氯化血红素提取工艺及质量标准研究.docx

氯化血红素提取工艺及质量标准研究袁曦洪清 ( 福州 350005 福建医科大学附属第一医院药剂科)摘要 目的 :探讨氯化血红素提取工艺的最佳条件 ,并制定其质量标准 。方法 : 以氯化血红素的得率为指标 ,运用正交试验优选氯化血红素提取工艺的最佳条件 ,用红外光谱 、紫外光谱作定性验证 ,用紫外光谱法测定氯化血红素 的含量 。结果 :通过正交试验 ,得出血红蛋白与冰醋酸的比例 14 、反应温度 118 、反应时间 20 min 为氯化血红 素最佳提取工艺 ,产品得率高 ,质量可控 。结论 :本提取工艺及质量标准可行 。关键词 氯化血红素 ;提取工艺 ;正交试验 ;质量标准extract ion techn iques and qual ity standards of heminyuan xi ( yuan x) , ho ng qing ( ho ng q ) ( fi rst a f f il i ated hos pi t al of fuji an m edical u ni versi t y , fuz hou350005)abstract objective: to investigate t he best co nditio ns of ext ractio n techniques for hemin and to wor k out t hequalit y standards of hemin. methods : the best co nditio ns of ext ractio n techniques for hemin were op timized wit h ort hogo nal experiment s , using t he yield of hemin as an index. the qualitative analysis wit h t he ir2and u v2spect ra and determinatio n of hemin wit h u v2spect rop hoto met ry was made. resul ts : the best co nditio ns for t he ext ractio ntechniques of hemin were t he reactio n solutio n co ntaining hb and glacial acetic acid in t he ratio of 14 for 20 min at 118. the yield of hemin was high. it s qualit y was co nt rolled. co ncl usio n: the ext ractio n techniques and t he qualit y standards are feasible.key wo rds hemin , ext ractio n techniques , ort hogo nal experiment , qualit y standards氯化血红素作为一种优良的铁强化剂及抗贫血药 ,已被药理和临床研究所证实 ,其疗效显 著 ,副作用少 ,因而较其它抗贫血药易为病人接 受 。美国 fda 已于 1983 年 7 月正式批准雅培公司 的 氯 化 血 红 素 作 为 药 品 使 用1 。本 文 就其提取工艺及质量标准进行了探讨 ,现报道如 下 。1 材料和仪器氯化 血 红 素 对 照 品 ( 美 国 sigma 化 学 公 司) ;氯化血红素供试品 (自制) 。nicolet 205 型傅里叶 变 换 红 外 光 谱 仪 ( 英 国) ; 岛 津 u v2260型分光光度计 ( 日本) ; 7512gw 型分 光 光 度 计 (上海分析仪器厂) ; 8022 型 离 心 沉 淀 器 ( 上 海 手术器械厂) ;其它试剂均为分析纯 。2实验方法2 . 1氯化血红素的制备 取经屠宰检疫合格的新鲜动物血 ,令其低温自然凝块 ,取血块捣碎成血红蛋白液 ,将其缓 缓加入经加热至沸腾的冰醋酸和氯化钠的混合 液中 ,边加边搅拌 ,加完后继续加热回流 ,然后 冷却 ,离心洗涤 ,干燥 ,即得氯化血红素供试品 。 本品溶于氢氧化钠生成血红素 ,不溶于水 ,但在 水中稳定 。2 . 2氯化血红素含量测定2 . 2 . 1对照品溶液的制备 :精密称取经 105 干燥至恒重的对照品约 20 mg ,置 100 ml 量瓶中 ,加 0 . 1 moll - 1氢氧化钠液适量 ,于水浴上加热振摇使溶解 ,放冷 ,加 0 . 1 moll - 1 氢氧化360 chi n pha r m j , 1997 j u ne , v ol . 32 n o. 6中国药学杂志 1997 年 6 月第 32 卷第 6 期表 2 正交试验结果钠液稀释至刻度 ,摇匀 。精密量取 3 ml 置 100ml 量瓶中 ,加 0 . 1 moll - 1 氢氧化钠液稀释至 刻度 ,摇匀 ,备用 。2 . 2 . 2 供试品溶液的制备 :精密称取经 105 干燥至恒重的供试品约 20 mg ,其余按“对照品 溶液的制备”项下操作 ,备用 。