌大量死亡，甚至灭种。有少数绝对厌氧菌在无氧的外环境中存活，繁衍至今，其中有个别绝对厌氧菌在有氧的环境下，为了生存，含有极少量的f e s o d 。有些绝对厌氧菌为了适应外环境存在的氧气就进化成耐氧菌，再进化成需氧菌，这些菌含有f e s o d 和m n s o d 。随着生物的进化，某些原核生物、藻类、植物和动物体内存在c u z n s o d 和m n s o d ，c u z n s o d 一般在胞浆，而m n s o d 存在于线粒体中。从结构上看，f e - s o d 与m n s o d 很相似，而与c u ，z 1 1 s o d 差别较大。2 2 3s o d 与氧自由基自由基是指带有未成对电子的分子、原子或离子。因为未成对电子具有成双的趋向，因此常易发生失去或得到电子的反应而显示出较活泼的化学性质。在生物物体内，氧分子可以通过单电子接受反应，依次转变为0 2 + 、h 2 0 2 与o h等中间产物。由于这些物质都是直接或间接地由分子氧转化而来，而且具有比分子氧更活泼的化学反应性，统称为活性氧，其中0 2 。为主要的氧自由基【1 3 , 1 4 】。2 1 2 3 1 自由基特点如果涉及到s o d 生物学作用，不得不涉及到超氧阴离子自由基。下面将对自由基的有关情况加以介绍。任何包含一个未成对电子的原子或原子团，均称为自由基。自由基有三个明显的特点，一是反应性强，二是具有顺磁性，三是寿命短。超氧阴离子自由基是所有氧自由基中的第一个自由基，也是最不活泼的，但可以经过一系列反应生成其它较活泼的氧自由基。它在水溶液中的存活时间约为1 秒，在脂溶性介质中的存活时间约为1 小时，因而它有足够的时问扩散到较远的距离，并经过一系列反应生成其它氧自由基，可对细胞内的膜脂、蛋白质、酶、核酸和线粒体等进行广泛的攻击，因而产生了极大的毒害作用，可引起溶酶体裂解，线粒体衰老，染色体断裂和膜脂崩溃等【1 5 。幸好生物体内己发展出的s o d 可有效地清除超氧阴离子。我们知道生物体内存在着产生和消除超氧阴离子的平衡体系，一旦平衡被打破，生物体将可能产生某些疾第3 页共5 7 页西华大学硕十学位论文病死亡。但同时生物也会迅速调节s o d 的相应变化，以利生存。然而有时调节是不够的，尚需有外源的清除氧自由基的s o d ，这将涉及到药物s o d 治疗疾病的情况。2 2 3 2 氧自由基的产生与危害自由基的产生，从物理化学的角度，通常有下列几种方式：( 1 ) 共价键的热分解。原则上只要有足够的温度，任何共价键都可以裂解而产生自由基。( 2 ) 辐射分解。电离辐射可使许多物质发生分解而产生自由基，紫外线对机体的损伤也能够产生自由基。( 3 ) 单电子氧化还原反应体系内许多酶的反应是进行单电子转移，此过程可产生自由基。从细胞生物学与生物化学的角度，所有细胞内线粒体、内质网、细胞核、质膜和胞液中，都可产生自由基，也可出现在胞浆代谢及呼吸链中，体内的某些代谢也产生氧自由基。由此可见，氧自由基是体内正常代谢的中间产物【1 6 l 。氧自由基过剩时，可使体内许多重要的生物大分子发生超氧化反应，如使核酸、蛋白、膜多聚不饱和脂肪酸等生物大分子出现交链或断裂，导致细胞结构和功能的破坏，引发各种疾病。2 2 3 3 氧自由基的清除1 7 , 8 1生物体清除氧自由基的功能是由一些抗氧化剂和完整的酶系统来组成的。抗氧化剂包括维生素c 和e 、谷胱甘肽以及b 一胡萝h 素等，酶系统包括s o d ，过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶等。s o d 组成了防御自由基损伤的第一道防线，s o d 的催化过程如下：2 0 2 + 2 h + h 2 0 2 + 0 2s o d l 每0 2 - 歧化生成h 2 0 2 ，c a t 的功能是催化h 2 0 2 生成水，该步骤需谷胱甘肽作为供氢体，而谷胱甘肽过氧化物酶则将h 2 0 2 还原为无毒化合物，以免它们重新分解成自由基，所以c a i ，和谷胱甘肽构成了机体防御自由基损伤的第二道防线【1 7 1 。