（农业昆虫与害虫防治专业论文）酸碱法提取黄粉虫Tenebrio+molitor+Linne幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文 酶碱法提取黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o r ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 摘要 本试验采用酸碱法对黄粉虫幼虫体壁中的几丁质及几丁糖进行提取。通过对盐酸浓 度、脱盐时间、温度及碱液浓度、去蛋白时间、温度几个条件的摸索和筛选，得到除去 无机盐等物质的最佳条件为：3 0 c 下，0 1 2m o t l 的盐酸反应3 2h ；除去蛋白质等有 机物质的最佳条件为：3 0 下，2r l l 0 1 l 的n a o h 溶液反应3 2h 。在此基础上，运用二 次正交旋转组合设计了几丁质及几丁糖制备的正交试验，将其得率、脱乙酰度和粘度作 为衡量品质的标准，进行二次多项式回归分析，得到最高指标时的三个二次回归模型， 即最优化组合。同时，对影响方程的各因子，得出如下结果：在影响得率的单因子中， 脱盐时间和除蛋白所用碱液浓度影响最大。在某一范围内，二者与得率均表现为负相关。 在两因子的互作效应中，盐酸浓度与去蛋白时间、盐酸浓度与脱乙酰温度、去蛋白时间 与脱乙酰温度的互作效应较大，是决定得率的主要因素。在脱乙酰度的单因子效应中， 以去蛋白时间的影响最大，其次为脱乙酰时间。两因子互作效应中，碱液浓度与脱乙酰 温度的互作效应对脱乙酰度的影响最大。单因子效应中，盐酸浓度对粘度的影响最大， 其次为脱盐时间。两因子互作效应中，碱液浓度与脱乙酰温度的交互作用对粘度的影响 较大，脱乙酰时间与温度的交互作用与粘度负相关。 关键词：黄粉虫，几丁质，几丁聚糖，酸碱法，回归分析 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱洼提取黄粉虫( t e n e b r i om 0 1 f o r ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t of i n das u i t a b l ew a yo f e x t r a c t i n gc h i t i na n dp r e p a r i n gc h i t o s a nf r o mt h e b o d yw a l lo f t h el a r v a eo ft e n e b r i om o l i t o rl i n n ei na c i d a l k a l im e t h o d ，t h e r ew e r es o m e c o n d i t i o n st h o s ew e r es e l e c t e di nt h ef i r s t t h e yw e r et h ec o n c e n t r a t i o no fh y d r o c h l o r i ca c i d ， t i m eo f d e s a l t i n g ，t e m p e r a t u r eo fd e s a l t i n g ，c o n c e n t r a t i o no f s o d i u mh y d r o x i d es o l u t i o n ，t i m e o fr e m o v i n gp r o t e i nf r o me x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s ，t e m p e r a t u r eo fr e m o v i n gp r o t e i nf r o m e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s t h e r ea r e t h ef o l l o w i n gr e s u l t s ：w h e nt h et e m p e r a t u r ei s3 0 c ，t h e c o n c e n t r a t i o no f h y d r o c h l o r i ca c i di so 12 m o l l a n dt h et i m eo fd e s a l t i n gi s3 2h w h e nt h e t e m p e r a t u r ei s3 0 。