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高效脱色菌的选育及对染料废水脱色的研究 摘要 本论文对微生物在染料废水脱色中的应用进行了研究，并探讨了各种因素对 微生物降解染料效果的影响。主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 从印染厂排污口的沉积物及处理废水的活性污泥中分离出多株菌种，通 过驯化筛选出三株对染料有脱色作用的菌株，这些菌株在以染料为单一碳源是并 不能表现出较好的脱色效率，当加入葡萄糖为辅助碳源时，则表现出较强的去除 染料的能力。 ( 2 ) 研究表明外加碳源浓度、染料初始浓度、染料结构、接种量以及各种环 境因素，如温度、p h 值，对菌种的生长繁殖和对染料的脱色效果具有一定的影 响。从不同降解时期染料的u v 谱图上可以看到降解过程中，染料的特征吸收峰 逐渐的消失，同时在谱图上可以观察到新的吸收峰。 ( 3 ) 研究发现葡萄糖和蛋白胨的生物培养液对偶氮染料具有较强的脱色作 用。并在其培养液中筛选出一株细菌，该菌株在以染料为单一碳源和能源物质时 对染料不具有脱色作用，但是表现出了较强的共代谢去除染料的能力。 ( 4 ) 研究各种因素对染料化合物共代谢脱色行为的影响。该菌种在温度2 0 ( 2 4 0 的范围内，p h 值在6 一1 0 范围，可以达到很好的脱色效果，脱色率可以达 到8 0 以上。 ( 5 ) 研究以菌种o z 为优势菌的混和茵悬液对染料的共代谢降解行为，为此菌 株在实际应用中奠定基础。试验表明，外源营养物浓度对共代谢脱色的影响较大， 当染料浓度为l o m g l 时，蛋白胨浓度大于2 0 0 m g l 对各种染料的脱色效果才明 显。 关键词：微生物印染废水脱色生物降解共代谢 t h es e l e c t i o no ft h ee f f e c t i v em i c r o o r g a n i s mo fd y e s t u f f d e g r a d a t i o na n dr e s e a r c ho fd e c o l o r i z i n gd y e i n gw a s t s w a t e r a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，w er e s e a r c ht h ea p p l i c a t i o no fm i c r o o r g a n i s mi nd y e i n gw a s t e w a t e r t r e a t m e n t ，t h ei n f l u e n c et ot h ee f f e c to fd e c o l o r i z i n gd y e sw a si n v e s t i g a t e di nv a r i o u s f a c t o rc o n d i t i o n t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dc o n d u s i o ni s 踮f o l l o w ： ( 1 ) m a n yb a c i l l u sw e r es e p a r a t e df r o ms e d i m e n ti nl i m b e rh o l eo fp r i n t w o r k sa n d a c t i v es l o bw a s t e w a t e r t h r o u g hd o m e s t i c a t i n gw i md y e s t h r e eb a c i l l u sw i t hb e t t e r d e e o l o r i z a t i o na b i l i t yw a ss i e v e d ，t h e s eb a c i l l u sc o u l d n td e c o l o re f f e c t i v e l yw h e n d y e sw a st h es o l es o u r o f c a r b o n t o j o i nt h eg l u c o s ef o ra c c e s s o r i a lc a r b o ns o u r c e ， t h e nt h e s eb a c i l l u se x p r e s sas t r o n g e ra b i h t yo fd e c o l o r i z a t i o n ( 2 ) i nt h i ss t u d y ，t h ec o n c e n t r a t i o na c c e s s o r i a lc a r b o ns o u r c e ，t h ei n i t i a ld y e s c o n c e n t r a t i o n ，s t r u c t u r eo fd y e s ，q u a n t i t yo fi n o c u l a t i o n ，a n dv a r i o