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基因工程的诞生和发展 1 基因工程的工具 1 基因操作的车间 大肠杆菌和病毒 2 获得基因片段的工具 限制性内切核酸酶 3 连接基因片段的工具 连接酶 4 基因操作的载体 质粒和病毒2 重组DNA实验 1 基因工程的内容 1 基因操作原理 1 DNA和RNA的操作核酸的分离 纯化 分析和检测 切割 连接和修饰 以及序列测定 诱变 扩增和转移等基本技术 2 基因克隆构建基因组文库或cDNA文库 2 2 基因工程的应用 1 生物反应器 生产生物活性物质 2 遗传改良 转基因植物 动物 3 基因治疗 genetherapy 将健康基因移植到相关组织或细胞使患者的症状减缓或消失 应用举例 3 基因工程胰岛素 一 胰岛素是治疗糖尿病的特效药 长期以来只能依靠从猪 牛等动物的胰腺中提取 100Kg胰腺只能提取4 5g的胰岛素 其产量之低和价格之高可想而知 胰岛素分子结构 4 基因工程胰岛素 二 将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌 每2000L培养液就能产生100g胰岛素 大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题 还使其价格降低了30 50 胰岛素生产车间 5 基因工程干扰素 一 干扰素治疗病毒感染简直是 万能灵药 过去从人血中提取 300L血才提取1mg 其 珍贵 程度自不用多说 干扰素生产车间 干扰素分子结构 6 基因工程干扰素 二 基因工程人干扰素 2b 安达芬 是我国第一个全国产化基因工程人干扰素 2b 具有抗病毒 抑制肿瘤细胞增生 调节人体免疫功能的作用 广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗 是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物 7 其它基因工程药物 人造血液 白细胞介素 乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产 均为解除人类的病苦 提高人类的健康水平发挥了重大的作用 人造血液及其生产 8 基因诊断与基因治疗 运用基因工程设计制造的 DNA探针 检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷 不但准确而且迅速 通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可 一次性 解除病人的疾苦 我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞 9 SCID的基因工程治疗 重症联合免疫缺陷 SCID 患者缺乏正常的人体免疫功能 只要稍被细菌或者病毒感染 就会发病死亡 这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶 简称ADA 的基因 ada 发生了突变 可以通过基因工程的方法治疗 SCID患者生存在无菌环境中 10 基因治疗SCID的过程 11 4 1基因工程工具酶 限制性内切酶 甲基化酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 连接酶 磷酸激酶和磷酸酶 12 一 限制性内切核酸酶 一 限制与修饰 1 限制与修饰现象早在50年代初 有许多学者发现了限制与修饰现象 当时称作寄主控制的专一性 hostcontrolledspecificity 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题 表2 1 在感染某一宿主后 再去感染其它宿主时会受到限制 13 14 15 E coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 k 噬菌体侵染E coliB时 由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列 被降解掉 而E coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列 但可在EcoB甲基化酶的作用下 催化S 腺苷甲硫氨酸 SAM 将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基 使之甲基化 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列 16 细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶 构成了寄主控制的限制 修饰系统 R MRestriction modificationsystem R M系统是细菌安内御外的积极措施 细菌R M系统的限制酶可以降解DNA 为避免自身DNA的降解 细菌可以修饰 