c ，t h ec o n c e n t r a t i o no f s o d i u mh y d r o x i d es o l u t i o ni s2 m o l l ，a n dt h et i m e o fr e m o v i n gp r o t e i ni s3 2h i nt h es e c o n d ，as q u a r er e g r e s s i v eo r t h o g o n a lr o t a t i o nw a s d e s i g n e do nt h eb a s eo ft h e s ec o n d i t i o n sa n dt h r e ef a c t o r sw e r ee v a l u a t e dt h a tw e r ey i e l d ， d e a c e t y l a t e dd e g r e ea n dv i s c o s i t y a tt h es a m et i m e ，t h r e eb e t t e rr e l a t i v ec o m p o u n d i n gw e r e c o n f i r m e d a f t e ra n a l y z i n gd a t aw i t ht h eq u a d r a t i cp o l y n o m i a lr e g r e s s i o na n a l y s i sa n dt h e r e w e r et h er e s u l t s t h et i m eo fd e s a l t i n ga n dt h ec o n c e n t r a t i o no fs o d i u mh y d r o x i d es o l u t i o n w e r et h eg r e a tf a c t o r sa n dt h e yw e r e n e g a t i v ec o r r e l a t i o nt oy i e l d t h ei n t e r a c te f f e c t sd u r i n g t h ec o n c e n t r a t i o no f h y d r o c h l o r i ca c i d ，t h et i m eo fr e m o v i n gp r o t e i na n dt h et e m p e r a t u r eo f d o f f i n ga c e t y l ，w e r et h ep r i m a r yf a c t o r s t od e a c e t y l a t e dd e g r e e ，t h et i m eo fr e m o v i n gp r o t e i n w a st h e g r e a t e s tf a c t o r ，a n d t h et i m eo fd o f f i n g a c e t y la n d t h ei n t e r a c te f f e c to nt h e c o n c e n t r a t i o no fs o d i u mh y d r o x i d es o l u t i o na n dt h et i m eo fd o f f i n ga c e t y lw e r en e x tf a c t o r s t ov i s c o s i t y , t h ec o n c e n t r a t i o no f h y d r o c h l o r i ca c i dw a st h eg r e a tf a c t o r , a n dt h et i m eo f d e s a l t i n ga n dt h ei n t e r a c te f f e c to nt h ec o n c e n t r a t i o no f s o d i m nh y d r o x i d es o l u t i o na n dt h e t e m p e r a t u r eo fd o f f i n ga c e t y lw e r et h ef o l l o w i n gf a c t o r s a n dt h ei n t e r a c te f f e c to nt h et i m e a n dt h et e m p e r a t u r eo f d o f f i n g a c e t y lw a sn e g a t i v e t ov i s c o s i t y k e yw o r d s ：t e n e b r i om o l i t o r ，c h i t i n ，c h i t o s a n ，a c i d - a l k a l im e t h o d ，r e g r e s s i o na n a l y s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 、 学位论文作者签名： 务 签字f 1 期： 9 年月脚 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：l 签字日期： 善吲l 年月, a - h 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 铈华擘渤7 荔 签字日期：砂卵砂年厂月，日 电话： 邮编： 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱洼提取黄粉虫( t e n e b r i om o l l t o t ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 月l j吾 几丁质( c h i t i n ) 又名甲壳素、壳蛋白、蟹壳素等，广泛存在于低等动物，特别是 节肢动物如昆虫、甲壳动物的体壳中，同时也存在丁低等植物，如菌、藻类的细胞壁中。 