选修三基因工程的基本操作程序讲用PPT课件.ppt

基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 有了目的基因 我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并可进行遗传 表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达 才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达 1 一 目的基因的获取 一 目的基因主要是 编码蛋白质的基因 请举出三个以上的例子 二 获取目的基因的常用方法有哪些 1 从基因文库中获取 2 利用PCR技术扩增 3 人工合成 请阅读P8 9第一和二两段 2 一 目的基因的获取 一 从基因文库中直接获取 1 基因文库 概念见P9 2 基因文库的分类 按外源DNA片段的来源分类 种类 基因组DNA文库 含有一种生物的全部基因 部分基因文库 只包含了一种生物的部分基因 如 cDNA文库 3 基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下 便于获得所需的目的基因 4 获取目的基因的根据 见课本P9 3 5 基因文库的构建方法之一 1 直接分离法 鸟枪法 提取某生物全部DNA 用适当限制酶切割 许多DNA片段 与载体连接导入受体菌群 该生物基因组文库 4 反转录法 cDNA的合成流程图解 5 基因文库的构建方法之 mRNA 与载体连接导入受体菌群 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA cDNA 该生物cDNA文库 5 基因组文库和部分基因组文库 cDNA文库 比较 6 1 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因因为整个过程是在体外进行 所以又叫做体外DNA扩增技术 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 2 原理 DNA复制 二 利用PCR技术扩增目的基因 7 四种脱氧核苷酸 dNTP 一对引物 热稳定DNA聚合酶 Taq酶 模板DNA 需含有目的基因 Mg2 激活剂 3 条件 缓冲溶液 一对寡核苷酸序列 与目的基因的起始段互补 一段已知目的基因的核苷酸序列 以便根据这一序列合成引物 4 前提 8 变性 1 变性 90 95度 目的基因DNA受热变性 解链为单链 2 复性 55 60 引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合 3 延伸 70 75 在DNA聚合酶 Taq酶 作用下 从5 端 3 端进行延伸 5 扩增过程 9 2 具体过程 10 PCR 多聚酶链式反应 11 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 条件 等 原理 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 结果 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 前提条件 12 过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性55 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 13 PCR技术扩增与DNA复制的比较 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板 能量 酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 14 目的基因的mRNA 单链DNA cDNA 双链DNA 即目的基因 反转录 合成 1 反转录法 以目的基因转录成的信使RNA为模板 反转录成互补的单链DNA 然后在酶的作用下合成双链DNA 从而获得所需的基因 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 2 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 3 人工合成的目的基因 15 1 用一定的 切割质粒 使其出现一个切口 露出 2 用 切断目的基因 使其产生 核心 3 将切下的目的基因片段插入质粒的 处 再加入适量 形成了一个重组DNA分子 重组质粒 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 二 基因表达载体的构建 16 基因表达载体的构建 核心 质粒 DNA分子 一个切口两个黏性末端 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种限制酶 目的基因与运载体的结合过程 实际上是不同来源的基因重组的过程 17 科学家在培育抗虫棉时 经过了许多复杂的过程和不懈的努力 才获得成功 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中 然后导入棉花的受精卵中 结果抗虫基因在棉花体内没有表达 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子 抗虫基因首端 导入棉花受精卵 长成的棉花植株还是没有抗虫能力 科学家又在有启动子 抗虫基因的质粒中插入终止子 抗虫基因末端 导入棉花受精卵 结果成长的植株 有了抗虫能力 资料 18 2 基因表达载体的组成 复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因 它们各自的作用是什么 19 启动子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片断 它是RNA聚合酶识别和结合的部位 有了它才能驱动基因转录出mRNA 最终获得蛋白质终止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断 能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将有目的基因的细胞筛选出来 20 载体与表达载体的区别 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段 表达载体在载体基础上增加了目的基因 启动子 终止子三部分结构 用到的工具酶 既用到限制酶切割载体 又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接 两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子 终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞 必需以表达载体的方式携带进去 注意 21 2019 12 30 22 三 将目的基因导入受体细胞 一 转化 二 方法 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 23 1 将目的基因导入植物细胞的方法 1 农杆菌转化法 农杆菌特点 易感染双子叶植物和裸子植物 对大多数单子叶植物没有感染能力 原理 Ti质粒上的T DNA可以转移到受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 24 过程 优点 25 2 基因枪法 3 花粉管通道法 26 2 将目的基因导入动物细胞 方法 显微注射法 程序 目的基因表达载体提纯取卵 受精卵 显微注射受精卵新性状动物 27 3 将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点 繁殖快 单细胞 遗传物质少 方法 用Ca2 处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子 28 四 目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 29 一 检测 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 关键步骤 首先取出转基因生物的基因组DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记 以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交 若显示出杂交带 表明染色体已插入染色体DNA中 1 方法 DNA分子杂交 2 过程 15N 15N 14N 14N 探针 转基因生物的DNA 变性 变性 30 归纳步骤 31 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段 将两种生物的DNA分子的单链放在一起 如果这两个单链具有互补的碱基序列 那么 互补的碱基序列就会结合在一起 形成杂合双链区 在没有互补碱基序列的部位 仍然是两条游离的单链 P15思考与探究 32 二 鉴定 个体生物学水平 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 分子杂交 方法 抗原抗体杂交 过程 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交 若出现杂交带 表明目的基因转录出了mRNA 33 综上 目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 分子水平检测 个体水平鉴定 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 方法 方法 DNA分子杂交 分子杂交 注意与上不同之处 抗原抗体杂交 34 小结 基因工程的基本操作程序 获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因 启动子 终止子 标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法 显微注射法目的基因的检测与鉴定检测 是否插入 转录 翻译鉴定 35 练习1 2008理综山东卷 为扩大可耕地面积 增加粮食产量 黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注 我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系 1 获得耐盐基因后 构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处 DNA连接酶作用于处 填 a 或 b a a 36 练习2 2008理综山东卷 为扩大可耕地面积 增加粮食产量 黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注 我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系 2 将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法 3 由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术 该技术的核心是和 4 为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功 既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测 又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性 基因枪法 花粉管通道法 植物组织培养 脱分化和再分化 耐盐基因 一定浓度盐水浇灌 37 2 动植物细胞除去内含子 38 06年江苏卷 基因工程又叫基因拼接技术 1 在该技术中 用人工合成方法获得目的基因的途径之一是 以目的基因转录的 为模板 成互补的单链DNA 然后在酶的作用下合成 2 基因工程中常用的受体细胞有细菌 真菌 若将真核基因在原核细胞中表达 对该目的基因的基本要求是 3 假设以大肠杆菌质粒作为运载体 并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因 将切割后的运载体与目的基因片段混合 并加入DNA连接酶 连接产物至少有 种环状DNA分子 它们分别是 信使RNA 逆转录 动植物细胞 除去内含子 3 运载体自连的 目的基因片段自连 运载体与目的基因片段相连的环状DNA分子 双链DNA 目的基因 39 知识点一 1 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 启动子 位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列 没有启动子 基因就不能转录 终止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断 它能阻碍RNA聚合酶的移动 并使其从DNA模板链上脱离下来 使转录终止 RNA聚合酶 能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质 以模板转录然后脱落 40 不能转录为信使RNA 不能编码蛋白质 能转录