u se n v i r o n m e n t a l f a c t o r s ，s u c h 踮t e m p e r a t u r e ，p hw a sr e s e a r c h e d b a c i l l u s sb r e e da n dt h ee f f i c i e n c yo f d e c o l o r a t i o nw a sa f f e c t e db yt h e s ef a c t o r s f r o mt h ed i f f e r e n tu v s p e c t r u m so fd y e s d e g r a d a t i o np r o g r e s s ，w ec o u l df i n dc h a r a c t e r i s t i ca b s o r bp i c kd e c r e a s e dg r a d u a l l y n e wa b s o r bp i c ka p p e a rs i m u i t a n e i t y 。 ( 3 ) t h r o u g hr e s e a r c h i n g ，w ef o u n d t h ea z o d y e sc o u l db ed e c o l o r i z e di nc u l t i v a t i o n s o l u t i o no fg l u c o s ea n dp e p t o n e ，a n dd e c o l o r i z a t i o ns t r a i n ak i n do fb a c i l l u sw a s i s o l a t e df r o mt h i sm i x t u r e t h eb a c i l l u sc o u l d n td e c o l o r i z ew h e nt h ed y ew a st h e s o l es o u r c eo fc a o b o na n de n e r g y h o w e v e r ，t h es t r a i nh a ss t r o n ga b i l i t yt o c o m e t a b o l i s md e c o l o r i z a t i o n ( 4 ) v a r i o u sf a c t o rc o u l de f f e c tc o m e t a b o l i s md e c e l e r a t i o nb e h a v i o rt ot h e d y e s t u f fc o m p o u n d t h eb a c i l l u sh a sb e t t e rd e c e l e r a t i o na b i l i t yi nc o n d i t i o no f2 0 c e n t i g r a d et o4 0c e n t i g r a d ea n dp hv a l u ei nt h er a n g eo f s i xt ot e n a n dt h e d e c o l o r a t i o nr a t ec a na t t a i n ta b o v e8 0 ( 5 ) t h ec o m e t a b o l i s md e g r a d a t i o nb e h a v i o rw a si n v e s t i g a t e d ，i nt h ed e g r a d a t i o n u s em i x t u r eg e r ml i q u i dt h a tt a k i n g ”o z ”g e r ma st h ea d v a n t a g eg e r m t h i ss t u d yl a y f o u n d a t i o ni na c t u a la p p l i c a t i o nf o rt h i sg e r m t h ee x p e r i m e n te n u n c i a t e d ，t h e c o m e t a b o l i s md e g r a d a t i o nb e h a v i o rw a sa f f e c t e ds t r o n g l yb yt h ec o n c e n t r a t i o no f e n e r g y w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd y ew a st o m g l ，t h eg e r mc a nh a v et h eo b v i o u s a b i l i t yo f c o m e t a b o l i s md e g r a d a t i o no n l yt h ec o n c e n t r a t i o no f p e p t o n ew a sa b o v e 2 0 0 m e , l k e yw o r d s ：m i c r o o r g a n i s md y e i n gw a s t e w a t e rd e c o l o r i z eb i o d e g r a d a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼王些盍堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：虢签字日期：护口许胗月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼王些太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权云洼王些盍堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：j 0 毛 导师签名： 签字日期：埘年，月坪日 签字日期：d - 年( 朔归 学位论文的主要创新点 一、采用生物法对染料废水进行降解脱色，从印染厂的排污1 2 1 的沉积 物和印染废水的处理污泥中分离、选育高效的染料降解菌。 二、研究了共代谢降解在染料废水处理中的应用，以及优势菌混合培 养体系的脱色效果。 第一章前言 1 1 绪论 第一章前言 水是人类生活和生产活动中不可缺少的物质，又是一种不可替代的宝贵资 源。水资源的丰欠，直接影响人们的工作和生活。第二次世界大战结束后，特别 是六十年代以后，许多国家由于工业迅速发展和城市人口的高度密集，各种有毒、 有害物质的工业废水和生活污水，未经适当的处理即排入天然水体，污染了许多 城市和工矿企业的给水水源，水污染已经成为严重的社会问题。 1 1 1 印染废水的特点 印染厂用水量很大，平均每生产1 0 0 0 米的棉布约消耗水2 0 吨。这些水因直 接与织物和化学药品接触，已受到严重的污染，它们从印染加工的各个工序中排 出，即形成印染废水【”。印染废水水量约为其用水总量的7 0 - 9 0 。印染废水水 质复杂，废水中含有大量的碱类，p h 值高；含有大量残余染料和助剂，色度大； 有机物含量高，耗氧量大，悬浮物多，且含有微量的有毒物质。废水中的有机组 分大多以芳烃及杂环化合物为母体，并带有显色基团( 如n _ n 一、n = 0 ) 及极 性基团( 一s 0 3 n a 、伽、n h ：) 。废水中还含有较多的原料和副产品，如卤化物、 硝基物、苯胺、酚类等，以及无机盐如n a c l 、n a ：s o , 、n a 。s 等。同时，水质水量 变化大，印染生产中，由于织物种类，加工的花色品种受原料、季节、市场需求 的变化而经常变化，因而加工工艺和使用的染化料也随之改变，其结果使得印染 废水的水质会出现大幅度的变化l z j 。 印染废水除了上述特点外，还有如下特点：一、c o d 高( c o d 为化学需氧量， 系指在严格条件下：酸性条件加热2 小时，废水中的有机物被强氧化剂氧化所消 耗的氧量，以m g l 表示。) ，b o d c o d 值较小( b o d 为生化需氧量，系指在有氧的 条件下，废水中可生化降解的有机物，在好氧微生物的作用下，氧化分解时所消 耗水中的溶解氧量，以m g l 表示。) ，可生化性差；二、含有有毒物质，印染废 水中一般会含有有毒重金属，如汞、镉、铬等，有机毒物如多氯联苯等p l 。 1 2 印染废水的处理方法 第一章前言 1 2 1 印染废水的基本处理方法 根据处理手段，印染废水处理的基本方法可分为物理法、化学法和生物化学 法三大类。 物理处理方法的优点是工艺简单，经济，但只能达到初级的处理效果。 化学处理方法又称化学药剂法，主要去除或分离废水中的胶体物质和溶解性 物质，降低或平衡废水中的酸碱度，去除金属离子，氧化某些物质等。 生化处理方法就是利用微生物的代谢作用，使废水中呈溶解、胶体状态的有 机污染物转化为稳定、无害的物质。 1 2 。2 印染废水的脱色处理 从理论上讲，多种物理化学和生物方法都可以用于印染废水的处理，如絮凝 沉淀、吸附、离子交换、超滤、渗析、化学氧化、光氧化、电解及生物处理方法。 但考虑到工业效率与处理成本，目前工业上常用的方法有絮凝沉淀( 气浮) 、电 解、吸附、生物降解等方法1 4 , 5 1 。 絮凝沉淀( 气浮) 法是指在印染废水中投加铝、铁盐等絮凝剂，使其水解形 成带高电荷的羟基化合物，它们对水中憎水性染料分子如硫化染料、还原染料、 分散染料( 如直接耐晒翠蓝g l 等) 的混凝效果较好，而酸性染料、活性染料、 特别是小分子量、单偶氮键、含数个磺酸基的水溶性染料( 如酸性红3 b 、活性 艳红x - 3 b ) 的混凝脱色效率较差。混凝过程的吸附架桥作用明显，该过程并不 改变染料的分子结构。如硫酸亚铁对含s 0 3 、佣、n h ：、x 等基团的染料 分子也具有较好的混凝脱色效果，这主要是由于f e 4 可以与上述基团的未共用电 子对发生络合反应而形成大分子螯合物，降低了水溶性，在染料废水中成胶体状 态，进而通过硫酸亚铁水解产物的混凝作用被去斛“7 1 电化学法采用石墨、钛板等做极板，以n a c l 、n a ：s o , 、或水中原有盐类作导 电介质，对染料废水通电电解，阳极产生o ：或c 1 。，阴极产生h 2 。