第4 页共5 7 页西华大学硕士学位论文2 2 4c u z 一s o d 的作用机理由于0 2 一之间带有相同的负电荷彼此相互排斥，在常规条件下，它们很难靠近并发生反应，但在有c u z n s o d 的参与下，0 2 就可以通过c u 2 + 一s o d 配位而获得活化，消除它们之间的静电斥力，发生歧化反应。c u z n s o d 多为酸性蛋白质，其分子表面带有负电荷的部分较多，而在活性中心多带正点荷。所以，0 2 一很难在非活性中心部位发生碰撞，而只有在活性中心它们才有可能相互靠近，发生反应。可是作为底物的0 2 。寿命很短。这给酶催化机理的研究带来了很大的困难。在一般的情况下，多采用化学方法去除酶分子中的z n 2 + ，保留酶分子中原有的c u 2 + ，其酶仍然有很高的催化活性，其他的研究也证明了这一点。这表明酶分子c u 2 + 的存在对酶活性有着重要的作用，目前，对酶的反应机理，有如下反应式：0 2 一+ c u 2 + s o d - - + c u + s o d + 0 2c u + - s o d + 0 2 + 2 盯_ c u 2 + - s o d + h 2 0 2张静怡，司徒仲意通过氧化一还原电位及电极电位阐述了s o d 中c u + 与c u “之间相对稳定，可以相互转换。已知铜与4 个组氨酸残基配位，同时还和一个水分子配位，0 2 有可能取代水分子而与铜离子配位，从而发生第一步反应，在第二步反应中需要质子的参与，但就质子的来源有不同的说法，b a n c i 等应用分子反应动态学方法研究了c u z n s o d ，结果表明在催化过程中与c u f i i ) 相 g 的a r 9 1 4 1 具有重要的作用。而f r e e 用停留法对s o d 催化0 2 - 歧化反应动力学研究，认为催化0 2 。歧化反应形成h 2 0 2 所需的质子来自溶剂并非“咪唑桥”但蔡敬杰等【18 ，1 9 】认为在催化过程中，每吸收一个质子，“咪唑桥，与铜相连一侧的n 原子快速的发生质子化和去质子化的变化。l e p o c k 等指出，c u z n s o d 是通过铜离子的循环氧化还原过程催化超氧阴离子歧化成过氧化氢和分子氧的。z n “起到稳定酶蛋白的作用，因此，她的间接参与有助于0 2 - 的催化。对m n s o d 和f e s o d 的催化机理的研究进展远不及c u z n s o d ，在很多方面都不是很清楚，但两类酶的共同点都涉及到活性部位内金属离子的交替还原或再氧化。第5 页共5 7 页西华大学硕士学位论文2 2 5c u z n s o d 的性质及其研究概况2 2 5 1s o d 具有短时间的耐热性能s o d 对热稳定，天然牛血s o d 在7 5 下加热数分钟，酶活丧失很少。如果离子强度很低，即使加热至4 9 5 ，其活性亦无明显影响。在5 5 。c 保存1 5 3 0 r a i n ，6 0 。c 保存l o 2 5 m i n ，6 5 保存1 0 1 5 m i n 对酶的活性影响不大。f r i d o v i c h 7 - 2 0 l等认为上述异常高的热稳定性应归因于酶分子中的金属辅基。s o d 去金属后，热稳定性明显下降。2 2 5 2p h 对s o d ：；- g 性的影响一般认为s o d 在p h 5 3 9 5 范围内，其稳定性较好，对p h 不甚敏感。s a l i n等报道c u z n - s o d 在p h 5 3 9 5 范围内基本稳定，在此范围内可见紫外光谱和电子自旋共振波儿乎不发生改变，显示较强的结构稳定性【2 ”。李泽浩1 2 2 】报道在p h 为3 6 时，c u z n s o d q b 9 5 的z n 2 + 要被脱落，! e p h d 、于6 0 时c u 2 + 的结合位点仅要移动，p h 大于1 2 2 时，酶会因构象发生变化而失活。