高中生物 专题5 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段课件 新人教版选修1.ppt

生物选修1 人教版 专题5dna和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增dna片段 要点突破 一 生物体内的dna复制与pcr反应的比较 特别提醒 dna单链有方向性 dna母链的3 端对应着子链的5 端 即dna的两条链是反向平行的 注意不同酶的作用 解旋酶的作用是使dna两条链的氢键断开 而dna聚合酶与dna连接酶都是催化形成磷酸二酯键的 dna聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3 端上 需要模板 而dna连接酶连接的是两条dna片段的缺口 不需要模板 例1标准的pcr过程一般分为变性 复性 延伸三大步 这三大步需要的温度依次是 a 92 50 72 b 72 50 92 c 50 92 72 d 80 50 72 解析 当温度上升到90 以上 90 96 时 双链dna解聚为单链 称之为变性 当温度下降到50 左右 40 60 时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 当温度上升到72 70 75 时 溶液中的四种脱氧核苷酸 a t c g 在taqdna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 称为延伸 答案 a 变式训练1 pcr技术中 引物的作用是 a 打开dna双链b 催化合成dna子链c 使dna聚合酶能够从引物的3 端开始复制d 提供模板解析 dna聚合酶不能从头开始合成dna 而只能从3 端延伸dna链 引物的作用就在于此 答案 c 二 pcr技术的基本原理 类似于dna的天然复制过程 由变性 复性 延伸三个基本反应步骤构成 1 模板dna的变性模板dna经加热至95 左右一定时间后 使模板dna双链或经pcr扩增形成的dna的双链解开 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 2 模板dna与引物的退火 复性 模板dna经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板dna单链的互补序列配对结合 3 引物的延伸dna模板引物结合物在taqdna聚合酶的作用下 以四种脱氧核苷酸为反应原料 dna母链为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链 重复循环变性 复性 延伸三过程 就可获得更多的 半保留复制链 而且这种新链又成为下次循环的模板 每完成一个循环需2 4min 2 3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 特别提醒 pcr扩增过程中的易错点 pcr过程中无解旋酶 破坏氢键需要升高温度才能打开氢键 但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键 因此 热变性后是dna单链 并未分解成单体 复性时只是在引物和dna单链之间形成氢键 两条单链之间并未形成氢键 因此复性后 无双链dna分子形成 三 pcr的实验操作 1 操作步骤 1 按pcr反应体系的配方配制所需试剂 2 用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分 3 盖严离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 4 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 5 将离心管放在pcr仪上 设置好pcr仪的循环程序 以上过程可以概括为准备 移液 混合 离心 反应五大步 2 实验结果与分析 1 实验中dna含量的测定 稀释 取2 lpcr反应液 加入98 l蒸馏水 即将样品稀释了50倍 对照调零 以蒸馏水作空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调至零 测定 取dna稀释液100 l至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 计算 dna含量 g ml 50 260nm的读数 稀释倍数 2 理论上dna扩增数目的计算 dna扩增与dna复制一样 呈指数扩增 若只有一个dna为模板 则复制n次后有2n个 若一开始有a个模板 则复制n次有a 2n个dna 3 dna扩增是否成功 检测dna片段扩增情况可以采用上述方法 也可以采用电泳检测的方法 可以通过在紫外线下直接观察dna带的分布及粗细程度来评价扩增的效果 如果扩增不成功 则要分析失败原因 可能的原因有 漏加了pcr的反应成分 各反应成分的用量不当 pcr程序设置不当等 例2下列操作过程的叙述中错误的是 a pcr实验中使用的微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌b pcr所用的缓冲液和酶应分装成小份 并在 20 储存c pcr所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后 迅速融化d 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的吸液枪头都必须更换 解析 从冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化 而不能迅速融化 答案 c 变式训练2 在pcr实验操作中 下列说法不正确的是 a 在微量离心管中添加各种试剂时 只需一个枪头b 离心管的盖子一定要盖严 防止液体外溢c 用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合d 离心的目的是使反应液集中在离心管部 提高反应效果 解析 在微量离心管中添加各种试剂时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头必须更换 以确保实验的准确性 离心管的盖子一定要盖严 防止实验中脱落或液体外溢 离心10s的目的是使反应液集中在离心管部 提高反应效果 答案 a 本节小结 核心归纳1 dna复制需要引物 是因为dna聚合酶不能从头开始合成dna 而只能从3 端延伸dna链 2 pcr反应需要