新生态氧或n a c i o 的氧化作用及h z 的还原作用破坏了染料分子结构而脱色，此法属于电解法。以 f e 、a l 作阳极，由电极反应产生f e 2 + 及a l ”，其水解产物形成絮凝，通过对染料 分子的氧化还原及粘附作用而脱色，絮体由阴极产生的h z 浮上，此法属于电气浮 法。这两种方法对含有一s 0 3 基团及- n = n 一双键的可溶性酸性染料、活性染料均有 良好的脱色作用，但该法消耗电能较大1 8 , 9 j 。 化学氧化法是利用臭氧、氯及含氯化合物等氧化剂将染料的发色基团破坏而 脱色，常采用组合氧化与催化氧化法。采用0 3 _ h 。0 ：组合法处理染料废水时，h z o z 能诱发0 3 产生羟基自由基o h ，它氧化能力强而无选择性，可以通过羟基取代反 2 第一章前言 应转化芳烃环上发色基团，发生开环裂解使染料脱色【1 0 】。 光催化氧化法，采用z n o _ 吒u o - _ h 。0 。a i r 复合体系进行光降解是利用紫外 光( u v ) 使半导体激发产生电子空穴，破坏染料分子中的共轭发色体系和分子结 构，从而使废水脱色，光催化氧化效率高，无二次污染【1 1 】。 吸附法是利用吸附剂如活性炭、硅聚物、高岭土、工业炉渣等吸附废水中染 料的方法。不同的吸附剂对染料吸附有选择性。活性炭吸附效果好，但费用较高。 开发高效便宜的吸附剂是吸附法的研究方向。 生物法，印染废水中大部分有机物是可以降解的，即使是苯环结构，也能被 诺卡氏菌、环形小球菌分解。生物化学处理具有运转费用低，处理效果好，操作 简单等优点，日益受到人们的重视，并在印染废水的处理中得到广泛应用。 1 2 3 印染废水的生物处理方法 印染废水的生物处理技术已由单一脱色菌种的筛选与驯化发展到脱色菌群 的选择和利用，进而深入到藻类共生系统的协同降解的认识与开发。此外，固定 化细胞，共代谢作用等高新技术已应用于印染废水处理，并取得了较好的处理效 果。生物处理技术与物理化学处理技术的组合工艺研究亦显示出广阔的应用前 景。这些技术必将随着科研工作的不断深化而日益完善，并在印染废水的处理与 净化工作中发挥更加重要的作用。 1 2 3 1 微生物在印染废水处理中的应用 生物强化处理技术，即利用微生物对常规生物处理方法不能去除的污染物的 特殊去除能力而发展起来的新型处理方法，在实际污染处理，尤其是土壤修复中 以得到较为广泛的应用。生物强化技术对染料废水的处理是利用高效降解或吸附 性能的特定微生物菌株去除废水中的染料，被称为是一种经济、高效、安全、环 境友好、易于操作和适于大规模废水处理的技术，更是受到了人们的极大关注， 成为国际上染料废水处理和脱色研究的热点。生物强化技术和高效生物反应器作 为国家“十五”期阊8 6 3 项目水污控技术研究开发的重要内容，已受到国内的高 度重视【1 2 , 1 3 1 。 1 2 3 2 生物强化技术 1 生物降解 筛选或构建针对特定染料具有降解或同化作用的菌株，并确定它们的作用条 件和反应机理，是含染料废水生物处理和脱色研究的主要内容之一【1 4 1 。 1 ) 污染物的分子空间结构发生变化，从而失去某些特性，在测试时不能发 3 第章前言 现该物质的存在。 2 ) 污染物分子结构中的某些基团发生变化； 3 ) 有机物发生裂解； 4 ) 降解性微生物发生作用，有机污染物矿化为c o 。、h 2 0 等物质。 我们把生物参与处理而污染物质又不发生以上4 种或处理周期内不发生转变 的过程称为非降解性生物处理，如生物絮凝、生物吸附等等。因为污染物的生物 降解是个耗时的过程，而且降解产物的毒性有时要大于本底化合物( 如偶氮染料 降解产物芳香胺的毒性要远大于偶氮化合物) ；并且这些降解技术只是通过破坏 染料分子的发色团或者结构实现对染料废水的单一脱色处理，而忽视了在高浓下 对废水中染料进行回收的可能性。所以在研究染料废水的非降解性生物处理有一 定的意义和必要性。 2 生物絮凝 由于传统的化学絮凝脱色法易产生大量的污泥，造成二次污染。二十世纪 7 0 年代以来以日本学者为首，对生物絮凝剂产生菌开展大量研究，生产出成本 较低，无二次污染的生物絮凝剂，并用于自来水处理及从废水中脱除悬浮物i l s , 1 6 1 。 但用生物絮凝剂脱除染料废水色度，国内外都处于初级尝试阶段，要使生物絮凝 剂真正应用到染料废水脱色中，还必须在生产成本降低、高效絮凝剂开发、絮凝 机理等方面开展大量工作。 3 生物吸附 利用具有富集或吸附染料能力的特定微生物用于染料废水的脱色，是生物法 脱色的又一形式。生物吸附不会产生有毒的代谢产物，而且还有可能为含染料废 水的大规模处理和回收提供一条经济可行的途径，许多学者正尝试用生物吸附的 方法脱除染料废水色度，但是这些研究大部分用死的生物体作为吸附剂，而且虽 然研究显示它们对低水溶性染料具有较高的吸附去除效果，对于高水溶性的染料 如活性染料的去除效果却相对较差【1 7 ，1 8 】。 1 3 染料脱色微生物的种类 早在1 9 3 7 年就有入发现了在腐败牛奶中乳酸杆菌对偶氮染料的脱色作用。 1 9 4 2 年发现了酵母的偶氮还原作用；1 9 6 6 年又从小鼠肠道分离得到一株具有偶 氮还原作用的变形杆菌。此后关于细菌脱色作用的研究陆续见诸报道。脱色菌以 假单孢菌和芽孢杆菌最多。动胶菌属、黄杆菌属、转化单孢菌属、产碱杆菌、白 腐担子菌及肠道厌养菌等都被发现有脱色作用。