s o d ) 紊j p h 的稳定性同样归因于金属辅基的存在，旦去除金属离子，其稳定性就大大下降。实验表明，不同来源的s o d ，其等电点这p i 值也不相同，见表2 1表2 1 不同来源s o d 的等电点t a b l e 2 - 1p lv a l u eo f s o df l o md i f f e r e n tm a t e r i a l s2 2 5 3 电泳图谱 2 3 1不同来源的铜锌s o d 在聚丙烯酰胶凝胶电泳图谱中显示的酶带数也不尽相同，如牛红细胞s o d 显示一条酶带。人红细胞s o d 为两条酶带。b n n i s t e r箱6 页共5 7 页西华大学硕士学位论文等发现人红细胞s o d 的两条酶带为两种s o d ，w e i s i g e r 与f r i d o v i c h l 8 1 发现的小鸡肝s o d 的三条酶带可能都是电荷性质不同但分子量相同的s o d 同工酶。袁勤生发现在用琼脂糖凝胶电泳中猪血s o d 有五个酶带，而邹国林在用聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳显不- - 。,。- 。m - | 2 4 1 。看来s o d 在不同的电泳条件下呈现出不同的酶带数。2 2 5 4 酶活性c u z n s o d 可催化0 2 - 歧化为h 2 0 2 与0 2 。酶的活性1 7 1 不仅决定于酶蛋白，而且还决定于c u 2 + 与z “。在一般的实验条件下，该酶的蛋白质颇为稳定，其主要几点为依据：a 能耐受t s u c m h a s h i 氏步骤，不致被乙醇氯仿破坏。b 不易被蛋白酶水解的影响。c 在3 7 。cp h 7 0 ，0 0 5 m o l l 磷酸钾缓冲液中，s o d 活性可保持三周以上。d 以圆二色谱作为判断酶有无变化的指标，则发现c u z n s o d 不受8 0 m o i l 尿素的影响。e 用4 s d s 处理，c u z n s o d 不能完全解聚为亚基，而且酶活性也不很受影响。但是，在特定的实验条件下，酶活性可下降，甚至完全丧失。氰化物可抑制c u ，z n s o d 活力【2 5 1 。力i a i o 。m o l l 的c n ，可使其活性几乎完全丧失。h 2 0 2可使c u z n s o d 活性下降【2 6 】。氯化胍能抑制c 蛇n s o d 活性l z 0 ，如在p i l l 0 2 的条件下，0 2 m o l l 的氯化胍可抑制酶4 0 的活性，1 2 m o l ，l 可抑制l o o ，但用稀释方法也可使抑制可逆。2 2 5 5 分子量c u z n s o d 是一个二聚体，均含有两个相同的亚基，每个亚基有一个c u 2 +$ z n 2 + ，全酶分子量一般为3 1 0 0 0 3 3 0 0 0 道尔顿，亚基分子量为1 5 0 0 0 1 7 0 0 0道尔顿【2 8 】。m n s o d 的相对分子量随来源不同而异，来自原核生物的m n s o d相划分子量约为4 00 0 0 道尔顿，由2 个亚基组成，每个亚基各含有1 个m n 2 + ，其第7 页共5 7 页西华大学硕士学位论文分子量为1 9 0 0 0 2 1 0 0 0 道尔顿；来自真核生物线粒体的m n s 0 d ，相对分子量为8 00 0 0 道尔顿，由4 个亚基组成，每个亚基分子量为1 9 5 0 0 2 1 0 0 0 道尔顿。f e s o d 广泛存在于原核生物中，按其结构可分为两类，一类是分子量约为4 0 0 0 0 5 0 0 0 0 道尔顿的二聚体，亚基分子量约为2 0 0 0 0 2 6 0 0 0 道尔顿；另一类是分子量约为8 0 0 0 0 9 0 0 0 0 ，道尔顿的四聚体，其亚基分子量约为2 3 0 0 0 道尔耐2 9 1 。2 2 5 6 歧化反应速度c u z n s o d 在催化反应下歧化反应速度常数大约为1 8 1 0 9 ( m o l l ) - 1 s ，为二级反应，而且在p h 5 3 1 0 5 范围内几乎不变。