据估计自然界每年生物合成的几丁质多达1 0 0 亿吨，是仅次于纤维素的可再生资源，也 是2 0 世纪未被充分利用的天然资源之一。 几丁质化学名称为( 1 ，4 ) 一2 - 乙酰胺基一2 一脱氧一6 一d - 葡聚糖，是由许多乙酰胺基 一d 一葡萄糖单体通过1 3 一( 1 ，4 ) 苷键连结起来的直链多糖。由于大分子问强的氢键作用， 导致几丁质不熔化，加热到2 0 0 以上则开始分解；也不溶于一般溶剂，在少数酸性溶 剂中溶解时。大分子发生降解“1 。几丁质若脱去分子中的乙酰基，就转变成几丁聚糖 ( c h i t o s a n ) ，几丁聚糖又称壳聚糖、可溶性甲壳素，化学名称为( 1 ，4 ) 一2 一胺基一b d 一 葡聚糖( 如图1 ) 。它具有较好的溶解性能，能在有机酸( 醋酸、蚁酸) 、无机酸中分散 溶解成粘稠胶体，在酸性溶液里能逐渐水解，降低粘度，最终生成葡萄糖胺。1 。由于其 分子结构中存在游离的胺基，使反应活性大大增强，这就决定了它从纺织、造纸到食品、 环保、医药、农业、林业、轻工业、生物工程等领域的均有广泛的应用“。因此几丁 质的开发利用越来越受到国际社会的高度重视。 麟嫒ho 、渖h h o 0 潍c h 2 0 h 婊c h 2 0 h ( 1 )( 2 )( 3 ) 图1几丁质( 1 ) 、几丁聚糖( 2 ) 、纤维素( 3 ) 的结构 f i g 1 t h es t r u c t u r ec o m p a r i s i o i lo fc h i t i nc h i t o s a na n df i b r e 一国内外研究状况 自从1 8 1 1 年法国科学家h b r a c o n n e t 在蘑菇中发现几丁质( 当时他命名为f u n g i t i e ) 以来，它就引起了千万科学家的兴趣。1 8 2 3 年，法凶人o d i e r 在昆虫表皮也发现类似物 质，用希腊语改为c h i t i n ，是“外壳”，“信封”的意思。1 8 5 9 年，法国r o u g e t 将几丁 质置于氢氧化钠溶液中加热后，得到口j 溶于有机酸的一种新物质。1 8 9 4 年，德国 a o p p e s e u l e r 将这种脱乙酰物质命名为几丁聚糖“1 。虽然人类早己发现了儿丁质，但 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t c n e b r i om o l i t o r ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 对它的研究是从上世纪7 0 年代开始的。1 9 7 8 年和1 9 8 2 年国际上先后召开两次会议，探 讨了几丁聚糖的提取技术和应用研究。同时，闩本政府编列了十年开发计划( 1 9 8 2 1 9 9 2 ) ，由上千人从事几丁质的丌发利用与基础研究。1 9 9 1 年，儿丁聚糖与蛋白质、脂 肪、糖类、维生素、矿物质并列，被誉为人体第六大生命要素，欧洲几丁质研究会也于 1 9 9 2 年成立。我国是从上世纪9 0 年代以后开始这方面的研究的，1 9 9 6 年几丁质国际学 术研讨会首次在中国召丌。 随着研究的不断深入，特别是近2 0 年来，几丁质的优异功能已被人们逐渐认识， 由于它具有生物稳定性、生物降解性、生物运转性及良好的生物相容性，因此，可阻被 用来制作人造皮肤、手术缝合线、抑制肿瘤的生长等等。上世纪9 0 年代，日本北海道 大学的东教授发现几丁质可阻止癌细胞着床，s o ny 等于1 9 9 3 年报道用m i t o m y c i n e 与 几丁质几丁聚糖络合物n - s u c c i n y lc h i t o s a n m m c 和c a r b o x y e m t h y 卜c h i t i n m m c 行 体内、体外实验。结果证明：抗肿瘤作用明显增强。爱媛大学的奥田教授用几丁聚糖来 防止高血压取得了临床上的显著效果。1 9 9 5 年英国里德大学微生物所证实了几丁聚糖能 增强人体的免疫作用，因而国际上已有人利用它来进行防治爱滋病毒的研究。由于它的 优异特性，可用于酶固定化载体。s y r o w i e c k i 等人( 1 9 8 2 ) 研究固定一a m y a s e ，b a m y l a s e ，g l o c o s e ，i s o m e r a s e 和a m y l o g l u c o s i d a s e 等酶于几丁质，先形成水合物， 再形成s c h i f f s 碱及醛类衍生物，进而固定酶，s i s o 等人研究证实微胶囊化的壳聚糖 球能有效固定i n v e r t a s e 与a a m y l a s e 等酶”1 。在农业上，几丁质可用来作降解地膜、 植物生长调节剂、肥料和土壤改良剂及无公害农药等。g o t t h a r d t ”1 ( 1 9 9 2 ) 认为， 甲壳素、壳聚糖能显著提高小麦悬浮培养液中过氧化酶的活性。s h i n 等人“0 1 ( 1 9 9 6 ) 用壳聚糖溶液浸泡棉花组织细胞，结果表明，有明显抑菌作用。波兰有报道“，以壳聚 糖为基本成分，配以化肥、微量元素等营养成分及防腐剂，可制成用于无土栽培的叶面 液体肥料。