最初的研究认为，染料特别是偶 氮染料很难在有氧条件下降解。但随着研究深入，已分离到以染料为唯一碳源和 4 第一章前言 能源的好氧降解染料菌株p 9 , 2 0 。 目前发现能对染料脱色的微生物种类很多，主要有真菌、细菌和藻类三种。 1 3 1 真菌脱色 真菌中研究最多的是白腐真菌p a n e r o c h a e t ec h r o s o s p o r i u m o 。1 9 8 0 年就有 报道介绍了两种自腐真菌pc h r o s o s p o r y u 诵i t i n c t o p o t i as p 对含木质素的纸 浆和造纸废水的生物脱色情况，两种真菌都是通过微生物降解聚合的木质素分子 达到除色的效果【2 1 i 。木质素分子是一种结构非常复杂，含许多苯环的化合物。以 后的研究发现该菌对许多传统上认为不能降解的化合物有很好的降解效果，包括 许多染料在内。进一步研究发现该菌的降解作用主要依靠一些由细胞分泌排入体 的含亚铁血红素的过氧化酶：木质素过氧化酶( l i p ) 和锰过氧化酶( m n p ) ，以及一 个能将水中的o 。转化为h 盈。的酶系统 2 2 1 。其中木质素过氧化酶只有在环境中含有 较少的氮源时才会起作用。s p a d a r d 等使用了1 2 m m o l l 与2 4 m m 0 1 l 两种浓度的酒 石酸氨作对比实验，发现富氮时的色度去除率只有缺氮时的1 5 0 【8 。m a t t h e w t a t a r k o 等利用ac h r o s o s p o r i u a 释解刚果红，在非木质素条件( 富氮环境) 和木质 素条件( 缺氮环境) 下均有明显的吸附现象，但只有后一种情况会有进一步的降解 发生，说明木质素酶对该染料的降解有重要作用和缺氮环境对木质酶的重要性 刚。但也有不同报道，j o h na b u m p u w 等在研究中发现只c h r o s o s p o r l u o 在富氮条 件下对染料结晶紫有很好的降解效果，说明除木质素过氧化酶外，锰过氧化酶或 其它酶也能有效降解染料。许多研究发现藜芦基醇( v e r a t r y la l c o h 0 1 ) 对 pc h r o s o s p o r i u m 降解染料具有很大的促进作用，一般认为黎芦基醇存在促进了 木质素的活性。由于系统是胞外酶在起作用，因而能降解一些不溶于水的物质， 另一方面有毒物质不能进入细胞内，从而不抑制细胞生长，使其可以降解毒性很 高的物质或提高处理对象的浓度。根据报道发现另外许多真菌也能对一些染料有 去色效果【2 5 胡。m a r i e - c h r i s t i a n eb r a h i m i - h o r n 等发现真菌m y r o t h e c r u n v e r r u c a r i a 可以在5 h 内有效去除染料o r a n g ei i ( 7 0 ) 、l o b ( 8 6 ) 、r s ( 9 5 ) ，这 其中很大一部分是吸附在起作用，在4 5 9 菌体l 溶液中经5 h 后吸附可达0 2 9 染料 l 溶液。k i t o h 等发现真菌c o r i o l u sv e r s i d o l 口r 可降解蒽醌染料p v1 2 ，在 1 0 0 n m g l 浓度条件下1 4 天内可完全降解。j e r e m ys k n a p p 等发现另一种真菌f 2 9 ( 未鉴定) ，该菌可以降解染料o r a n g ei i ，在l o o m g l 浓度下2 天可基本降解。实 验发现该菌降解染料效果与溶液中含氮量多少没有关系，但与m n 2 有关，说明该 菌可能分泌m n ( i i ) 过氧化酶，但不存在木质素过氧化酶 2 7 2 8 ，2 9 i 。 1 3 2 细菌脱色 5 第一章前言 最早的报道见于1 9 7 7 年，h o r i t s u 分离出可以降解偶氮染料的细菌b a c i l l o s s u b r i l i si f 0 3 0 0 2 p u j 。p k w o n g 等人于1 9 9 6 年分离得到一种可以降解甲基红的 细菌k e b s i e l l ap s e u m o n y n er s 一1 2 ，研究发现该菌无论在静止条件还是在摇动 条件下均对甲基红有非常好的降解效果，加入葡萄糖或( n h 4 ) ：s o , 以促进降解， 但加入乙醇没有促进效果1 。t l h u 等人发现的菌株p s e u d o m o n a si u t e o a 正好 相反，该菌在完全静止或完全摇动的条件下均不降解染料，但在2 天摇动+ 2 天静 止的条件下对染料r e dg ，r b b 、r p 2 b 、v 。r p 的降解效果分别可达3 7 4 、9 3 2 、 9 2 4 、8 8 ，水中含氮量对降解效果没有影响【3 2 i 。在水溶液中葡萄糖浓度很低且 没有氮源时，细j 誊p s e u d o m o n a sl u t e o l 硅长良好，并证明细菌分泌的偶氮还原 酶为一种诱导酶而不是固有酶，偶氮染料r p 2 b 只是作为一种诱导剂。一般好氧条 件下含磺酸基团的染料难于被降解1 3 ”。