甲基化酶 自身DNA 未被修饰的外来DNA则会被降解 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰 则可免予被降解 17 2 限制酶的发现20世纪60年代 人们就注意到DNA在感染宿主后会被降解的现象 从而提出限制性切酶和限制酶的概念 1968年 首次从E coliK中分离到限制酶 它有特定的识别位点但没有特定的切割位点 其中切割位点离识别位点达1000bp以上 18 1970年 美国约翰 霍布金斯大学的H Smith于偶然中发现 流感嗜血杆菌 Haemophilusinfluenzae 能迅速降解外源的噬菌体DNA 其细胞提取液可降解E coliDNA 但不能降解自身DNA 从而找到Hind 限制性内切酶 Hind 限制性内切酶位点和切割位点如下 5 GTPy PuAC 3 3 CAPu PyTG 5 19 从此以后 发现的限制酶越来越多 并且许多已经在实践中得到应用 EcoR 是应用最广泛的限制性内切酶 酶切位点和切割位点如下 5 G AATTC3 3 CTTAA G5 在生物体内 存在与限制酶对应的修饰酶 二者同时存在 甲基转移酶 甲基化酶 保护自身的DNA不被降解 20 限制性内切酶的命名 Haemophilusinfluenzaed嗜血流感杆菌d株 HindIIIHindIII 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 属名种名株名 21 EcoRI Escherichia 属名 Coli 种名 Ry13 株系 编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母 22 3 限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成 识别序列的种类和是否需要辅助因子 限制与修饰系统至少可以分为四类 23 各种限制与修饰系统的比较 24 二 限制酶识别的序列 1 限制酶识别序列的长度一般为4 8个碱基 最常见的为6个碱基4个 Sau3AI GATC5个 EcoRII CCWGGNciICC SGG6个 EcoRIG AATTCHindIIIA AGCTT 25 2 限制酶识别序列的结构回文对称结构 EcoR G AATTCCTTAA GHind A AGCTTTTCGA A非对称结构 AccBS CCG CTCGGC GAGBssS C TCGTGGAGCA C 26 3 限制酶切割的位置 切割位点位于识别序列的内部 外部 两端Sau3A GATC Nla CATG 和EcoR CCWGG 两侧Bcg 10 12 CGA N 6TGC 12 10 和TspR CASTGNN 单侧 28 三 限制酶产生的末端 1 产生匹配的黏末端回文对称序列 内部切割 产生的末端相同且互补2 产生非对称突出末端切割序列为非对称序列 产生非对称的突出末端 29 3 平末端切割回文对称序列 产生平末端Hae GG CC 和EcoRV GAT ATC 5 黏末端和3 黏末端 30 4 同裂酶 来源不同 识别相同的序列 1 同序同切酶 识别序列和切割位置都相同Hind 与Hinc 识别切割位点为GTY RACHpa 与Hap 识别切割位点为C CGGMob 与Sau3A 识别切割位点为 GATC有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同 2 同序异切酶 识别序列相同 切割位置不同Kpn GGTAC CAcc65 G GTACCAsp718 G GTACC 31 5 同尾酶 来源不同 识别序列不同 但产生黏末端相同 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5 BamH 5 TGATCA 3 3 ACTAGT 5 Bcl 5 AGATCT 3 3 TCTAGA 5 Bgl 产生相同的5 GATC粘性末端 用途 32 杂种位点 hybridsite 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别 BamH GGATCCBcl TGATCACCTAGGACTAGT杂种位点 GATCC BamH CTAGT Bcl 33 四 DNA末端长度对限制酶切割的影响 限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求 也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸 否则限制酶将难以发挥切割活性 酶的单位一个单位酶指在建议使用的缓冲液及温度下 在20 l反应液中反应1h 使1 gDNA完全消化所需的酶量 34 靠近DNA末端的切割效率 在设计PCR引物时 如果要在末端引入一个酶切位点 为保证能够顺利切割扩增的PCR产物 应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目 另外 