l e e 等人“”也认为，在植物病原菌与寄生植物之间，壳聚糖对植物病原菌的 孢予发芽和生长有阻碍作用，对病原菌感染的防护机能有诱导作用。 目前，随着对几丁质的逐步认识，其产业化生产己初具规模，美国f d a 于1 9 8 3 年 就以壳聚糖作为食品添加剂，早在上世纪9 0 年代，日本的几丁质产品“救多善”( c h i t o s a n 音译) 便行销美、俄。在r 本，几j - 聚糖是迄今为止唯被日本政府允许可窟传其疗效 的机能性保健食品。 在几丁质和几丁聚糖的制备上，国际上有很多方法。“。但目前能够大批量生产的达 到产业化的多采用化学方法即酸碱法”“1 。在化学法脱乙酰基反应巾，影响脱乙酰度的 冈素很多，但主要因素有：碱液浓度，反应温度和时问。般来讲，随着反应时间的延 长，碱液浓度的增大，温度的升高，会伴随几丁质主链的降解，从而影响产品的粘度和 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t o n e b r i om o l i l o t ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 分子量。”】。m i m a ( 1 9 8 3 ) 和b o u g h 等”3 ”( 1 9 7 8 ) 分别采用增加反应次数并间隙漂洗中间 产物和通入n 。去除反应体系中游离0 。的方法，从而减缓了主链的降解。严伯奋。“。等 ( 1 9 9 7 ) 通过微波辐射加热代替普通加热对几丁质进行脱乙酰化，使反应条件更温和， 且大大缩短了碱处理时间。目前，国内外有很多关于几丁质脱乙酰化的工艺条件研究的 报道。屈步华等人”“( 1 9 9 5 ) 曾证明常温制备几丁质以提高几丁聚糖的品质。此外，制备 几丁质的方法还有酶法”。能够降解几丁质的酶有多种，每种又因来源不同而具有特异 性。如t a k i g u c h i 等“( 1 9 8 9 ) 利用从海水中分离的t i b r i oa n g u i l l a r u m 3 8 3 a 产生的 几丁质酶，特异性生产较高产率的几丁二糖，岛原赢接利用能生产几丁质酶的微生物开 发了简便的酶解法。从海洋细菌v i b r i of u r n i s s l l 中发现一种未知酶，能水解聚合度 为4 6 的几丁低聚糖“。另外，还有壳聚糖酶，溶菌酶等等。大宝使用芽孢杆菌属s p 7 一m 株得到的壳聚糖降解酶，成功地获得了由二糖到五糖的壳低聚糖。坂井”。1 利用芽孢杆菌 属r4 生产的脱乙酰基壳聚糖酶以高效率获得了一到四糖的低聚糖。现已发现许多脱乙 酰基壳聚糖酶，一般可生成二至六糖的壳低聚糖，当长时间进行反应时，二糖、三糖比 例增加。由此可见利用脱乙酰基壳聚糖生产低聚糖比较容易，但仍难得到高聚合度的壳 聚糖。 酸碱法是目前提取几丁质、制备几丁聚糖的主要方法，原料多是虾蟹的外壳，且所 用盐酸和碱液的浓度均偏大，反应温度也比较高，而且从昆虫、真菌”“7 1 和植物中提取 几丁质的报道虽然也有，但并不多见。随着几丁质研究的深入，以及昆虫资源的进一步 开发，研究昆虫几丁质的报道也逐渐增加。如熊燕飞，陈怀新“”在谈到蚕蛹的综合利用 时指出蛹几丁质及蛹几丁聚糖具有某些较虾蟹几丁质和几丁聚糖更优良的性能，如蛹几 丁质具有较好的医疗作用：蛹几丁聚糖在稀酸中的溶解性好于虾蟹几丁聚糖，因此，提 取蛹几丁质，制备蛹几丁聚糖同样具有较高的经济价值“9 。我国海岸绵长，在制盐过 程中，卤蝇”在盐池中产卵和繁殖，大量的卤蝇蛆壳漂浮于盐池中，成为制盐加工的废 物，据估计，每年我国盐场堆积的卤蝇蛆壳达上- 千吨，且卤蝇蛆壳中含有丰富的几丁质 和蛋白质，是1 种不可多得的天然生物资源。实际上，我国早在上世纪8 0 年代初便有 家蝇m w 几丁质的产品问世，但由于信息不灵，而销售不佳。另外，还有从黄粉虫、油 葫芦。”、蝉”、琵琶甲”、宽跗陇马陆中提取几丁质的，也有从蜗牛壳5 “、地鳖虫”、 植物”“中提取几丁质的，但相关资料比较少。 二目的及意义 随着科技的进步和人类的发展，全球的自然资源面临着枯竭的危机。进入2 1 世纪 以来，昆虫做为还没有被人类完全认识的自然资源，将成为重要的利用同标，在食物、 饲料、药用等方面起到不可忽视的作用。事实上，昆虫资源的丌发和利用f 逐步走向成 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( f e n e b l i am o l l t o t ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 熟，伴随着昆虫资源利用的产业化发展，昆虫蛋白、脂肪的利用，昆虫的外壳便成为这 些产业的副产品，如何充分利用这些昆虫外壳，是当前和今后面临的又一个问题。 黄粉虫作为目前己产业化的昆虫资源，在饲养和加工过程中，产生大量的蛹皮、幼 虫蜕皮及幼虫加工后废弃的体壁，为几丁质的资源开发提供了大量原料，因此，研究一 套切实可行的提取黄粉虫几丁质的方法已是追在眉睫。本研究以黄粉虫幼虫体壁为原 料，探究酸碱法提取几丁质并进一步转化为几丁聚糖的科学工艺和相关技术，同时因几 丁聚糖用途的多样性，丽建立以不同指标为筏量标准的模型，以便充分利用这一资源， 并且也期望对其它昆虫几丁质的提取方法提供借鉴和参考。 