氯化血红素得率/ g1)编号abc1234567891112223331231231231232313121233122312 . 63 . 13 . 44 . 35 . 43 . 65 . 94 . 64 . 92 . 2 . 3测定方法 : 取对照品溶液和供试品溶液 ,按分光光度法2 ,在 ( 384 1) nm 波长处测定吸光度 ,照下列公式计算氯化血红素含量 :氯化血红素含量 = ( 供试品溶液的吸光度对照品的重量) / 对照品溶液的吸光度2 . 3正交试验设计 为探讨提取氯化血红素的最佳工艺条件 ,我们以得率为指标 , 进行了 l 9 ( 34 ) 正 交 试 验 ,以考察反应液中血红蛋白液与冰醋酸的比例 、 反应时间及反应温度对氯化血红素得率的影响 ,设计因素水平见表 1 ,按设计表共进行 9 组的试验 。表 1 正交试验因素水平表0g = 6 ri = 37 . 80i = 1g2 = 1 428 . 84c t = g2/ n = 158 . 76k1k2k3r9 . 112 . 810 . 812. 913 . 315 . 46 . 313 . 111 . 91 . 212 . 314 . 73 . 912. 612. 30. 6q = k22 21 + k2 + k31) 得率 = 提取品重量 百分标示量 ( %) ; 投料量以血红蛋白液 100 ml 计表 3 氯化血红素方差分析表方差来源离差平方和自由度均方f 值显著性6 . 860 . 262 . 582223 . 430 . 131 . 29114. 334. 3343. 00p 0. 01a bcp c b 。在实验中还 发现 ,若冰醋酸的浓度不够 ,就影响得率 ,也是由于这两者之间的比例发生了改变 ; 而反应时 间对提取工艺影响无显著性 ,它为次要因素 ,但 从节省时间上考虑 ,因此把提取工艺条件定为 a 3 b 1 c3 。5 . 2 若反应温度未达到沸腾状态 ,加入血红蛋 白液 ,会使部分血红蛋白遇热产生凝固 ,再延长 反应时间也无法使其中血红素分子里的羟基被 氯离子所取代 ,而生成氯化血红素在冰醋酸中 析出 ,影响了得率 。5 . 3 在鉴别试验中 ,根据氯化血红素在稀释中 产生沉淀 ,并游离出铁离子这一性质 ,在供试品 中加 200 ml l - 1 的硫酸溶液 , 产生沉淀 , 并游 离出铁离子 。铁离子在酸性溶液中可与硫氰酸盐生成棕红色可溶性的硫氰酸铁络离子 ,使溶 液呈棕红色 ; 氯化血红素在 0 . 1 mol l - 1 氢氧 化钠中 ,在波长 ( 384 1) nm 处有最大吸收峰 , 这一吸收峰是氯化血红素的主要吸收峰 。上述 两种特征均为氯化血红素的鉴别依据 。5 . 4 在正交试验中 ,氯化血红素含量测定用对 照品法进行 ,可消除溶剂和仪器带来的误差 ,使 测定结果更加准确 。参考文献恒重的对照品适量 , 以 0 . 1 mol l - 1 氢氧化钠液为溶 剂 , 配 成 5 . 4 g ml - 1 的 溶 液 , 在 波 长300400 nm 之间扫描紫外吸收光谱 。结果表 明 ,本品在波长 384 nm 处有最大吸收 。4 . 4 . 2 工作曲线的制备 :精密称取经 105 干燥至恒重的对照品 18 mg ,置 100 ml 量瓶中加0 . 1 moll - 1氢氧化钠液适量使完全溶解后 ,稀 释至刻度 ,摇匀 。分别精密吸取上述溶液 1 . 0 ,2 . 0 ,3 . 0 ,4 . 0 ,5 . 0 ml ,置 100 ml 量瓶中用 0 . 1 moll - 1 氢氧化钠液稀释至刻度 ,摇匀 ,以溶剂 为空白 ,用紫外分光光度计在波长 ( 384 1) nm 处测定吸收值 , 经线 性 回 归 , 得 回 归 方 程 a =0 . 087 c + 0 . 025 , r = 0 . 999 9 ( n = 5) 。结果显 示 ,浓度在 1 . 809 . 10 gml - 1 范围内吸光度和浓度呈线性关系 。4 . 4 . 3 回收率试验 :精密称取经 105 干燥至 恒重的对照品 80 mg ,置 100 ml 量瓶中 ,加 0 . 1 moll - 1氢氧化钠液适量 ,置水浴中加热溶解 , 冷却 ,用 0 . 1 moll - 1 氢氧化钠液稀释至刻度 ,摇匀 。精密量取上述溶液 5 ml 置 100 ml 量瓶 中 ,用 0 . 1 moll - 1 氢氧化钠液稀释至刻度 ,摇 匀 。精密量取稀释液 15 ml 置 100 ml 量瓶中 , 用 0 . 1 moll - 1氢氧化钠液稀释至刻度 ,摇匀 , 以溶剂为空白 , 在 波 长 ( 384 1 ) nm 处 测 定 吸收值 ( a ) , 得 平 均 回 收 率 99 . 32 % , s = 1 . 16 , r s d = 1 . 17 % 。4 . 4 . 4 供试品的测定 :精密称取经 105 干燥 至恒重的供试品 20 mg , 置 100 ml 量瓶中 , 加0 . 1 moll - 1氢氧化钠液适量 ,置水浴中加热溶解 ,冷却 ,用 0 . 1 moll - 1 氢氧化钠液稀释至刻 度 ,摇 匀 。精 密 量 取 上 述 溶 液 3 ml 置 100 ml 量瓶中 ,用 0 . 1 mol l - 1