在p h 7 0 时m n s o d 和c u z n s o d 催化速率常数一样，但在碱性条件下明显减d , ( p h 7 8 时，k = 1 8 1 矿( m o l l ) a s ，而p h = 1 0 2 时，k = 0 3 x 1 0 9 ( m o l l ) l - s 。而也有不同实验表明：m n s o d 有较宽的最适p h 范围( p h 7 1 1 ) 【删，f e s o d 在高p h 时，活性降低。2 2 5 7s o d 的半衰期s o d 作为种机体内酶，它的半衰期很短，目前，据报道【3 1 1 从不同生物体中所获得s o d ，其半衰期一般只有6 1 0 m i n ，这在很大程度上限制了s o d 的应用。但s o d 的冻于粉在4 c 冰箱里可储存2 天左右，s o d 的半衰期虽然很短，可在体外很稳定。然而s o d 经化学修饰后可延长在体内的半衰期【3 2 1 。阎家麒【3 3 】等认为s o d 在体内半衰期短的原因之，可能是由于含有极少的非极性氨基酸。2 2 5 8 金属辅基与酶活性s o d 是金属酶，用电子顺磁共振测得，每t o o l 酶含1 9 3m o l 的c u 和1 8 0m o l 的z n ( 牛血c u z n s o d ) ：1 8 4m o lc u 和1 7 6m o lz n ( 牛一t j , c u z n s o do 实验表明，c u 与z n 的作用是不同的，z n 仅与酶分子结构有关，与催化活性无关，而c u 与催化活性有关，透析去除c u 则酶活性全部丧失，一旦重新加入，其活性又可恢复。同样，在m n s o d ，f e s o d 和n i s o d 中，m n ，f c 和n i 与c u 一样，对酶活性是必需的【3 5 0 6 1 。西华太学硕士学位论文2 2 5 ，95 0 d 的紫外吸收s 0 d 具有特殊的光吸收【3 4 l ，它在2 8 0 m n 处没有吸收高峰，这是因为在s d d分子中酪氨酸和色氨酸含量很低的缘故，不同来源s o d 的紫外吸收值见表2 2 。裹2 - 2 爸牵争来源s o d 魄紧羚吸设遵t a b l e 2 2u l t r a v i o l e ta b s o r p t i o ns p a ；t r a mo fs o df r o md i f f e r e n tm a t e r i a l s对某种s o d 来说，其特定的紫外吸收值与a 2 8 0 。的比值可视作该酶的种纯度指标，例如。猪自l c u z n - s o d 在2 6 3 n m 附近有最大吸收值，而在a 2 s o 。处从红细胞中提敦g o d 应考虑的主要是杂蛋白，样品在2 r 0 m n 处吸收值大，则表明杂蛋白含量较高，猪血c u z n s o d 的a 2 6 3 a 2 8 。比值约为1 3 4 。2 2 5 坞瘩液介电絮数对s q d 活幢磅影响溶液介电常数对s o d 酶活性有较犬影响，大多数来源的c u z ：n s o d 等电冉小于7 。这样在生理条件s o d 带的是负电荷。这就阻碍了底物超氧阴离子与酶分子的接近。另外c u z a - s o d 分子的表面积很大，囚北超氧阴蔫子与酶分子的碰撞大多效是无效的。而酶的催化反应常数约为z x l 矿( m o l l ) r s1 ，如此高的反应速度可能是e h 于酶分子活性中心附近e n h 3 0 为超氧阴离子进入活性中，1 1 ,提供了静电吸引力。然而两个静电菥相互作用与介电常数成反l e ，当溶液的介龟常羚增王i 口时，碱弱了觚话性中心渴圉正点葡纠0 2 的静电啦；1 力，同时屯疵第9 页共5 7 页西华大学硕士学位论文弱了酶分子表面负电荷对0 2 的静电排斥作用【3 7 】。二者共同结果是较多的减弱了正电荷的静电吸引，从而导致酶活性下降。