三前景与展望 昆虫作为世界生物资源庞大的个类群，被认为是二十一世纪人类的主要蛋白质来 源。因其个体小，种类繁多，分布广，繁殖速度快，人工饲养容易，食物转化率高，并 且多数种类具有体内蛋白质含量高，脂肪含量低，微量元素丰富等特点，倍受人们青睐。 经过营养分析，全世界已经确定出3 6 5 0 余种昆虫可供食用”。我国食用昆虫可能达到 8 0 0 余种，陈晓鸣”“等报道( 1 9 9 9 ) 我国目前食用昆虫种类1 l 目5 4 科1 7 7 种，开发利 用的仅2 0 余种。随着产业化进程的加快，人们对昆虫的认识将逐步提高，从而更快地 接受它，提高其在工业、农业等各部门的利用率，扩大其作为食用、药用和饲料的饲养 规模，进而提供更多的几丁质资源，因此充分开发利用这一资源具有十分广阔的前景。 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t e n e b r i om o l l t o t ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 1 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1 供试虫源 虫源为吉林农业大学昆虫资源研究室提供的黄粉虫( t e n e b j i om o ，t o rl i n n e ) 实验种群。 1 1 2 实验仪器及药品 主要仪器：e s 一1 8 0 3 电子天平( 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司) ；s h z 一8 8 恒温水 浴振荡器( 江苏省金坛市医疗仪器厂) ：h g 3 0 3 4 k 电热恒温培养箱( 南京实验仪器厂) ： 7 5 1 一紫外分光光度计( 上海精密科学仪器厂) ；伍氏粘度计( 直径0 5 o 6 m m ，吉林大 学玻璃厂) ；2 5 m l 碱式滴定管( 山东教学仪器厂) 。 药品与试剂：n a o h ( 分析纯，天津化工，。) ；h c l ( 分析纯，莱阳双双化工有限公司) ； h c i ( 分析纯，北京化工厂) ；h a c ( 分析纯，北京化工厂) ：n - 乙酰葡萄糖胺( 生化试剂， 上海伯奥生物制品有限公司) ；溴酚蓝( 指示剂，沈阳市试剂三厂) 。 1 2 试验原理与方法 1 2 1 提取几丁质、制备几丁聚糖的一般工艺原理 几丁质提取、l 丁聚糖制备通常采用酸碱法，其流程如下： 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o t ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 图2几丁质提取及几丁聚糖制备流程图 f i g 2 f l o wc h a r to f e x t r a c t i n gc h i t i na n d p r e p a r a t i o nc h i t o s a n 6 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t o n e b ：i om o l l f o r ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 1 2 2 试验方法 122 1 黄粉虫幼虫体壁的获得 将黄粉虫新鲜末龄幼虫，经过机械打碎后，洗涤、冲洗干净、得其体壁，干燥后备 用。 12 2 2 脱盐所用h o i 溶液浓度及反应时间的确定 将h c l 溶液配成 种浓度：0 1 2 m o l l 、0 2 4 mo l l 、0 4 8 m o l i ，、0 9 6 m o l l 、 1 9 2 m o l l 。称取1 0 0 0 9 左右的干燥黄粉虫幼虫体壁，置于2 5 0 m l 的广口瓶中，加入 3 0 m l 上述浓度的h c l 溶液，浸没材料。置于恒温水浴振荡器( 2 5 ) 中，分别振荡8 h 、 1 6h 、2 4h 、3 2h 、4 0h 、4 8h ( 均每8h 换一次h c 溶液) 。取出后，洗涤至中性， 置于培养皿中，于恒温箱中6 0 。c 下干燥、称重，计算失重率( 浸泡前重量与浸泡后重量 之差) 。重复三次后，算出平均值。作失重率曲线，确定脱盐所用h c l 溶液浓度及反应 时间。 1 2 2 3 脱盐的最佳反应温度的确定 由1 2 2 2 的结果，可以得到失重率最大的h c l 溶液浓度与反应时间，在此基础上， 按1 2 2 2 中方法，分别于2 0 。c 、3 0 。c 、4 0 。c 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 下振荡、干燥， 计算失重率。重复三次，算出平均值。作失重率衄线，确定脱盐的最佳反应温度。 1 2 2 4 去蛋白质等有机物质所用碱液浓度和反应时间的确定 将n a o h 溶液配成：0 2 5 m o l l 、0 5 m o l l 、l m o l l 、2 m o l l 。、4 m o l l 五种浓度，称 耿1 0 0 0 9 左右干燥的黄粉虫幼虫体壁，置于2 5 0 m l 的广口瓶中，加入3 0 m l 上述浓度的 n a o h 溶液，浸没材料。