但s i l k eb l u m e l 等人驯化出了一种可以降 解含磺酸基团的染料c s a b 的细菌，利用可以降解磺胺酸盐( c s a b 降解中间产物之 一) 的细菌h y d r o g e n o p h a g ap a l e r o n i sa g r o b a c t e r y u m 地d y o b a c t e r 为基础，驯 化过程开始阶段营养液中只含有磺胺酸盐，而后每2 星期移一次接入新鲜培养液， 此过程新鲜培养液中磺胺酸盐浓度不断减少，目标物c s a b 浓度不断增加，最后驯 化出可以以染料c s a b 为唯一碳源的菌株s 5 ( 未鉴定) 【删。单一菌种降解染料一般只 是将发色基团打开，中间产物如苯胺类致癌物质很难进一步降解，混合菌种在这 方面有优势，许多细菌之间存在协同降解作用，增强了降解效果。国内对混合菌 的研究相对较多，闵一珏等人经过二年多的实验室定向筛选培育，得到一个混合 脱色菌群，在兼氧和厌氧条件下，对染料废水的脱色有明显效果，同时能降解相 当数量的其它有机物。鲜海军等人也证明采用混合菌降解染料有一定的优势，并 分离得到1 3 株对染料脱色品种多，速度快的菌株。曾丽漩等人在实际废水处理设 备中分离出了几株优势菌株，发现混合菌群的脱色能力优于单菌株，且脱色时间 短，适应范围广，耐冲击性能更好p ”。 1 3 3 藻类脱色 l i uj i n g i 等1 9 9 2 年发表的文章中对藻类可能用于染料废水脱色作了研究， 分离出三种藻类c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a , c v u l 庇一日内o s c i l l a t e r i at e n n i s 。 在对3 0 种偶氮染料的实验中，藻类v u l f a r i e s x 寸其中1 0 种有5 0 以上的降解效果。 藻类o s c i l l a t e r i at e n n i s x 寸染料也有部分去除效果。但藻类c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a 则没有发现类似效果。结果分析说明藻类降解染料取决于三个方面： 一是染料的结构特征：二是藻类的生理生化特性：三是环境因素。藻类还会将偶氮 染料分解出的芳香胺等物质进一步降解为简单化合物或二氧化碳。该实验指出利 用稳定塘处理染料废水的可能性1 3 5 j 。 第一章前言 1 4 染料化合物的微生物共代谢降解 生物共代谢作用是生物强化技术之一，在微生物共代谢去除污染物的研究 中，大量的研究集中于氯代芳香族化合物的共代谢氧化过程，国内外已就氯酚类 化合物对微生物的驯化影响，第二基质存在时的诱导，氯苯类有机物对微生物的 抑制，诱导酶系的特性，同类有机物的共代谢生物降解性能以及氯代芳香族化合 物的共代谢氧化过程机理等进行了大量深入的研究。而在染料化合物降解脱色菌 的筛选、驯化研究中都是以染料为单一碳源和能源物质进行，共代谢作用在染料 脱色菌研究中还未引起足够的重视。大多数的研究只是定性地提到添加营养物可 能提高染料化合物的生物脱色率【3 6 】。 1 5 本课题的研究背景与意义 2 0 世纪8 0 年代前，我国印染废水的可生化性高，c o d 质量溶度常在8 0 0 m l l 以下，可采用传统的物化一生化组合处理方法。近年来，印染废水的水质发生了 很大的变化，c o d 值升高，且b o d 。c o d 值下降，传统的生化法工艺己不适应目前 的需要。许多新的厌氧一好氧工艺处理印染废水报道较多，选择和培养抗变异和 耐环境毒害性优势菌种的研究已经成为生化法的主要方向。生物技术处理难降解 污染物是一种有效而且广泛应用的技术，尽管印染废水的可生化性差，含有毒有 害物质，仍可以通过优势菌种的选育，在适宜的环境中降解印染废水。由于生化 法具有操作简单、运费低、无二次污染的优点，在印染废水的处理中得到了广泛 的应用。但是该技术也存在它的不足之处，如活性污泥沉降性差、生化反应速率 低及剩余污泥的处理费用高等。因此，为了提高生物技术的生物降解效率，目前 国内外主要致力于以下几个方面的研究： ( 1 ) 投加有效降解菌，采用混合菌群降解； ( 2 ) 采用共代谢降解难降解污染物； ( 3 ) 选育或改进微生物降解菌，提高微生物抗毒性，降解容量； ( 4 ) 设计开发高效低成本处理的新工艺和新设备，使降解技术向物理、化学 与生物技术联合应用的方向发展。 ( 5 ) 大量的研究表明微生物对外来化合物降解或转化具有巨大的潜力，几乎 所有的有机物都能找到使之降解或转化的微生物。随着生物工程技术的不断发展 生物技术在处理难降解有机污染物这一领域，必将有着广阔的应用前景。 本课题的研究目的是从活性污泥中筛选出高效的脱色菌种，使其对各种染料 都能进行有效的脱色和降解。染料是人工合成的大分子化合物，品种繁多，结构 7 第一章前言 复杂，属生物难降解物质。所有染料的共同点就是具有不饱和结构的发色基团能 吸收可见光。本实验所进行的研究就是利用微生物酶来氧化或还原染料分子，破 坏其不饱和键及发色基团。脱色微生物对染料具有专一性，其降解过程分两阶段 完成，先是染料分子的吸附和富集，接着再生物降解。