对有机溶剂来说，它们的介电常数很小，同时在某种程度上也会导致s o d 的构象发生改变，所以，它会使酶活性下降更明显。2 2 1 5 1 l 金属离子对s o d 活幽均影响不同浓度的金属离子对s o d 的活性有着不同的影响，在低浓度下，它可以提高s o d 的活性，而在高浓度下s o d 的活性将显著下降。当h 血“和c u “的离子浓度小于l m m o l l 时，对酶的活性有一定的激活作用。而b a 2 + ：f 1 1 m 9 2 + 的离子浓度即使大于1m m o l l ，随着b a 2 + 年1 m 9 2 + 浓度升高，对s o d 的激活作用会逐渐增强。当c a 2 + 浓度为0 5 m g l 时，能够提高s o d 的活性，而当浓度升至l j l m g l 时，酶活性显著下降。z n 2 + 对s o d 贝l j 具有抑制作用，当z l l 2 + 的浓度达至l j 3 m m o l l 后，酶活力完全丧失。2 2 5 1 2s o d 的结构特征第一种类型c u ，z n s o d ，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量在3 2 0 0 0 左右，由两个亚基组成，每个亚基含有1 个铜和1 个锌。不同来源的c u z n - s o d 的氨基酸序列，无论是来自细菌、真菌高等植物细胞质或叶绿体，还是来自高等动物和人的细胞质，它们的同源性都较高。有些氨基酸很保守。在o i l z 1 1 s o d 的氨基酸组成中，酩氨酸和色氨酸的含量甚微，甚至没有。而甘氨酸含量较高，每6 8 个氨基酸残基中就有一个甘氨酸残基。在高级结构方面，c u z n s o d 具有8 股逆向平行b 一折叠，另外尚有环状的无规则结构和约5 的a 一螺旋。t a i n e r 等获得了牛红细胞c u 历一s o d 的0 2 n m 分辨率的电子密度图，显示出亚基的结构核心是一个由八股反向平行的折叠围成的圆桶状结构称之为b 桶( b b a r r e l ) 其外缘一边有t h r l 3 5 ，g l y l 3 6 ，a l a l 3 8 年1 g l y l 3 9 ，另一边为g l y 5 9 ，p r 0 6 0 ，h i s 6 1 ，p h e 6 2 ：f 1 a s n 6 3 组成。在b 桶底部c u 与h i s 4 4 ，h i s 4 6 ，h i s 6 1 ； h i s l l 8 目连接，z n 与h i s 6 1 ，h i s 6 9 ，h i s 7 8 和a s p 8 1 相连。c u z n之间通过h i s 6 1 形成“咪唑桥”结构，在“咪唑桥”结构中，咪唑环几乎与c u ，z n 金属离子在一个平面上，仅向c u 侧倾斜了约0 0 3 n m ，所有的五个非配位的咪哗氮西华大学硕士学位论文和非配位的天冬氨酸8 1 残基中的氧都是氢键相连，而h i s 6 1 的咪唑基的吡咯氢己被除去。此外，天冬氨酸1 2 2 和组氨酸6 9 年1 组氨酸4 4 之问形成氢键，由此构成了c u ，z n 之间第二座间接桥，这两座桥在酶的催化反应过程中的酶结构的稳定起着重要作用。5 5 位平1 1 4 4 位的半胱氨酸形成的二硫键是c u ，z n s o d 中唯一的一对键内二硫键，对维持c u z i l s o d 结构的稳定也起着重要的作用。进一步研究表明【3 8 l 在催化过程中与c u ( 1 1 1 相距的a r g l 4 1 具有重要作用如果该残基被修饰，大部分正电荷消失，不利0 2 。的进入，酶活性降低9 9 ，c u 2 + 与z n “对活性中心的作用也不同，c u 2 + 是必需的，任何金属取代c u 2 + 都可使酶失活，而z n被c o 、h g 、c d ，取代而不影响其活性。文献1 3 9 j 上报道的猪血c u z n s o d 也是如此。