置于恒温水浴振荡器( 2 5 ) 中，分别振荡8h 、1 6h 、2 4h 、 3 2h 、4 0h 、4 8h ( 均每8h 换一次n a o h 溶液) 。取出后，洗涤至中性，置于培养皿中， 于烘箱中干燥、称重，计算失重率。重复三次后，算出平均值。作失重率曲线，确定去 蛋白所用碱液的浓度及反应时间。 1 2 2 5 去蛋白质等有机物质的最佳反应温度的确定 由1 2 2 4 的结果，可以得到失重率最大的n a o h 溶液浓度与反应时间，在此基础 上，按1 2 2 4 中方法，分别于2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 f 振荡、 干燥，计算失重率。重复三次，算出平均值。作失重率曲线，确定去蛋白等有机物质的 最佳反应温度。 1 2 2 6 酸碱法提取黄粉虫幼虫体壁几丁质及几丁聚糖制备最佳工艺条件的确定 为了确定酸碱法提取黄粉虫幼虫儿丁质和制备几丁聚糖的最佳工艺条件，在前面试 验的基础卜，采用j 次f 交旋转组合，设计一个关于h c l 溶液的浓度、反应时间、n a o 溶液的浓度、反应时间、浓n a o h 溶液脱乙酰基反应的温度和时间六个因素的f 交表。 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱注提取黄粉虫( t e n e b r i om o l ic “) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 对于山几丁质经脱乙酰基反应后，变成几丁聚糖这一步骤，我q r 选用了温度和反应时 间这两个条件，因为这一步反应所用的碱液浓度基本在4 5 上下波动，所以我们直接选 取了4 5 的浓n a o h 溶液进行脱乙酰基反应。其正交试验的编码表如下： 表1编码表 t a b l e 1 c o d i n g t a b l e 型蠢i ! ! ! 塑堕 x 1x 2x 3x 4 x 5x 6 h c i ( m o l l ) h c i ( h )n a o h ( m o l l ) n a o h ( h )浓n a o h ( c ) 浓n a o h ( h ) ( + y )0 2 44 83 5 4 89 03 0 (十1)01 84 02 7 54 0 8 02 5 (0)0123 2 23 27 02 0 t 一1 )o 0 62 41 2 5 2 46 01 5 (一y)01 605 1 65 01 0 ()00 680 7 5 81 05 试验结果( 得率、脱乙酰度、粘度) 通过d p s 数据处理系统进行多项式分析后，获 得回归方程，借以评价各处理间的差异程度。 1 2 2 7 样品得率的测定 将样品自广口瓶中取出，洗至中性，于培养皿中6 0 。c 烘干后称重，记录测量值，待 样品重量不再降低时，即为样品的烘干后重量。 计算公式：得率( ) = 样品烘干后重量样品未处理前重量1 0 0 1 228 几丁聚糖脱乙酰度的测定 几丁聚糖脱乙酰度的测定，我们采用碱量滴定法和紫外分光光度法。 ( 1 ) 碱量法 准确称取0 1 9 样品，置于2 0 0 m l 锥形瓶中，加入0 i m o l l 标准h c l 溶液l o m l ，使 其溶解。再加入2 滴溴酚蓝指示剂，用0 i m o l l 的n a o h 标准溶液滴定过量的h c l ，溶 液由黄色消失时为滴定终点。脱乙酰率的计算公式如下： n i l 2 ( ) = ( c ，v 。c ：v ! ) x 0 0 1 6 1 0 0 g 脱乙酰率= u - - n h ：1 0 0 9 9 4 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t e n e b r i ot o o l j t o t ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 式中，6 0 。l ：为所测几丁聚糖中游离胺基的百分率，；c 为盐酸标准溶液浓度， m o l 几；v 为加入试样中盐酸标准溶液的体积，m l ；c ：为n a o h 标准溶液浓度，m o l l ；v ! 为滴定时n a o h 标准溶液消耗体积，m l ；g 为试样的干燥重量，g ；0 0 1 6 为与l m o l l 标 准盐酸溶液相当的胺量，g ；9 9 4 为几丁聚糖中胺基的理论质量百分率，。 ( 2 ) 紫外分光光度法 以0 0 0 1m 0 1 l h c l ( 分析纯) 为溶剂，用0 1m g m ln - 乙酰葡萄糖胺( 生化试剂) 配成0 叭、0 0 2 、0 0 3 、0 0 4 、0 0 5m g m l 的标准溶液。以0 0 0 1m o l lh c l 为参比 液，于1 9 9 n m 处测定系列溶液的吸光度。 称取1 5m g 几丁聚糖样品于1 0 0m l 容量瓶中，加入1 0m l0 o l m o l l 盐酸，全部 溶解后，用蒸馏水稀释至刻度、摇匀。以0 0 0 1m o l l 盐酸作参比液，测量其在1 9 9 n m 的吸光度。从所做的工作曲线中，得到样品中乙酰基的浓度，计算出脱乙酰度。 计算公式为： 脱乙酰度( ) = 1 0 0 一( 样品中乙酰基浓度样品浓度) 1 0 0 1 229 几丁聚糖特性粘度及平均分子量的测定”2 3 用伍氏粘度计测定处理样品的特性粘度，首先测定h a c 溶剂流过毛细管的时间t 。