染料分子通过一系列氧化、 还原、水解、化合等生命活动，最终降解成简单无机物或转化为各种营养物及原 生质。 1 ) 实验将从印染厂的活性污泥中分离出对染料吸附率较高的菌株，并以菌株 对多种染料的快速高效脱色为条件进行复筛，得到对多种不同结构的染料产生较 好脱色效果的优势菌株。研究优势菌的生长和生理特性，以及p h 值、温度、碳 源、氮源等因素对菌株脱色能力的影响。 2 ) 从葡萄糖和蛋白胨的生物培养液中提取出一株通过共代谢作用对染料具 有降解作用的菌株，并对该菌对染料的脱色条件进行了初步的研究。 印染废水的微生物脱色关键在于对微生物菌源的选择，使之适应不同的印染 废水水质。单一脱色菌用于印染废水脱色较为困难，而脱色菌群则可以有较好的 脱色效果。 8 第二章理论基础 第二章理论基础 2 1 染料种类及发色机理 2 1 1 染料的分类 染料的分类方法有两种：其一是根据染料的化学结构；其二是按照染料的应 用方法【3 ”。以染料分子中类似的基本结构作为分类依据，如偶氮、蒽醌、靛族、 芳香胺、酞箐等。根据染料的应用方法和应用性能可将染料分为直接染料、硫化 染料、还原染料、酸性染料、酸性络合染料、活性染料、纳夫妥染料、氧化染料、 分散染料和阳离子染料等。分离、筛选染料脱色微生物并测定其脱色能力的基础 工作应选定染料。一般来说分离、筛选微生物应选用“按化学结构分类”的染料， 主要目的在于判断脱色机制可能作用的基团和价键；而测定微生物染料脱色的能 力则常选择“按应用分类的染料”以便取得与实际生产更接近的结果。 2 1 2 染料的结构与发色机理 1 8 7 6 年w i f f 提出染料发色团说，认为染料颜色是由双键引起的，这些含双 键的基团即为发色团。现代理论认为，染料的颜色与其结构有密切的关系，结构 对颜色的影响有【3 7 1 ： ( 1 ) 在共轭双键体系中，共轭双键增长，n 电子活动性增高激化能随之减少， 吸收的光线波长愈长，产生不同的深色浓色反应。 ( 2 ) 共轭体系两端若存在极性基团，颜色加深。 ( 3 ) 分子的离子化对颜色的影响：分子离子化后，如果给电子基的给电子性或 吸电子基的吸电子性加强，电子活动性增大，分子的激化能降低，分子颜色加 深。反之，则变浅。 ( 4 ) 分子平面性对颜色的影响：在共轭双键体系中，只有原子和原子团在同一 个平面时，才具有最大的共轭效应。n 电子的活动性与分子的共平面性有关，如 果分子的共平面性遭到破坏，共轭双键体系也会被破坏，丌电子的活动性降低， 颜色变浅。 ( 5 ) 染料内络合物对颜色的影响：染料共轭系统中的原子或原子团与金属原子 形成配价键时，电子云分布状态发生重大变化，从而影响共轭体系的流动性，引 起颜色变化。 9 第二章理论基础 染料的结构与发色机理对判断微生物染料脱色具有重要的理论分析意义。 2 2 污水处理的微生物基础 污水生化处理是利用微生物的新陈代谢作用，对污水中的污染物质进行转化 和降解，使之无害化的处理方法。微生物的个体微小，一般用肉眼不能直接看到， 需借助显微镜才能观察到。污水生物处理涉及的微生物种类很多，主要包括原核 的细菌、放线菌及蓝藻，真核的酵母、霉菌、藻类、原生动物和一些后生动物真 菌以及无细胞结构的病毒等。微生物具有来源广、易培养、繁殖快、对环境适应 性强、易变异等特性，在生产上较容易地采集菌种进行培养增殖，并在特定条件 下进行驯化，使之适应有毒工业废水的水质条件，从而通过微生物的新陈代谢作 用把有机物无机化，有毒物质无害化p ”。 2 2 1 微生物的新陈代谢 微生物的生命活动过程中，不断的从外界环境中摄取营养物质，并通过复杂 的酶催化反应将其加以转化利用，提供能量并合成新的生物体，同时又不断向外 界环境排泄代谢产物。这种为了维持生命活动过程与繁殖后代而进行的各种化学 变化称为微生物的新陈代谢。 根据能量的释放和吸取，可将代谢分为分解代谢和合成代谢。在分解代谢过 程中，结构复杂的大分子有机物或高能化合物分解成简单的低分子物质或低能化 合物，逐级释放出固有的自由能，微生物将这些能量转变成三磷酸腺苷( atp ) ， 以结合能的形式贮存起来。在合成代谢中，微生物把从外界环境摄取的营养物质 通过一系列生化反应合成新的细胞物质，生物体合成所需的能量从atp 的磷酸 盐键能中获得。在微生物的生命活动中，合成代谢和分解代谢相互依赖，共同进 行，分解代谢为合成代谢提供物质基础和能量来源，通过合成代谢又使生物体不 断增加，两者的密切配合是一切生命活动的基础。 2 2 1 1 分解代谢 一切生物进行生命活动所需要的物质和能量都是通过分解代谢提供的所以 说分解代谢是新陈代谢的基础，根据分解代谢过程对氧的需求，又可分为好氧分 解代谢和厌氧分解代谢”。 好氧分解代谢是好氧微生物和兼氧微生物在有氧条件下，将有机物彻底分解 为c o 。和h 2 0 ，并释放能量的代谢过程，在有机物氧化过程中脱出的氢是以氧作为 受氢体，如葡萄糖( c 。h 。o b ) 在有氧情况下的完全氧化，如反应式( 1 ) ： 1 0 第二章理论基础 c e h - ：0 6 + 6 0 ：一6 c o 。+ 6 h 。0 + 2 8 8 0 k j反应式( 1 ) 厌氧分解代谢是厌氧微生物和兼氧微生物在无氧条件下，将复杂的有机物分 解成简单的有机物和无机物，如有机酸、醇、c o 。等，再由专性厌氧的产甲烷菌 进一步转化成甲烷和c 啦等，并释放出能量的代谢过程。