了解末端长度对切割的影响还可帮助在双酶切多克隆位点时选择酶切秩序 35 五 位点偏爱 某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割 即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏感性是不同EcoR 5个位点 并不是随机切割 靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍Sac 三个在中央 一个在右臂 对中央三个位点的酶切速度快50倍 36 六 酶切反应条件 1 缓冲液常规缓冲液一般包括提供稳定pH值的缓冲剂 Mg DTT 二硫苏糖醇 以及BSA 小牛血请白蛋白 2 反应温度大多数为37 一部分为50 65 少数25 30 高温作用酶在37 下的活性会下降 多数仅为最适条件下的10 50 37 3 反应时间反应时间通常为1小时或更多 许多酶延长反应时间可减少酶的用量EcoR 若反应16小时 所需酶量为正常酶切时间的1 8Hind 为1 8 Kpn 为1 4 BamH 为1 2 38 4 终止酶切的方法EDTA可鏊合镁离子 从而可终止酶切反应 终止浓度为10mM加热是常用的方法 对于最佳反应温度为37 的酶 在65 或80 处理20分钟可使酶活性大部分丧失但是对于在80 作用20分钟也有不失活的酶 如Bg1 Hpa 和Pvu Tth111 和TspR 以及Bc1 可用苯酚抽提去除蛋白 或用试剂盒纯化DNA 39 40 七 星星活性 星星活性是限制性内切酶的一般性质 任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点限制酶的特异性变化方式与酶的种类和所用的条件有关 最普遍的活性变化来自1个碱基的变化 识别位点外层碱基的随意性 以及单链缺口抑制星星活性的措施 减少酶的用量 可避免过份酶切 减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇提高离子强度到100 150mM 前提 保证酶活 降低反应pH至pH7 0 以及保证使用Mg2 作为二价阳离子 41 二 连接酶 Ligase 1 T4DNA连接酶 T4DNAligase T4DNA连接酶的分子量为68kDa 催化DNA5 磷酸基与3 羟基之间形成磷酸二酯键 反应底物为粘端 切口 平端的RNA 但效率低 或DNA 低浓度的聚乙二醇PEG 一般为10 和单价阳离子 150 200mMNaCl 可以提高平端连接速率 连接反应条件需要ATP 若在16 反应 大约需4小时 若在4 反应 则需反应过夜 42 2 E coliDNA连接酶 E coliDNAligase 与T4DNAligase活性相似 但需烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸 NAD 参与 且其平端连接效率低 常用于置换合成法合成cDNA作cDNA克隆时 不会将RNA连接到DNA 不连接RNA 可用于OkayamaandBerg法克隆cDNA 43 3 TaqDNA连接酶TaqDNA连接酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应 同时必须与另一DNA链形成杂交体 相当于连接dsDNA中的缺口 作用在45 65 需NAD 可用于检测等位基因的变化以及在PCR扩增中引入寡核苷酸 它不可替代T4DNAligase 44 三 DNA聚合酶 一 大肠杆菌DNA聚合酶 1 E coliDNA聚合酶 的活性E coliDNA聚合酶 为单链多肽 109kDa 有三种活性 5 3 DNA聚合酶活性 反应底物为单链DNA及引物 带3 OH基 或5 突出的双链DNA 45 5 3 外切核酸酶活性 反应底物是双链DNA或DNA RNA杂交体 它可从5 端降解双链DNA 也降解RNA DNA中的RNA RNaseH活性 46 3 5 外切酶活性 反应底物是带3 OH的双链DNA或单链DNA 其活性从3 OH端降解DNA 可被5 3 聚合活性封闭 也可被带5 磷酸的dNMP所抑制 47 2 E coliDNA聚合酶 的用途 利用E coliDNA聚合酶 的5 3 外切核酸酶活性 可用切口平移法 nicktranslation 标记DNA 所有DNA聚合酶中只有此酶有此反应 48 用于cDNA克隆中的第二链 即单纯的DNA聚合活性 但由于具有5 3 外切活性 现在已不再使用 而改用Klenow酶和反转录酶 对3 突出端的DNA作末端标记 交换或置换反应 但是此反应用T4或T7DNA聚合酶效果会更好 49 二 KlenowDNA聚合酶 KlenowDNA聚合酶是E coliDNApolymerase 经蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 裂解而从全酶中除去5 3 外切活性的肽段后的大片段肽段 而聚合活性和3 5 外切活性不受影响 也称为Klenow片段 Klenowfragment 50 补平3