， 然后测定待测几丁聚糖一h a c 溶液流过的时间t ，计算出相对粘度和增比粘度，并计算出 q 。c ，模拟出直线方程，得到截距a ，计算出样品的分子量。公式为： 相对粘度( n ，) = t l t 。 增比粘度( n 。) = n 。1 相对浓度c7 - c c ， 特性粘度 n = a c 平均分子量m = ( n k ) “。 式中：t 为几”丁聚糖一h a c 溶液流过毛细管的时间，s ；t 。为h a c 溶液流过毛细管的 时间，s ；c 为所配待测溶液的真实浓度，m g m l ；c 为待测溶液的起始浓度，m g m l ；a 为所绘直线与y 轴的截距；m 为所测几丁聚糖的分子量；k 和n 为常数，当温度为2 5 时，a - 0 7 6 ，k - o 0 2 。 9 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o r ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 2 结果分析 2 1 去除黄粉虫幼虫体壁中无机盐所用盐酸浓度、反应时间及温度的确定 为了得到优质的几丁聚糖，必须要有优质的几丁质。在盐酸脱去无机盐的反应中， 随着盐酸浓度的增大、反应时间的延长或反应温度的升高，都会导致儿丁质分子问链的 断裂“。为了得到一个合适的提取昆虫体壁中几丁质的盐酸的浓度，根据以往的资料， 提取几丁质所用的h c l 溶液的浓度从0 1 5m o l l 到2m o l l 不等，但所选取的原料均 为虾、蟹壳。因此，在以虾、蟹壳为原料的工艺的基础上，我们选取了从0 1 2m o l l 1 9 2m o l l 的浓度范围。反应时间以8h 为一单位，间歇换液，以避免生成的c a c l ：沉 积在原料表面，阻碍反应的充分进行。以失重率为衡量指标，在确定盐酸浓度和反应时 间之后，再确定反应温度。 2 1 1 盐酸浓度 由图1 ，不同浓度h c l 溶液的失重率随时间( 8h ，1 6h ，2 4h ，3 2h ，4 0h ，4 8h ) 变化曲线可以看出，除0 9 6m o l l 处理外，当反应时间为8 3 2h ，其它浓度的h c l 溶液处理的样品失重率都呈上升趋势；当反应时间为3 2 4 0h ，失重率均下降；当反应 时唰为4 0 4 8h ，失重率又开始升高，并呈上升趋势。对于o 9 6m o l l 的处理，在8 1 6h 内，失重率升高；在1 6 2 4h 内，失重率下降，至2 4h 降至低点( 3 0 4 8 ) ；2 4 4 0h 内，失重率又上升，4 0h 为3 1 8 7 9 6 ；4 0h 后，失重率又呈下降趋势。综合看来， 在反应时怕j 超过1 6h 后，0 1 2m o l l 的h c l 溶液失重率普遍高于其它几种浓度的处理。 由此可见在这五种浓度中，0 1 2m o l l 为最佳去除无机盐的浓度。 此浓度较以往用虾、蟹壳为原料，提取几丁质所用盐酸的浓度( 一般为1m o l l ) 要小很多，这主要是由所用原料的不同，即昆虫体壁与甲壳类动物体壳的成分的差异性 所决定的。 0 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t 口n e b r i oa l o l ：t o r ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 时问( 小时) t i m e 图3不同盐酸浓度下失重率随反应时间变化曲线 f i g 3 v a r i a t i o nc u r v eo f t h er a t eo fl o s sw e i g h t f o l t o wr e a c t i v et i m ei nt h ed i f f e r e n tc o n s i s t e n c yo fh y d r o c h l o r i ca c i d 2 1 ，2 反应时间 由图2 所示，在2 5 下，当盐酸浓度在0 1 2m o l l 1 9 2m o l i 。范围内逐渐增大时， 反应时问为8h 的失重曲线直呈上升趋势，至1 9 2m o l l 时达到2 9 9 ；而其它四组 时问的失重曲线则先下降再上升。反应时间为1 6h 和4 0h 的失重率在盐酸浓度为0 12 m o l l 时分别为3 1 3 7 矛1 13 3 2 0 ：在0 4 8m o l i 。时降到最低点，分别为3 0 4 0 , n3 1 3 0 ： 之后随着赫酸浓度的增大，失重率也逐渐升高，至1 9 2m o l l 时分别达到3 0 9 8 和 3 2 0 1 。反应时间为2 4h 、3 2h 和4 8h 的失重曲线在盐酸浓度为0 9 6m o l 几时降至 最低点，分别为3 0 4 8 、3 1 8 5 和3 1 8 5 ；至1 - 9 2m o l l 时分别达到3 2 1 4 、3 2 6 6 和3 3 1 6 ，但均较盐酸浓度为0 1 2m o i ，的失重率( 分别为：3 2 6 5 、3 3 7 2 和3 3 7 4 ) 低。综合看来，当盐酸浓度为0 1 2m o l l 时，反应时间为3 2h 和4 8h 的样品失重率 较高，分别为3 3 7 2 和3 3 7 4 ，且二者相差不大( 0 0 2 ) ，考虑到反应时间的延长会 对几j + 质的品质产生很大影响，在这种情况下，选择最佳反应时问为3 2h 。 