厌氧代谢的受氨体可以 是有机物，也可以是含氧化合物，如s o , ”、n 0 3 - 和c 0 2 等。例如，葡萄糖的厌氧代 谢，以含氧化合物为受氢体时，l m o l 葡萄糖释放的能量为1 7 9 6 k j ，见反应式( 2 ) ； 以有机物为受氢体时，l m o l 葡萄糖释放的能量为2 2 6 k j ，见反应式( 3 ) 。 c e h - 2 0 8 + 1 2 k n 0 3 6 c 0 2 + 6 t t 2 0 + 1 2 k n 0 2 + 1 7 9 6 k j反应式( 2 ) c b h ，：o b 一2 c h 。c h 。0 h + 2 c 0 。+ 2 2 6 k j反应式( 3 ) 好氧分解代谢过程中，有机物的分解比较彻底，最终产物是含能量低的c 0 2 和h 。0 ，释放能量多，代谢速度快代谢产物稳定。厌氧分解代谢中的有机物氧化 不彻底，最终代谢产物中有的还可以燃烧，还含有相当多的能量，故释放的能量 较少，代谢速度较慢。所以，在废水处理中，一般较少采用厌氧代谢的形式，仅 是当处理高浓度有机废水和有机污泥时，用厌氧方式生产沼气，回收甲烷。 2 2 1 2 合成代谢 微生物从外界获取能量，将低能化合物合成生物体的过程叫合成代谢，简言 之，是微生物机体自身物质制造的过程。在此过程中，微生物体合成所需要的能 量和物质可由分解代谢提供。 2 2 2 微生物生长的营养及影响因素 2 2 2 1 微生物的营养 营养物质对微生物的作用是：( a ) 提供合成细胞物质时所需要的物质；( b ) 作为产能反应的反应物，为细胞增长的生物合成反应提供能源；( c ) 充当产能反 应所释放的电子的受氢体。所以微生物所需要的营养物质必须包括组成细胞的各 种元素和产生能源的物质。 从微生物的细胞组成元素来看，碳和氢是构成菌体成分的重要元素，对无机 营养元素，磷源是主要的，而且微生物对这些元素的需求有一定的比例。对好氧 生物处理，c ：n ：p = 1 0 0 ：5 ：1 ；对厌氧消化处理，c n 比值在( 1 0 2 0 ) ：1 的范围内 时，消化效率最佳。若各营养元素之间的比例失调，则会影响微生物的正常生长 繁殖，使其生物的活性及各种性能受到限制，因此可作为生化处理中重要的控制 条件之_ 3 9 , 4 0 l 。 ( 1 ) 碳源 凡能供给微生物碳素营养的物质均可称为碳源，其主要作用是构成微生物细 第二章理论基础 胞的含碳物质( 碳架) 和供给微生物生长、繁殖及运动所需要的能量。在微生物 细胞内部含碳量相当高，大约占细胞干物质质量的5 0 左右，可见微生物对碳的 需求量之大。 从简单的无机碳化合物到复杂的有机含碳化合物，都可作为碳源。在实验条 件下，制备培养基最常用的碳源是葡萄糖，可为许多微生物所利用。其它糖类如 蔗糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉、纤维素，以及脂肪、有机酸、醇类、烃等可作为 培养不同微生物时选择使用的碳源。又根据微生物对所用碳源的类型可将微生物 划分为无机营养微生物、有机营养微生物和混合营养微生物等。 ( 2 ) 氮源 凡是能够供给微生物氮素的物质称为氮源，它作为合成生物体蛋白质的原 料，对微生物的生长关系重大。一般环境中能作为微生物氮源的有n h 3 、n 。、尿 素、n o ”、n h “、一n h ：和腐烂的蛋白质等。根据对氮源要求的不同可将微生物分 为四类，分别为固氮微生物、利用无机氮作为氮源的微生物、需要某种氨基酸作 为氮源的微生物和从分解蛋白质中取得铵盐或氨基酸的微生物。 ( 3 ) 能源 能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能，称为能源。对于 各种异养菌来说，不少碳源同时也是能源，所有这些有机物具有双重的营养功能。 ( 4 ) 生长因子 生长因子主要是指氨基酸、嘌呤和嘧啶碱以及维生素，可促进微生物的生长。 微生物对其所需要的量很少，但缺少它们微生物不能生长和繁殖。根据生长因子 的来源不同可将微生物分微生长因子自养型和生长因子异养型。 ( 5 ) 无机盐 无机盐对微生物的作用有以下几种： 构成细胞组分 构成酶的组分和维持酶的活性 调节渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等 供给自养微生物能量 如钾是微生物重要的阳离子、是酶的激活剂，镁是磷酸酯酶、脱氨酶的活化 剂，也是光合菌和藻类叶绿素的组成部分，铁是细胞色素氧化酶、过氧化酶等的 组成成分。 ( 6 ) 水 水是微生物的组分，又是微生物代谢过程中不可少的溶剂。它有助于营养物 质的溶解和吸收，保证细胞内、外各种生物化学反应在水溶液中正常进行。微生 物细胞的含水量一般为7 0 一9 0 9 6 。因此水分与微生物代谢废物的排泄以及细胞内 的全部代谢生理活动息息相关。 第二章理论基础 2 2 2 2 影响因素 ( 1 ) 温度 温度是微生物的重要生存因子，对微生物具有广泛的影响，不同的环境温度 下微生物的种类及其生活习性是不同的。根据各类微生物所适应的温度范围，微 生物可分为表2 - i 所列的高温性( 嗜热菌) 、中温性、常温性、和低温性( 嗜冷菌) 4 类。 表2 - 1 各类微生物生长的温度范围 类别最低温