第二种类型m n s o d 4 0 i ，呈粉红色，主要存在于原核生物基质和真核生物的线粒体中，人和狒狒肝细胞的胞液内也含有一定量的m n s o d ，其分子量随来源不同而异。任何生物产源的m n s o d 的一级结构的同一性都很高。不仅如此，参与形成活性中心及与金属连接的氨基酸在所有m n s o d 中都是保守的，而且与金属锰相连的氨基酸也完全一致，它们是h i s 2 6 ，h i s 8 7 ，h i s l 8 1 f f f l a s p l 8 5 。m n s o d 的c d 谱表明，其含有较高程度( 大于3 2 ) 的a 螺旋结构，较少b 拆叠。由一级结构预测的二级结构表明，m n s o d 中不可能存在象c l l z n s o d 那种八股反平行的b 折叠，也不存在长的松散环，整个结构比较紧凑。e s r 和n m r研究揭示m n s o d 中的金属离子是处于高自旋状态的3 价锰m n “。m n s o d 的金属辅基上结合有1 个水分子。金属辅基对蛋白质结构有稳定作用而且与m n s o d的活性直接相关。m n s o d 晶体的电子密度图分辨率为0 1 8 n m ，每个亚基包含2个结构域，1 结构域由3 个a 螺旋组成，另2 个结构域由3 个a 螺旋和一个b 折叠组成，金属结合位点就在这2 个结构域之间。围绕活性中心的是几个呆守的芳香族氨基酸，其中有3 个t y r 和2 个p h e ，都在距金属离子l n m 的范围内。在m n s o d中，8 3 位年f 1 1 6 0 位的氨基酸在空间结构上距离很近。m n s o d 中与1 6 0 位g l n f e 邻的8 2 ，8 3 位氨基酸是体积较小的g l y 。m n s o d 的活性中心都是具有五配位的三角双锥结构【4 ：l 】，其中一个轴向配体为水分子，来自蛋白质辅基的4 个配位基为h i s 2 8 ，h i s 8 3 ，a s p l 6 6 干u h i s l 7 0 。后3 个配位基位于赤道平面，h i s 2 8 的咪唑基则占据着另一个轴向位置。活性部位两华大学硕士学位论文处在一个主要由疏水残基构成的疏水壳子里，两个亚基链共同开成一个通道，陔通道终止于金属离子附j 匠f i c j t r y 3 6 和h i s 3 2 残基，是底物或其他内界配体接近m n 的经由之路。h i s 3 3 ，t r p 3 7 ，h i s 8 3 和t y r 3 6 形成一个疏水口袋。该1 ：3 袋构成底物结合部位。第三种类型f e s o d ，呈黄色，只存在于真核细胞中，分子量在3 8 0 0 0 左右，由两个亚基组成，每个亚基各含1 个铁，其活性中心的f e 由三个组氨酸、一个天冬氨酸及一个r t 2 0 酉2 位 4 2 1 。主要存在于原核细胞中，近年来陆续发现某些真核生物，例如一些真核藻类，甚至某些高等植物如油菜、柠檬、银杏、番茄、水百合等体内也存在。在高级结构方面，到目前为止，发现f e s o d 具有二聚体和四聚体【4 3 】两种形式。每一种形式都由各自相同的亚基组成。高嗜温性菌株s s o l f a t a r i c u s 的f e s o d 晶体结构显示，在每一对称亚基中含2 个相同单体，形成一个紧凑的四聚体，与来源于结构分支杆菌的嗜温性s o d 相比，在亚基之间的f e 离子对的数量增多。电子数据显示在活性部位保留氨基酸t y r 残基上存在特别的共价修饰。这可能与酶的特殊高嗜温性相关。第四种类型是n i s o d ，含n i 离子，称为n i s o d ，是近年来才发现的一种新型s o d ，目前只有从链球菌中分离得到，对其研究还较少】。2 2 5 1 3s o d 的化学修饰超氧化物歧化酶( s o d ) 是0 2 天然清除剂，具有广泛的医用价值，可作为药品及食品、曰化产品的添加剂。天然s o d 稳定性较差，具有异源蛋自的免疫原性，在体内半衰期短，只有5 1 0 m i n ，抗胃蛋白酶水解能力差。而限制了其应用。国内