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o r ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 浓度( m o l l ) c o n s is t e n c y 图4不同反应时间下失重率随盐酸浓度变化曲线 f i g 4 v a r i a t i o nc u i n c eo f t h er a t eo f l o s sw e i g h tf o l l o w t h ec o n s i s t e n c yo f h y d r o c h l o r i ca c i di nt h ed i f f e r e mr e a c t i v et i m e 2 1 3 反应温度 如图3 所示，0 1 2m o l l 的盐酸溶液作用于黄粉虫幼虫体壁3 2h ，当温度在2 0 。c 8 0 。c 范围内，失重率呈上升趋势，至8 0 。c 时，失重率达到最大为3 6 4 8 。当温度从2 0 升高到3 0 。c 时，失重率的变化最大，以后随温度升高虽然也在增大，但是均没有此范 围内升高的幅度大。屈步华等。( 1 9 9 5 ) 曾报道在甲壳素制备过程中，常温对甲壳素维 持天然特性起到很大作用，且3 0 。c 较接近常温或室温，比较容易操作，因此，我们选驳 盐酸去除无机盐的最佳温度为3 0 。 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱法提取黄粉虫( t o n e b r i om o l ，t o r ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 3 5 喜! 璺；。 2 5 “。 一 2 03 04 05 06 07 08 0 温度( z z ) t e m p e r a t u r e 图50 1 2 m o i l h o l 处理3 2h 失重率随温度变化曲线 f i 罟5 v a r i a t i o nc u r v e o f t h er a t e o f l o s s w e i g h t f o l l o w t h e d i o k r e n t t e m p e r a t u r e o f o 1 2 m o i l h c i i n3 2 h 2 2 去除黄粉虫幼虫体壁中蛋白质等有机物质所需n a o h 溶液的浓度、反应时间及温度 的确定 提取几丁质过程中去除蛋白质等有机物质的n a o h 溶液浓度一般为3 1 0 ，即0 7 5 m o l l 2 5m o l l 之问，为了选取适当的碱液浓度，我们将浓度定在0 2 5m o l l 4 m o l l 之间，即：o 2 5m o l l 、0 5m o l l 、lm o l l 、2m o l l 、4m o 几五种浓度。反 应时问以8h 为一单位，间歇换液，以避免n a 0 h 溶液浓度的降低，提高碱液利用率。 以失重率为衡量指标，在确定n a o h 溶液浓度及反应时问后，再确定反应温度。 22 1 n a o h 溶液的浓度 如图4 所示，当碱液浓度为0 2 5m o l l 时，在8 3 2h 内，失重率逐渐提高，在 3 2h 达到5 7 0 3 ；之后至4 0h 有所降低( 5 6 8 9 ) ，在4 0 4 8h 内，又有所增高，至 4 8h 达到最高( 5 7 6 9 ) 。当碱液浓度为o 5m o l l 时，在8 4 8h 内，失重率逐渐升 高，至4 8h 达到最高( 5 9 5 6 ) 。当碱液浓度为lm o l l 时，在8 4 0h 内，失重率逐 渐升高，至4 0h 达到最高( 6 2 3 2 ) ；之后在4 8h 内呈下降趋势。当碱液浓度为2m o l 儿 时，在8 3 2h 内，失重率逐渐升高至3 2h 达到最高( 6 6 8 9 ) ：在4 0h ( 6 4 9 2 ) 内 有所降低，在4 0 4 8h 内，又有所升高，至4 8h 达到6 5 0 8 。当碱液浓度为4m o l l 时，在8 3 2h 内，失重率升高，至3 2h 达到最高，为6 7 3 4 ；之厉到4 8h 内，失重 曲线呈下降趋势，4 0h 为6 6 8 8 ，4 8h 为6 6 6 7 。综合来看，当碱液浓度为2m o l l 。 吉林农业大学硕士学位论文 酸碱洼提取黄粉虫( t e n e b r i om o l l t o t ) 幼虫几丁质及几丁聚糖制备最优条件研究 和4m o l l 时，失重率均达到了6 0 以上，二者均在3 2h 达到最高点，2m o l l 的为6 6 8 9 ， 4m o l h 的为6 7 3 4 ，二者浓度相差一倍，但从图表上看位点十分接近，所以我们选择 碱液的浓度为2m o l l 。这与以虾、蟹壳等为原料提取几丁质的碱液浓度( 一般为1 0 ) 接近。 时间( 小时) t i m e 图6n a o h 溶液不同浓度下失重率随反应时间变化曲线 f i g 6 v a r i a t i o nc 0 3 v eo f t h er a t eo fl o s sw e i g h t f o l l